全 文 ：世界科学技术—中医药现代化★专题讨论：中药资源与鉴定
〔World Science and Technology/Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica〕
收稿日期：2014-11-05
修回日期：2014-11-15
＊ 国家自然科学基金委面上项目（31170335）：大叶蛇葡萄降压药效作用的物质机制及蛋白表达研究，负责人：张秀桥；湖北省自然科学基金
委重点项目（2014CFA083）：基于转录组学的大叶蛇葡萄活性成分生物合成分子机制研究，负责人：张秀桥。
＊＊ 通讯作者：张秀桥，教授，博士生导师，主要研究方向：中药的品种、质量及资源开发研究。
大叶蛇葡萄蛋白质组双向电泳分析＊
黄 静，桂 春，答国政，夏 叶，程佩佩，张秀桥＊＊
（湖北中医药大学药学院 武汉 430065）
摘 要：目的：利用双向电泳法研究大叶蛇葡萄活性成分蛋白表达。方法：采用 Tris 饱和酚提取和醋
酸铵甲醇沉淀大叶蛇葡萄嫩叶中的蛋白质；运用双向电泳法分离蛋白质，并对扫描后的二维凝胶电泳图
谱进行分析，得到蛋白质表征图谱。结果：根据各个样品间蛋白点灰度值的比值差异，选择了差异较大的
7 个蛋白点进行质谱鉴定，鉴定了其中两种蛋白，分别为 Hypothetical Protein 和 Unnamed Protein Product。
结论：双向电泳技术的应用为从分子水平研究大叶蛇葡萄活性成分蛋白表达奠定了良好的基础。
关键词：大叶蛇葡萄 蛋白质组 蛋白质提取 双向电泳
doi: 10.11842/wst.2014.11.016 中图分类号：R284.1 文献标识码：A
双向电泳技术是目前蛋白质组学 [1]研究的关键
技术，包括蛋白质的提取、等电聚焦 Isoelectrofocus－
ing，IEF）、SDS-PAGE 和凝胶染色等步骤。自 1975
年 P.H.O’Farrell 建立该技术以来，第一向已从载体
两性电解质 pH 梯度（Carrier Ampholyte pH Gradi－
ent）等电聚焦发展到固相 pH 梯度（Immobilized pH
Gradient，IPG）等电聚焦，使得双向电泳技术的分辨
率和重复性得到了很大提高 [2]。
第一向运用等电聚焦水平电泳仪通过电荷分
离蛋白质，第二向运用 SDS-PAGE 聚丙烯酰胺凝胶
垂直电泳通过质量分离蛋白质 [3]，这一技术在生物
蛋白质研究中得到了广泛的应用，目前已成为分离
蛋白的有效手段 [4-6]。其在微生物和动物蛋白质 [7]研
究方面的应用较多，但在植物特别是药用植物蛋白
的研究方面应用的相对较少。
大叶蛇葡萄（Ampelopsis megalophylla Diels et.
Gilg）为葡萄科蛇葡萄属植物，即霉茶原植物，其叶
和嫩茎经加工成为湖北西部地区习用的中草药霉
茶 [8]。性平，味酸、涩。具有清热利湿、活血化淤之功
效，用于痢疾、泄泻、小便淋痛、头昏目胀、高血压、
高血糖血脂等治疗 [9-12]。目前尚未见关于大叶蛇葡
萄通过双向电泳研究活性成分蛋白表达的报道。本
文在前期大叶蛇葡萄活性成分研究的基础上，建立
了大叶蛇葡萄嫩叶中蛋白质提取、纯化方法，并采
用双向电泳和 MALDI-TOF-MS 技术 [13]，初步对蛋
白差异进行分析，为进一步研究大叶蛇葡萄活性成
分蛋白表达奠定了一定基础。
1 材料和方法
1.1 实验材料
大叶蛇葡萄样品（共 3 批）分别采集于湖北省
恩施土家族苗族自治州来凤县，经湖北中医药大学
药学院生药教研室张秀桥教授鉴定为 Ampelopsis
megalophylla Diels et．Gilg 的嫩叶。
1.2 仪器及试剂
GE ETTAN IPGPHOR3 等电聚焦电泳仪（美国
通用公司）；UMAX Powerlook1100 扫描仪（上海中晶
科技有限公司）；（Bruker Dalton）Autoflex speedTM
MALDI-TOF-TOF 质谱仪（德国布鲁克公司）。
3-[3-（胆酰胺丙基） 二甲氨基 ] 丙磺酸内盐
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（CHAPS，Usb 公司）；再化水液 RB（上海生工生物工
程有限公司）；十二烷基硫酸钠（SDS，普洛麦格
Promega 公司）；交联聚乙烯吡咯烷酮（交联聚维酮，
PVPP，加拿大 Bio Basic Inc. 公司）；二硫苏糖醇
（DTT，美国 Amresco 公司）；干胶条（24 cm，pH4.0-
7.0，美国通用公司）；碘乙酰胺（IAA，美国伯乐
BIORAD 公司）；Tris 饱和酚（pH7.8-8.0，分析纯，天
