全 文 ： 2008年第 1期
辽 宁 林 业 科 技
Journal of Liaoning Forestry Science &Technology 2008№1
重瓣大岩桐叶片离体培养高频植株
再生体系的建立①
朴日子 ,曹后男 ,宗成文 ,陈 蕾 ,庄得风
(延边大学 农学院 ,吉林 龙井 133400)
摘 要:以重瓣大岩桐叶片为外植体进行离体培养再生体系研究 。结果表明:以新展开的嫩叶为外
植体最好 ,芽分化率达 96.67%;叶片通过脱分化和再分化直接产生不定芽。6-BA和 NAA 适宜的
配比均可促进芽的诱导和增殖 , IBA有利于根的生长;MS+6-BA 2.0mg L +NAA 0.2 mg L 培养基
最适合芽的诱导 ,诱导率达 96.55%;增殖培养以带芽愈伤团效果较好 ,在 MS+6-BA 2.0mg L +
NAA 0.2 mg L +LH 500 mg L培养基中 ,增殖系数达 18。在 1 4MS+IBA 0.5mg L培养基中生根率
高达 100%。炼苗移栽成活率达 92%。
关键词:重瓣大岩桐;叶片离体培养;高频植株;再生体系;培养基
中图分类号:S722.37 文献标识码:A 文章编号:1001-1714(2008)01-0010-04
Establishment of High Frequency Plant Regeneration Systems
for Leaves in Vitro of Sinningia speciosa
PIAO Ri-zi , CAO Hou-nan , ZONG Cheng-wen , CHEN Lei , ZHUANG De-feng
(College of Agriculture , Yanbian University , Longjing 133400 , China)
Abstract:Studied on regeneration systems in vitro were conducted by taking the leaves of Sinningia speciosa as the explants.The
results showed that the best explants were new expanding leaves , the differentiation rates of buds was 96.67%, and the leaves
were directly induced into adventitious buds through dedifferentiation and re-differentiation.The suitable combination of 6-BA
and NAA could promote the induction and propagation of buds and IBA was conducive to growth of root.Medium MS+6-BA
2.0mg L+NAA 0.2mg L was most suitable for the induction of buds , the induction rates attained 96.55%.The effects of multi-
plication culture of callus colony with buds of explants were better than single-stem buds , and propagation coefficient was 18 in
medium MS+6-BA 2.0mg L+NAA 0.2mg L+LH 500mg L.The rooting rates attained 100% in medium 1 4MS+IBA0.5mg
L.The survival rates of transplants after domestication attained 92%.
Key words:Sinningia speciosa;leaf in vitro;high frequency plant;regeneration system;medium
重瓣大岩桐(Sinningia speciosa)又名巴西芙蓉 ,
是苦苣苔科大岩桐属多年生肉质草本植物 ,原产巴
