全 文 ：第１３卷第５期
２０１４年９月
杭州师范大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｅｄｉｔｉｏｎ）
Ｖｏｌ．１３Ｎｏ．５
Ｓｅｐ．２０１４
收稿日期：２０１４－０４－１５
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０７１８１８）；浙江省重点科技创新团队项目（２０１０Ｒ５００３９）．
通信作者：庞基良（１９６３—），男，教授，主要从事植物发育调控研究．Ｅ－ｍａｉｌ：ｐａｎｇｒｅｎｓｈｕｉｌｉａｎｇ＠ａｌｉｙｕｎ．ｃｏｍ
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７４－２３２Ｘ．２０１４．０５．０１１
大岩桐ＧＡＩ同源基因的克隆及功能研究
费　元１，钟　丹 ２，韩　雪 １，庞基良 １
（１．杭州师范大学生命与环境科学学院，浙江 杭州３１００３６；２．浙江省绍兴市鲁迅中学分校，浙江 绍兴３１２０００）
摘　要：以大岩桐（Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ）花蕾ＲＮＡ为模板，利用ＲＡＣＥ技术克隆了大岩桐ＧＡＩ同源基因的
全长ｃＤＮＡ，命名为ＳｓＧＡＩ（在 ＧｅｎＢａｎｋ中登录号为：ＦＪ５９４７７３）．序列分析表明，ＳｓＧＡＩ的 ＯＲＦ长度为１６８９
ｂｐ，编码５６２个氨基酸，含有典型的植物ＤＥＬＬＡ结构域以及ＧＲＡＳ结构域．蛋白同源性分析表明，ＳｓＧＡＩ与葡
萄的ＶｖＧＡＩ及陆地棉的ＧｈＧＡＩ相似性分别为６８％、６４％．ＳｓＧＡＩ基因在花萼中的相对表达量最高，在茎中表
达沉默．将ＳｓＧＡＩ置于ＣａＭＶ３５Ｓ启动子控制下在烟草中异位表达，转基因烟草表现出植株矮化，花瓣数增加，
花期延迟等新表型，表明ＳｓＧＡＩ参与了转基因烟草株高及花器官的发育．
关键词：大岩桐；ＧＡＩ同源基因；花发育
中图分类号：Ｑ９４３．２　　　　　文献标志码：Ａ
文章编号：１６７４－２３２Ｘ（２０１４）０５－０５０９－０８
赤霉素（ＧＡ）是一种重要的植物激素，它调节许多植物的生长和发育过程，如种子萌发、叶的生长、根
茎的伸长、花的发育以及果实的膨大等［１］．赤霉素的信号转导由正向作用因子和反向作用因子调节，ＧＡＩ
基因是ＧＡ信号转导途径中的反向作用因子之一，它编码的蛋白属于ＧＲＡＳ家族的ＤＥＬＬＡ蛋白，ＤＥＬ－
ＬＡ蛋白在ＧＡ信号转导途径中发挥着重要作用，赤霉素通过泛素化降解途径促使ＤＥＬＬＡ蛋白降解，从
而引起赤霉素反应基因的表达［２］．目前已从拟南芥（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）、豌豆（Ｐｉｓｕｍ　ｓａｔｉｖｕｍ）、杨树
（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ａｌｂａ）苹果（Ｍａｌｕｓ　ｐｕｍｉｌａ）、葡萄（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）［３－７］等多个物种中克隆到ＧＡＩ的同源基因．
ＧＡＩ的功能缺失会产生拟南芥突变体ｇａ１－３迟开花的表型，说明ＧＡＩ起抑制花转变的作用［８］．拟南芥的
ＧＡＩ基因在水稻中过表达会引起植株的矮化，而这可能会产生一系列的水稻高产品种［９］．葡萄的ＶｖＧＡＩ
突变会引起在原本形成卷须的部位产生花序［１０］．ＶｖＧＡＩ还与葡萄的育性、串重、果实品质相关［１１］．以上研
究表明ＧＡＩ基因与株高、花芽分化以及果实发育密切相关．
我们通过在培养基中添加赤霉素和细胞分裂素，建立了离体培养大岩桐花被切块高频率直接再生花
芽的实验体系［１２－１３］．ＧＡＩ基因既是ＧＡ信号转导的反向作用因子，又在花发育中起作用，本研究克隆了大
岩桐的ＧＡＩ同源基因，并通过农杆菌介导法转化烟草，初步研究了大岩桐ＧＡＩ同源基因的功能．
１　材料与方法
１．１　供试材料
本实验所用的大岩桐（Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ），种植于杭州师范大学玻璃温室．取新鲜花蕾分装，于液氮
中保存备用．
１．２　方　法
１．２．１　总ＲＮＡ的提取与ｃＤＮＡ合成
采用异硫氰酸胍法（ＧＴ）提取花蕾（直径约５ｍｍ）组织的总ＲＮＡ，取２μｇ　ＲＮＡ，使用ＲｅｖｅｒｔＡｉｄ