津大茂化学试剂厂）；无水乙酸钠、硫代硫酸钠、硝
酸银、甲醛、碳酸钠、乙二胺四乙酸二钠盐（分析纯，
天津大茂化学试剂厂）。
1.3 溶液的配制
蛋白质提取液：0.7 mol·L-1 蔗糖、0.1 mol·L -1
KCl、50 mmol·L -1 EDTA、0.5 mol·L -1 Tris -HCL
（pH7.5），双蒸水定容。醋酸铵甲醇溶液：0.1 mol·L-1
醋酸铵、1％β-巯基乙醇溶于甲醇中。再水化液：7
mol·L -1 尿素、2 mol·L -1 硫脲、4％（w/v）CHAPS、65
mmol·L-1 DTT、0.2％（w/v）两性电解质，双蒸水定容。
平衡缓冲液 SDS：50 mmol·L -1 Tris -HCl（pH8.8）、6
mol·L-1 尿素、30％（v/v） 甘油、2％（w/v）SDS、0.002％
（w/v）溴酚蓝；平衡液 A：使用前向平衡液中加 1%
DTT；平衡液 B：使用前向平衡液中加入 2.5%碘代乙
酰胺。考马斯亮蓝染液 Bradford：0.3 g考马斯亮蓝 G-
250、25 g硫酸铵、25 mL磷酸、50 mL甲醇，双蒸水定
容。银染液的配制：①固定液：100 mL乙醇、25 mL冰
醋酸、0.17 g 无水乙酸钠；②敏化液：75 mL 乙醇、
0.788 g硫代硫酸钠；③银染液：0.625 g硝酸银；④显
色液：6.25 g碳酸钠、100 mL甲醛；⑤终止液：3.65 g
乙二胺四乙酸二钠盐。以上均加双蒸水至 250 mL。
1.4 实验方法
1.4.1 蛋白质的提取与纯化
①将样品倒入经液氮预冷后的研钵中，迅速加入
液氮研磨至粉末状，随后加入约 100 mg的 PVPP，并
转移至 50 mL 离心管中；②在离心管中加入 10 mL
提取液和 10 mL Tris 饱和酚，充分振荡后于冰上保
温，每隔 5 min振荡一次，重复 6次；4℃ 5 000 rpm离
心 30 min，吸取上层酚相，转移至 15 mL 离心管中，
加入与酚相同体积的提取液，重复上一步骤 2 次；
③加入 5 倍体积的醋酸铵甲醇溶液，对蛋白质进行
沉淀，充分振荡后置于冰上保温，每隔 5 min 振荡一
次，重复 6次，-20℃沉淀过夜。④次日 4℃ 5 000 rpm
离心 30 min，弃上清液，加入 5 mL甲醇洗涤，以除去
蛋白质中的色素和盐；吹打均匀后再次离心 30 min，
重复一次；加入 5 mL丙酮洗涤 2 次，最后加入 4 mL
丙酮，吹打均匀后将蛋白质平均分装于 4 支 1.5 mL
的 EP 管中。⑤4℃ 12 000 rpm 离心 20 min，弃上清
液，室温干燥。在干燥后的蛋白质团块中加入 200μL RB，
使其充分分散，超声助溶（80W，0.8 s 开，0.8 s 关，
重复 4 次）后放于冰上冷却，重复一次。再次离心
20 min，上清液即为所需的蛋白溶液；⑥采用改良的
Bradford 法[14]测定蛋白样品的蛋白浓度。
1.4.2 双向电泳
第一向等电聚焦：银染上样量为 120 μg，室温
下取出胶条平衡放置 10 min，沿聚焦盘的槽边缘从
左至右线性加入样品，用镊子轻轻去除预制 IPG 胶
条上的保护层；将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中
样品溶液上层，并除去胶面与样品液之间的气泡；
缓慢加入矿物油，盖上胶条槽盖子，20℃下再水化
10-12 h；其等电聚焦程序如下：快速梯度增加 0-300V
30 min，300-700V 30 min，700-1 500V 1.5 h，然后
线性增加 1 500-9 000V 3 h，最后 9 000V 3 h，总
电压为 52KVh。等电聚焦跑完后，胶条立即用平衡
缓冲液 A 和 B 各平衡 15 min。
第二向 SDS-PAGE：在灌胶模具上灌制 12.5%
SDS 分离胶凝胶，将胶条放到二向胶的胶面处，除
去两者间的气泡，1.5％琼脂糖凝胶密封后开始电
泳；当溴酚蓝跑出二向胶以后即可停止电泳；最后
按常规方法进行银染。
1.4.3 蛋白质图像采集和分析
利用扫描仪进行扫描，图像采用 Image Master
2D platinum 5.0 软件分析。
1.4.4 质谱鉴定
将获得的差异蛋白质进行脱色、酶解得到肽段
混合物后，利用质谱仪进行质谱分析 [15-18]，FlexAnal－
ysis（Bruker Dalton）软件过滤基线峰和识别信号峰，
BioTools（Bruker Dalton）软件搜索 NCBI 数据库，寻
找匹配的相关蛋白质，明确蛋白质及其功能。
2 结果与分析
