全 文 ：本实验所建立方法可以快速检测葎草中总黄酮与木犀草素
的含量 , 并对不同居群葎草中黄酮类化合物含量进行了比较 ,为
葎草资源的深度开发提供了参考。
参考文献:
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收稿日期:2009-10-17;　修订日期:2010-03-10
基金项目:浙江省中医药管理局资助项目(No.2008CA001)
作者简介:朱振洪(1971-),男(汉族),湖北武穴人 ,现任浙江中医药大学
生物工程学院助理研究员, 在职博士研究生 ,硕士学位 , 主要从事中药分
子遗传学研究工作.
道地药材浙玄参的随机扩增多态性 DNA研究
朱振洪 ,万海同 ,余　勤 ,刘文洪 ,韩　进
(浙江中医药大学生物工程学院 , 浙江 杭州　310053)
摘要:目的 探讨道地药材浙玄参与非道地药材之间遗传变异大小 ,并建立道地药材浙玄参的品质鉴定方法。方法 运用
随机扩增多态性 DNA(RAPD)法对产于浙江 、山东 、湖北的玄参科植物玄参进行了分子标记研究。结果 共筛选出 9条有
效引物 , 获得 142条 DNA带 ,通过聚类分析 , 构建 DNA分子系统树图 ,确定不同居群间的亲缘关系。结论 同种异地药材
所形成的不同居群 , 具有不同的遗传多样性特征。其中浙玄参与山东 、湖北玄参存在较大遗传差异 ,说明浙玄参作为道
地药材 , 具有自身独特的遗传特征。
关键词:道地药材;　玄参;　随机扩增多态性 DNA;　聚类分析
DOI标识:doi:10.3969 /j.issn.1008-0805.2010.08.039
中图分类号:R282.5;R75　　文献标识码:B　　文章编号:1008-0805(2010)08-1936-02
　　玄参别名元参 、黑参 、浙玄参 ,为玄参科植物玄参 Scrophular-
iuningpoensisHemsl.的干燥根 , 具有滋阴降火 、解毒之功效。主
产于浙江 , 另外在山东 、湖北 、四川 、陕西等也有栽培。其中以浙
江产玄参为道地药材 , 为著名的 “浙八味”之一。由于该药材品
种多 、产区广 ,单纯地依赖形态分类 、组织学或化学指纹如高效液
相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)等难以区别 [ 1] 。现代分子生物
学研究表明 , 中药材生物资源的多样性是由于其基因多态性导致
的 [ 2] 。为从基因角度揭示 “道地”药材的生物学本质 , 本文采用
RAPD技术分别对来源于浙江 、山东 、湖北产地的玄参进行遗传
多样性研究 , 旨在为道地药材浙玄参的药材鉴定 、栽培繁育 、质量
评价提供依据。
1　材料与仪器
1.1　供试植物材料 分别采于浙江临安 、湖北恩施 、山东青州等
地。取新鲜健壮嫩叶置液氮罐中 , 带回实验室 -70℃冰箱中保
存。
1.2　DNA提取试剂 提取缓冲液:100 mmol/LTris-HCl
(pH8.0), 50 mmol/LEDTA(pH8.0), 500 mmol/LNaCl, 10
mmol/Lβ -巯基乙醇。 20% SDS, 5 mol/LKAc, 10 mg/ml
RNaseA, 异丙醇 ,灭菌水等。
1.3　PCR试剂 10核苷酸随机引物由上海生工生物工程公司合
成 , 共 70条(序列编号分别为:S1 ～ S40, S71 ～ S90, S111 ～ S120);
DNA聚合酶 、Buffer等为 MBI公司产品。
1.4　仪器 SIGMA3K-15高速冷冻离心机 , PCR仪(Biometra
personal, Germany),琼脂糖电泳仪和凝胶成像系统为上海天能科
技有限公司产品。
2　方法
2.1　基因组 DNA提取方法 采用改良 SDS法提取基因组 [ 3] , 具
体操作如下:取 1 g叶片 ,剪碎后加入适量 PVP, 一起于液氮中研
磨成粉。转移粉末到加有 500 μl提取缓冲液的离心管中 , 轻轻
混匀 , 使粉末充分散开。 加入 50 μl20 %SDS溶液 , 混匀后于
65℃水浴中保温 10 ～ 15 min(间断晃动 2 ～ 3次)。加入 150 μl
5mol/LKAc, 混匀 , 置冰上 20 ～ 30 min。 4℃ 12 000 r/min离心
15 min。上清液转入新离心管中 , 加入等体积的氯仿 -异戊醇 ,
轻轻颠倒混匀。 4℃ 12 000 r/min离心 15 min, 上清液转入另一
离心管中 , 加入 2/3体积预冷的异丙醇 , -20℃放置 30 min。 4℃
12 000r/min离心 15 min, 弃上清液 , 沉淀自然晾干后加入 50μl
TE缓冲液溶解 , 并加入 10 mg/mlRNA酶 1μl, 于 37℃保温 1 h。
电泳检测基因组的完整性。
2.2　引物筛选及 PCR方法 [ 4] 首先进行随机引物的筛选 , 10核
苷酸随机引物购自上海生工(编号分别为:S1 ～ S40, S71 ～ S90,
S111 ～ S120), PCR反应体为:10 ×PCRbuffer2.5 μl, 25mmol/L
MgCl2 3μl, 2.5mmol/L4dNTP1.5μl, 引物(0.5μmol/L)1μl,
模板 DNA(100 ng)1 μl, Taq聚合酶(5U/ μl)0.5 μl, 补加双蒸
水至 25μl。 PCR仪的反应条件为:94℃预变性 3min, 94℃变性
45 s, 36℃退火 45 s, 72℃延伸 1 min, 共 44个循环 , 72℃保温 7