西 ,现在世界各地广泛栽植。株高 20 ～ 30cm ,花径
10 ～ 12cm ,叶长椭圆形 ,密生白色绒毛 ,叶茂翠绿 ,花
朵姹紫嫣红[ 1] ,具 4轮波状花瓣 ,花大而十分艳丽 ,
春末至秋初开花 ,是著名的室内盆花[ 1] 。近年来 ,我
国引进许多杂交新品种 ,但重瓣品种不接种子[ 2] 。
采用常规无性繁殖法—叶插育苗或球根切块育苗 ,
产量低 ,种苗不整齐 ,占地面积较大 ,受季节限制 ,不
能满足商品化生产的需要。随着生物技术在园艺植
物上的发展应用 ,组织培养技术在生产中得到广泛
应用 。因此 ,组织培养是目前重瓣大岩桐优良种苗
生产的主要途径和有效方法 。关于重瓣大岩桐叶片
离体培养研究虽有报道 ,但诱导效率不高 ,研究结果
在指标上差异很大 ,如参数变幅大 、基本培养基浓度
不同等。本试验以重瓣大岩桐叶片为外植体 ,研究
几种植物生长调节剂不同浓度及组合等对胚状体发
生 、叶片产生不定芽 、芽苗增殖及生根诱导和炼苗移
—10—
① 收稿日期:2007-07-17
基金项目:国家自然科学基金(30560091)
栽的影响 ,建立重瓣大岩桐叶片离体培养高频植株
再生体系 ,为实现低成本工厂化优良种苗生产以及
通过叶盘法开展基因转化奠定基础 。
1 材料与方法
试材为延边大学农学院植物育种实验室内盆栽
巨早系列紫花重瓣大岩桐 。选择旺盛生长植株上的
叶片为外植体。基本培养基为 MS ,添加 7.0 g L琼
脂 ,30 g L蔗糖 ,pH 值 5.8 ～ 6.0。叶片经常规消毒
后 ,在超净工作台上剪成约 1cm2 见方 ,接种于不同
分化培养基上(见表 1),每瓶接种 3块 ,叶片正面向
上。接种后1 ～ 7d置于 23℃下暗培养 ,第 8天转到
光下培养 。20d后观察不定芽形成动态。30d后调
查外植体的再生频率及芽分化情况 。将分化出的带
芽愈伤团或单芽接种于增殖培养基上培养 , 35d后
调查有效芽苗(高>0.5cm)的生长情况 。将 2 ～ 3cm
高的芽苗由芽丛单个切下 ,转入生根培养基上培养 ,
21d后调查生根情况。当试管苗有 2 ～ 3 条 2.0cm
以上的根系时开始炼苗 , 25d后调查炼苗 、移栽成活
率。培养室温度为(25±2)℃,光强约 2 500lx ,光照
时间 14h d。
2 结果与分析
2.1 不定芽形成动态
外植体在分化培养基上培养 15d 左右 ,叶片开
始明显增大卷曲呈筒状 。叶片基部叶柄切口处产生
瘤状突起物 ,接着叶片中脉及中脉附近的切口上也
形成绿色的瘤状突起物 ,且培养基接触部位产生乳
白色基生根。接种后 20d左右 ,从瘤状突起物中分
化出绿色小芽 ,进而产生大量不定芽。
2.2 6-BA对叶片再生及芽分化的影响
不同浓度 6-BA 对叶片再生频率及芽分化存
在显著差异 ,见表 1。与其他处理相比 ,再生频率和
芽分化率以 3 、4处理差异显著。而不定芽 ,4 处理
与其他处理间差异显著 ,而 3与 5 、5 与 6 、6与 1之
间无差异 。综合分析 ,培养基 MS+6-BA 2.0 mg L
+NAA 0.2 mg L最优 ,再生频率最高 96.67%,芽分
化率 96.55%,叶片平均再生不定芽 5.04个 ,且长势
良好 。
表 1 6-BA对重瓣大岩桐叶片再生及芽分化的影响
处 理 外植体数(个) 再生频率(%) 芽分化率(%) 平均再生不定芽数(个)
1.MS+6-BA 0.5 mg L +NAA 0.2 mg L 30 60.00 c 50.00 c 1.80 d
2.MS+6-BA 1.0 mg L +NAA 0.2 mg L 30 70.00 bc 61.91 bc 2.80 c
3.MS+6-BA 1.5mg L+NAA 0.2 mg L 30 100.00 a 83.33 a 3.60 b
4.MS+6-BA 2.0mg L+NAA 0.2 mg L 30 96.67 a 96.55 a 5.04 a
5.MS+6-BA 2.5mg L+NAA 0.2 mg L 30 80.00 b 70.83 b 2.90 bc
6.MS+6-BA 3.0mg L+NAA 0.2 mg L 30 66.67 bc 65.00 bc 2.40 cd
注:小写字母表示显著性水平(p<0.05)
2.3 叶龄对芽分化的影响
以顶端1 ～ 2节新展开的嫩叶和 4 ～ 5节完全展