2.1 蛋白质定量结果
除去非蛋白组分并且浓缩后，得到样品的蛋白
质浓度如表 1 所示。3 个不同地区的样品中提取的
蛋白质总量为 N3>N1>N2。
2.2 双向电泳图谱分析
不同样品蛋白质在相同条件下进行分离，建立
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样品 N1 N2 N3
平均吸光度值 0.62 0.58 0.58
浓度/μg·μL-1 4.52 3.77 3.77
蛋白质总量/μg 1557.56 1470.92 2222.67
注：N1、N2、N3 分别代表样品 1、2、3（下同）。
表 1 蛋白质定量结果
大叶蛇葡萄叶片的双向电泳图谱，搜索最明显和独
特的蛋白质斑点。双向电泳的结果显示不同地区的
3 个样品的大部分蛋白质点都集中在分子量（Mw）
（10-130 kDa）、等电点（PI）（4.0 -7.0）范围内，如
图1 所示，银染法所得结果如图 2 所示。
3 个样品分别平行进行两次双向电泳实验，结
果显示，N1 两次分别检测到 1 953 和 1 920 个蛋白
点，匹配上的斑点数为 1 590 个，匹配率为 82.11%；
N2 两次分别检测到 1 540 和 1 241 个蛋白点，匹配
上的斑点数为 1 016 个，匹配率为 73.07%，N3 两次
分别检测到 1 836 和 1 595 个蛋白点，匹配上的斑
点数为 1 343 个，匹配率为 78.29%。实验表明样品
的分辨率和匹配率均较高，具有良好的稳定性和重
复性。
2.3 已分辨出斑点的分子量和等电点的分布
为更好的分析大叶蛇葡萄叶片中蛋白质的差
异性，我们比较了已分辨出斑点的等电点和分子量
的范围。
等电点分布特征：N1 和 N2 等电点在 5.0-5.5
之间的蛋白质最多，分别占总蛋白含量的 21.38%
和 22.97%，N3 等电点在 5.5-6.0 之间的蛋白质最
多，占总蛋白含量的 22.12%；N1-N3 等电点在 4.0-
4.5 之间的蛋白质最少，分别占总蛋白含量的
9.49%、6.65%、9.63%。除此之外，其余等电点区段
所包含的蛋白质数目差别不大。
分子量分布差异较大：N1-N3 分子量在 15-25
kD 之间的蛋白质最多，分别占总蛋白含量的
20.66%、20.34%、18.76%；N1 -N3 分子量在 130 -
170kD 之间的蛋白质最少，分别占总蛋白含量的
0.83%、0.82%、0.96%。随着区间分子量的增大，所
包含的蛋白质数目有逐渐减少的趋势，见图 1、2。
2.4 蛋白质鉴定
根据前期实验的含量测定结果，N1-N3 中蛇葡
萄素含量高低顺序为 N1> N3> N2，寻找到 3 个样
品中均含有且灰度值的比值与蛇葡萄素含量呈正
相关或者负相关的 7 个蛋白点。进行质谱分析后，
发现呈正相关的蛋白点有 2 个，灰度值大小顺序为
N1>N3>N2，编号分别为 A43（C32）和 A57（C52）；呈
负相关的蛋白点有 5 个，灰度值大小顺序为 N1<
N3
泳扫描图两两进行对比，其中 N1 与 N2 和 N3 对比
后灰度值升高的蛋白点用 A、C 标记，N2 与 N1 和
N3 对比后灰度值升高的蛋白点用 B、E 标记）。经质
谱鉴定了两个蛋白质，分别为 Hypothetical Protein
和 Unnamed Protein Product。
3 结论
影响双向电泳分离效果的关键因素是蛋白样品
的制备，除了蛋白沉淀方法直接决定双向电泳效果
之外，蛋白提取液的组成也是决定双向电泳成功与
否的重要因素。目前国内外常用的蛋白质提取液
（9 mol·L-1尿素、2%-4%CHAPS、1%DTT 和 2%V/V
载体两性电解质）还是基于 O’Farrell 的尿素裂解液
修改而成 [19]。由于蛋白质表达的动态变化很大，并
且不同蛋白质的分子量、等电点和溶解性存在很大
的差异，细胞或组织中蛋白的提取液组成应依据文
献，根据材料的种类、取样部位及发育时期等进行
适当调整。植物组织细胞可以利用物理和化学技术
图 1 大叶蛇葡萄 3个样品双向电泳扫描图
1 953 1 540 1 836
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灰度值比值 A43（C32） A57（C52） B23（E12） B53（E119） B54（E20） B56（E22） B64（E34）
N1∶N2 4.432 35 3.695 82 - - - - -
N1∶N3 2.968 37 3.015 99 - - - - -
N2∶N1 - - 4.183 55 3.099 69 2.434 45 6.570 83 4.120 37