min。PCR结束后用 1.2%的 Agrose进行电泳分析结果。
2.3　RAPD数据分析 [ 5] 按琼脂糖凝胶同一位置上 DNA带的有
无进行统计 , 有带(包括弱带)记为 “ 1” , 无带记为 “ 0” 。利用
NTSYS(2.10e)软件对 RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各
物种之间的遗传距离 ,并构建 DNA分子系统树。
3　结果
3.1　改良 SDS法提取植物基因组 DNA 植物基因组抽提方法常
用的有 CTAB法和 SDS法 ,植物中的主要矛盾是粉碎破壁困难和
糖类的影响 ,所以一般采用阳性表面活性剂的方法。最常用的就
是 CTAB和 SDS。但 CTAB的表面活性比 SDS差 , 所以本实验采
用改良 SDS法 ,其基本原理是研磨的组织细胞用热的 SDS裂解
后 , 加入高浓度的 KAc, 0℃放置以除去蛋白和多糖类杂质 , 最后
用异丙醇沉淀。 用琼脂糖凝胶电泳(0.8%)检测 , 发现基因组
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时珍国医国药 2010年第 21卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH 2010VOL.21NO.8
DNA的比较完整(见图 1)。
M-LamdaDNA/EcoRI+HindⅢ
1.GenomeDNAofRadixScrophulariae-ZheJiang
2.GenomeDNAofRadixScrophulariae-ShanDong
3.GenomeDNAofRadixScrophulariae-HuBei
图 1　3种玄参的基因组 DNA电泳图谱
3.2　引物筛选及 RAPD分析 从 70条引物中 , 共筛选出 9条能
扩增差异带的有效引物。由 S1、S8、S28、S29、S85引物扩增条带
(见图 2所示), 由随机引物 S86、S89、S90、S118扩增的条带(见图
3所示)。共扩增出现 142个条带 , 其中多态性条带为 83条 , 占
58%。其中以引物 S1、S28、S118信号强 , 特征明显 , 所筛选的引
物序列如表 1所示。
M-1kbDNAMarker
1 ～ 3.S1　 4～ 6.S8　7 ～ 8.S28　 10～ 12.S29　13～ 15.S85
1, 4, 7, 10, 13.RadixScrophulariae-ZheJiang
2, 5, 8, 11, 14.RadixScrophulariae-ShanDong
3, 6, 9, 12, 15.RadixScrophulariae-HuBei
图 2　玄参的 RAPD电泳图谱(随机引物:S1、S8、S28、S29、S85)
M:1kbDNAMarker
1～ 3.S86　 4～ 6.S89　7 ～ 8.S90　 10～ 12.S118
1, 4, 7, 10.RadixScrophulariae-ZheJiang
2, 5, 8, 11.RadixScrophulariae-ShanDong
3, 6, 9, 12.RadixScrophulariae-HuBei
图 3　玄参的 RAPD电泳图谱(随机引物:S86、S89、S90、S118)
3.3　不同产地玄参的遗传距离分析 利用 NTSYS(2.10e)软件
对 RAPD电泳结果进行聚类分析。计算出各物种之间的遗传
距离 , 并构建 DNA分子系统树。 遗传距离越大 , 种间亲缘关
系也就越远。遗传距离分析表明 , 山东玄参和湖北玄参亲缘
关系较近 , 而浙江玄参与二者均较远 , 说明作为道地药材的浙
江玄参具有不同的遗传特征 。这与浙江玄参多年的地理 、气
候 、环境等因素有关。
表 1　筛选出的 9条有效引物序列
序号 序列 序号 序列
S1 GTTTCGCTCC S86 GTGCCTAACC
S8 GTCCACACGG S89 CTGACGTCAC
S28 GTGACGTAGG S90 AGGGCCGTCT
S29 GGGTAACGCC S118 GAATCGGCCA
S85 CTGAGACGGA
C1-RadixScrophulariae-ZheJiang
C2-RadixScrophulariae-ShanDong
C3-RadixScrophulariae-HuBei
图 4　3个自然居群玄参的分子系统树图
4　讨论
玄参 ScrophularianingpaensisHeml.生产于长江流域各省 , 地
理分布广 ,不同地方的气温 、土壤 、水分等生态因子差别很大 , 同
一种植物在不同的外界环境条件下所形成的大大小小的居群产
生了遗传变异。玄参以浙江产量大 , 品质佳 , 为著名的 “浙八味”
道地药材之一。本实验通过遗传距离分析发现 ,山东与湖北的玄
参亲缘关系较近 ,而道地药材浙玄参与上述两种亲缘关系较远 ,
说明浙玄参在长期的栽培中形成自己独特的遗传特性 ,这也是多
年来以浙玄参为道地药材的原因。
本次实验是以改良 SDS法从新鲜玄参叶片中提取基因组
DNA,与传统的 CTAB法比较起来 ,改良 SDS法更加简便 ,所提取
的基因组 DNA质量较高 , 完全适合于 RAPD等分析。本次实验
通过反复多次 RAPD分析 ,成功筛选出 9条有效引物 ,为不同产
地或居群的玄参鉴定 ,以及进一步确定道地药材的 SCAR分子标
记 , 建立道地药材浙玄参的种植与质量标准提供科学依据 [ 6] 。
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