开的老叶为外植体 ,分别接种于MS +6-BA 2.0mg
L+NAA 0.2 mg L分化培养基上培养 。
表 2 叶龄对叶片外植体芽分化的影响
叶 龄 接种外植体数(个) 不定芽萌发时间(d) 芽分化率(%) 平均再生不定芽数(个)
新展开叶 30 17 96.67 6.50
完全展开老叶 33 20 54.55 1.83
由表 2可见 ,新展开的叶在不定芽萌发时间 、芽
分化率和芽的数量上明显优于完全展开的老叶。嫩
叶产生的胚状体嫩绿致密 ,芽点多 ,平均有 6个以上
有效芽苗 ,分化率达 96.67%。而完全展开的老叶
产生的胚状体色泽较浅 ,结构较疏松 ,虽体积较大 ,
但芽点少 ,平均有 1个左右有效芽苗 ,芽分化率只有
54.55%。说明发育早期的幼嫩叶片生理代谢活跃 ,
易受外界因子(如外源激素)影响而分化能力高[ 3] 。
因此 ,顶端 1 ～ 2节新展开的嫩叶是重瓣大岩桐叶片
离体培养再生体系的最适外植体。
2.4 细胞分裂素对继代增殖生长的影响
增殖阶段的基本培养基 MS+NAA 0.2 mg L +
LH(水解乳蛋白)500mg L , 添加不同浓度(1 mg L 、
1.5mg L 、2 mg L、2.5 mg L 、3 mg L)的细胞分裂素
(6-BA 、KT 、TDZ)。细胞分裂素种类及浓度对试管
苗继代增殖生长有显著的影响 ,见图 1。
—11—
第 1 期 朴日子等:重瓣大岩桐叶片离体培养高频植株再生体系的建立 2008年
图 1 细胞分裂素及浓度对重瓣大岩桐增殖生长的影响
3种细胞分裂素均能诱导不定芽增殖 ,但效果
有明显差异 。不论是芽增殖 ,还是芽苗生长状态 ,
6-BA均优于 KT 和 TDZ 处理。6-BA处理有效芽
最多 ,芽生长最健壮 ,且叶片深绿而厚大 ,适宜诱导
生根。随着6-BA浓度增大增殖系数也增大。当
6-BA为 2.0 mg L 时 ,增殖系数最大 18 ,平均株高
3.32cm;当6-BA浓度大于 2.0 mg L 时 ,增殖系数和
平均株高呈下降趋势 。KT 对芽苗的株高优于
6-BA和TDZ 处理 ,当 KT为 1.5 mg L时 ,株高最高
达3.80cm ,但增殖效果不如 6-BA 处理。TDZ 为
1.0 ～ 3.0 mg L 时 ,对继代增殖生长效果最差 ,虽然
芽点很多 ,但有效芽苗少 ,黄红色 ,叶非常小 ,长势不
好。这可能是激素组合配比不当或 TDZ 浓度太高
不适合芽的分化生长 。
在继代增殖培养时 ,以带芽愈伤团和分割的单
茎芽为外植体 ,分别接种于MS+6-BA 2.0 mg L +
NAA 0.2 mg L +LH 500 mg L 培养基上 ,35d后观察
增殖总数 。两者分别占 70%、30%,平均增殖系数
为18 、9 ,且生长状况差异不大。所以在继代增殖培
养时宜采用带芽愈伤团。
综上分析 ,重瓣大岩桐增殖培养以带芽愈伤团
较好 ,试管苗最优增殖培养基为MS+6-BA 2.0mg
L+NAA 0.2 mg L +LH 500 mg L 。
2.5 生长素种类及浓度对试管苗生根的影响
图 2 生长素对重瓣大岩桐试管苗生根及根系生长的影响
从图 2可看出 ,当 IBA和NAA在 0.1 ～ 1.0mg L
时 ,不论从生根效果 ,还是根系生长状况来看 , IBA
都明显优于NAA。当 IBA为 0.5 mg L 时 ,生根效果
最佳 ,生根率达 100%,平均根长达 4.21cm ,有 6条
以上侧根 ,且生长健壮。NAA处理也均生根 ,但根
系生长及长势不如 IBA处理 。
2.6 无机盐对试管苗生根的影响
表 3 不同无机盐浓度对重瓣大岩桐生根的影响
无机盐浓度
(mg L)
调查数
(株)
开始生根天数
(d)
生根率
(%)
平均根条数
(条)
平均根长
(cm)
1 2MS 30 9 96.67 5.82 3.21
1 3MS 30 10 93.33 5.96 3.03
1 4MS 30 8 100.00 7.13 4.05
表3表明 ,降低无机盐浓度有利于生根 ,且根多
粗壮 ,最早第 8天开始生根 。当无机盐浓度为1 4MS
时 ,生根率高达 100%,平均根长 4.05cm ,有 7 条以
上侧根。这可能是重瓣大岩桐组培苗生根对无机盐
浓度要求不高或继代培养过程中积累了植物生长调
节剂的原因[ 4] 。可见重瓣大岩桐最佳生根培养基为
1 4MS+IBA 0.5 mg L 。