N2∶N3 - - 1.593 48 1.733 91 1.682 97 5.432 24 3.322 09
表 2 7 个蛋白点灰度值比值
图 2 大叶蛇葡萄蛋白等点及总蛋白分子量分布图
注：a.蛋白等点，b.总蛋白分子量。
充分萃取得到，通过低温操作和添加 PVP 除去酚类
物质使蛋白质降解达到最小，其不溶性杂质可通过
离心法去除。本实验通过各种条件的组合和优化，
建立了大叶蛇葡萄嫩叶中蛋白质提取和纯化的方
法；并应用双向电泳和 MALDI-TOF-MS 技术分析
了其嫩叶中蛋白质差异表达；发现已鉴定的差异蛋
白 Hypothetical Protein 具有氧化还原酶活性，可参
与植物体内氧化还原过程。实验结果显示：3 种蛇葡
萄素含量不同的样品，尽管蛋白质含量和双向电泳
图谱存在差异，但其凝胶具有较好的分辨率和重复
率，为进一步研究大叶蛇葡萄活性成分的蛋白表达
奠定了良好的基础。
自 2007 年以来，一些研究者就开始对大叶蛇葡
萄药用植物及其炮制品霉茶展开较系统性的研究，
至今已取得了较丰硕的成果。但是大叶蛇葡萄叶片
植物蛋白质组学研究仍然属于新兴领域，具有广阔
的发展前景。蛇葡萄素是大叶蛇葡萄的主要活性成
分之一，且为降血压活性成分，于是探讨如何建立
大叶蛇葡萄叶片蛋白质组学双向电泳体系，并利用
质谱技术和生物信息学分析技术，鉴定出影响蛇葡
萄素含量差异的蛋白质，有助于揭示主要活性次生
代谢产物形成的分子生物学基础，为今后进一步从
蛋白质技术及基因水平提高其资源品质提供理论
依据。
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Proteome Analysis of Ampelopsis Megalophylla by 2-DE
Huang Jing, Gui Chun, DaGuozheng, Xia Ye, ChengPeipei, ZhangXiuqiao
(School of Pharmaceutical Sciences, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)
Abstract: This study was aimed to investigate active ingredients from Ampelopsis megalophylla of protein expression
by using two -dimensional gel electrophoresis (2 -DE). Methods: isn this study, proteinsfrom the tender leaves of
Ampelopsis megalophylla were precipitated by Tris-phenol extraction and ammonium acetate methanol precipitation.
Then using 2 -DE technology to isolate protein.Finally, 2 -DE was analyzed by the scanner, and got protein
characteristic maps. Result:According to the differences in ratio of gray value, the seven differential protein points
were chosen to identify the mass spectrum. At present, two proteins were identified, namely the hypothetical protein
and the unnamed protein product. Conclusion: the application of 2-DE technology for Ampelopsis megalophyllathe
active ingredient of protein expression at the level of molecular research laid a good foundation.
Keywords: Ampelopsis megalophylla, Proteomics,Protein extraction, 2-DE
（责任编辑：张丰丰 张志华，责任译审：王 瑀）
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