2.7 炼苗与移栽
试管苗开瓶后自然光下炼苗 1d 。异氧锻炼后 ,
从培养瓶内轻轻取出 ,用自来水冲去根上附着的培
养基 ,然后栽于消毒的河沙育苗盘中炼苗。初期浇
透水 ,并用薄膜覆盖 ,温度控制在 22℃左右 ,5d后逐
渐通风炼苗 , 10d后浇 1次 1 2MS 营养液 ,15d 后长
出新根成活 ,成活率达 92%,然后定(下转第 15页)
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第 1 期 辽 宁 林 业 科 技 2008年
很少 ,因此冷藏环境保持一定的湿度是非常必要的 , 这与郭蕊[ 4] 等人的研究结果一致 。
表 1 冷藏期间两品种同一部位含水量变化情况
取样
时间
(周)
含水量(%)
鳞 茎
索蚌 西伯利亚
外层鳞片
索蚌 西伯利亚
内层鳞片
索蚌 西伯利亚
芽
索蚌 西伯利亚
基 盘
索蚌 西伯利亚
根
索蚌 西伯利亚
0 72.8 73.5 85.0 77.7 68.5 72.0 81.0 82.7 79.5 80.1 92.0 90.2
1 70.7 71.5 82.1 72.4 65.8 70.5 80.4 80.6 78.7 79.3 88.5 87.7
2 69.4 69.0 78.9 72.4 64.2 70.4 80.0 80.5 78.6 78.6 87.9 87.3
3 68.5 67.8 75.8 72.3 64.0 69.1 80.0 80.1 78.6 78.5 87.7 86.9
4 68.1 66.9 75.4 72.0 63.4 68.0 79.8 79.5 78.4 78.4 87.3 86.8
5 65.1 66.8 74.1 71.9 63.3 67.0 79.3 78.8 78.4 78.4 87.2 86.3
6 64.4 66.6 73.4 71.3 62.8 66.5 78.7 78.0 78.2 78.2 87.1 86.3
7 63.6 65.6 72.3 71.1 62.5 65.7 78.3 77.3 77.9 78.1 87.1 86.0
8 63.6 65.5 72.1 70.9 62.3 65.3 77.8 77.2 77.5 78.1 86.8 85.8
9 63.5 65.5 71.7 70.7 62.2 64.9 77.7 77.1 77.3 78.0 85.6 84.5
10 63.0 65.4 71.1 70.4 61.9 64.5 76.9 76.8 77.3 77.9 84.4 83.2
11 62.0 64.8 70.5 70.1 61.8 64.0 76.2 76.4 77.0 77.8 82.0 82.6
12 61.0 64.7 70.3 69.8 61.7 63.8 76.0 75.9 76.9 77.6 80.0 80.5
13 60.1 64.6 68.6 69.4 61.6 63.2 75.8 75.7 76.9 77.4 79.0 78.3
14 59.1 63.6 67.9 69.0 61.5 62.5 75.6 75.6 76.7 77.0 78.0 77.5
15 56.3 62.9 67.7 67.4 61.2 61.8 74.9 74.7 76.5 76.9 77.0 76.2
16 55.4 62.4 67.0 67.0 58.5 61.8 74.8 74.3 76.1 76.7 75.0 75.2
17 54.0 61.7 65.9 63.8 54.6 61.2 74.4 72.6 76.0 76.5 74.5 74.9
18 53.5 60.3 63.4 63.6 50.0 61.2 74.0 71.9 75.5 76.3 72.0 74.8
19 52.0 59.4 62.3 60.9 47.4 60.0 73.9 71.5 75.0 76.2 70.0 72.5
冷藏期间两品种不同部位含水量变化情况基本
一致 ,变化最大的是外层鳞片和根 ,鳞茎和内层鳞片
次之 ,芽和基盘变化最小 ,原因是外层鳞片和根直接
与外界环境接触导致水分散失较大 。
冷藏期间不同品种同一部位含水量变化有所不
同 ,除芽外索蚌其余各部位的含水量变化幅度都比
西伯利亚大 ,这与两品种鳞茎自身特性有关。
参 考 文 献:
[ 1] 包满珠.花卉学[ M] .北京:中国农业出版社 , 2005.
[ 2] 郭志刚 ,张伟.球根类[ M] .北京:中国林业出版社 , 2001.
51-108.
[ 3] 彦龙.兰州百合生长发育特性观察[ J] .甘肃农业科技 ,
1986 ,(10):2-5.
[ 4] 郭蕊 ,赵祥云 , 王文和 , 等.百合花芽分化的形态学观察
[ J] .沈阳农业大学学报 , 2006 , 37(1):31-34.
(责任编辑:张素清)
(上接第 12 页)植于河沙∶营养土=1∶2的花盆中 ,
10d后移栽成活率达 95%以上 ,精心管理 3 个月后
即能开花 。
3 结论与讨论
3.1 重瓣大岩桐嫩叶是离体培养快速繁殖的优良
外植体。嫩叶除有取材方便 、易消毒等优点外 ,可直
接产生不定芽 ,缩短愈伤组织的诱导期 ,减少一个培
养阶段 ,降低种苗生产成本。
3.2 继代增殖培养时 ,带芽愈伤团比单茎芽增殖效
果好 。说明内源生长调节剂积累量影响芽诱导的效
果 ,这与祝清俊[ 5]等人研究结果相似。所以 ,带芽愈
伤团是增殖培养最适合的外植体。
3.3 以往报道的重瓣大岩桐组织培养中 ,生根培养
时基本培养基多采用 1 2MS或 MS 。而本试验在无
机盐浓度降低到 1 4的情况下 ,也获得了 100%生根
率 ,根多且粗壮 ,有利于种苗的工厂化生产 ,降低成
本。
3.4 在重瓣大岩桐叶片离体培养快速繁殖过程中 ,
6-BA和 NAA均可促进芽的诱导和增殖 , IBA 有利
于根的生长 。MS+6-BA 2.0 mg L +NAA 0.2mg L
为最适不定芽诱导培养基 ,MS+6-BA 2.0 mg L +
NAA 0.2 mg L +LH 500 mg L 为最佳增殖培养基 ,
1 4MS+IBA 0.5 mg L为最佳生根培养基。
参 考 文 献:
[ 1] 许晓静 , 董树春 , 王万相 , 等.重瓣大岩桐茎尖培养与快
速繁殖[ J] .中国林副特产 , 2004 , (1):29.
[ 2] 王福银.重瓣大岩桐快速繁殖试验[ J] .江苏林业科技 ,
2000 , 27(4):26-28 , 45.
[ 3] 王清连.植物组织培养[ M] .北京:中国农业出版社 ,
2002.7 , 53-55.
[ 4] 曹孜义 ,刘国敏.实用植物组织培养技术教程[ M] .兰州:
甘肃科学技术出版社 , 1999.58.
[ 5] 祝清俊 ,周钟信 , 张宗.大岩桐组织培养和快速繁殖[ J] .
莱阳农学院学报 , 1995 ,(1):47-49.
(责任编辑:张素清)
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第 1期 孙晓梅等:东方百合鳞茎冷藏期间含水量变化规律的研究 2008 年