ＴＭ
Ｆｉｒｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ（ＴｏＹｏＢｏ，Ｃｏｄｅ：ＦＳＫ－１００）合成ｃＤＮＡ．
１．２．２　ＧＡＩ基因保守区克隆
通过对已经在ＧｅｎＢａｎｋ上发布的拟南芥等植物ＧＡＩ同源基因序列的比对，在其保守区域设计一对
引物，Ｄｅｌａ　００４：５’－ＣＡＣ　ＧＣＣ　ＡＣＣ　ＡＣＧ　ＴＴＧＣＡＧ　ＡＴ－３’，Ｄｅｌａ　００５：５’－ＧＣＡＣＴＴ　ＣＴＡ　ＣＧＡ　ＧＡＣ
ＣＴＧ　ＣＣ－３’，以反转录后的大岩桐ｃＤＮＡ为模板进行ＰＣＲ，ＰＣＲ的条件是９４℃３ｍｉｎ，９４℃４５ｓ，５５℃
４５ｓ，７２℃１．５ｍｉｎ，７２℃１０ｍｉｎ，３０个循环．将该ＰＣＲ扩增产物经１．２％琼脂糖电泳后，利用ＤＮＡ 胶回
收试剂盒回收，连接到ｐＭＤ１８－Ｔ测序载体，送上海生工公司测序．
１．２．３　３’端的克隆
根据测序得到的ＧＡＩ保守区序列，在序列内部设计两个５’端巢式引物与试剂盒所带引物形成嵌套，
以第一链ｃＤＮＡ为模版进行３’ＲＡＣＥ．两个５’端的引物Ｄｅｌａ　００７（Ｏｕｔｅｒ）：５’－ＴＴＴ　ＧＧＴ　ＡＴＧ　ＡＡＡ
ＣＡＧ　ＧＧＡ　ＡＴＧ　Ｃ－３’；Ｄｅｌａ　００８（Ｉｎｎｅｒ）：５’－ＣＡＡ　ＧＣＡ　ＴＴＧ　ＧＣＧ　ＴＴＧ　ＡＧＧ　Ｃ－３’．试剂盒所带引物：
３ＲＡＣＥ（Ｏｕｔｅｒ）：５’ －ＴＡＣ　ＣＧＴ　ＣＧＴ　ＴＣＣ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＴＴ－３’；３ＲＡＣＥ（Ｉｎｎｅｒ）：５’－ＣＧＣ　ＧＧＡ
ＴＣＣ　ＴＣＣ　ＡＣＴ　ＡＧＴ　ＧＡＴ　ＴＴＣ　ＡＣＴ　ＡＴＡ　ＧＧ－３’．
１．２．４　５’端的克隆
根据已知的中间序列，设计两个３’端巢式引物与试剂盒所带引物形成嵌套．以第一链ｃＤＮＡ 为模板
按照试剂盒方法进行５’ＲＡＣＥ，将ＰＣＲ扩增产物回收后，连接到ｐＭＤ１８－Ｔ测序载体后，送上海生工公司
测序．两个３’端巢式引物是Ｄｅｌａ　０１２（Ｏｕｔｅｒ）：５’－ＴＣＣ　ＡＡＴ　ＧＡＡ　ＡＣＧ　ＡＡＡ　ＡＧＧ　ＧＴＣ－３’；Ｄｅｌａ　０１０
（Ｉｎｎｅｒ）：５’－ＣＣＡ　ＣＣＧ　ＴＣＴ　ＣＡＣ　ＣＴＴ　ＣＣＣ　ＴＡＡ－３’．试剂盒所带引物５ＲＡＣＥ（Ｏｕｔｅｒ）：５’－ＣＡＴ　ＧＧＣ
ＴＡＣ　ＡＴＧ　ＣＴＧ　ＡＣＡ　ＧＣＣ　ＴＡ－３’；５ＲＡＣＥ（Ｉｎｎｅｒ）：５’－ＣＧＣ　ＧＧＡ　ＴＣＣ　ＡＣＡ　ＧＣＣ　ＴＡＣ　ＴＧＡ　ＴＧＡ
ＴＣＡ　ＧＴＣ　ＧＡＴ　Ｇ－３’．
１．２．５　ＧＡＩ基因全长的克隆
用ＤＮＡｓｔａｒ软件拼接所得的３段序列（中间序列、３’端序列和５’端序列），根据拼接结果，在两端设
计基因的特异性引物，全长引物是ＳｓＧＡＩ００１：５’－ＣＧＧ　ＧＡＴ　ＣＣＴ　ＴＴＣ　ＡＡＧ　ＡＡＡ　ＡＴＧ　ＡＡＧ　ＡＧＡ
ＧＡＣ　ＣＡＣ－３’；ＳｓＧＡＩ００２：５’－ＣＧＡ　ＧＣＴ　ＣＣＡ　ＡＡＣ　ＣＡＧ　ＡＣＣ　ＧＧＧ　ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＴＣ－３’，进行全长ＰＣＲ
扩增，将ＰＣＲ扩增产物回收后，连接到ｐＭＤ１８－Ｔ测序载体后，送上海生工公司测序．
１．２．６　生物信息学分析
将测序结果通过ＮＣＢＩ网站进行核苷酸序列比对（Ｂｌａｓｔｎ）和氨基酸序列比对（Ｂｌａｓｔｐ）；用ＤＮＡｍａｎ
４．０进行氨基酸序列比对分析；根据同源比对结果，用 ＭＥＧＡ　４．１进行进化树分析．
１．２．７　ＳｓＧＡＩ器官特异性表达分析
分别提取大岩桐的根、茎、叶、花萼和直径５ｍｍ花芽的总ＲＮＡ，反转录后得到不同组织的ｃＤＮＡ，以
肌动蛋白（Ａｃｔｉｎ）作为内标对ｃＤＮＡ模板进行半定量，通过对不同的ｃＤＮＡ模板进行ＲＴ－ＰＣＲ，确定Ｓｓ－
ＧＡＩ在不同组织中的表达量．ＰＣＲ反应程序为：９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性４５ｓ，６０℃退火４５ｓ，７２℃延
伸６０ｓ，扩增３０个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ．Ａｃｔｉｎ的引物为ＡｃｔｉｎＦ：５’－ＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＣＡＴＣＡＣＡ－
３’，ＡｃｔｉｎＲ：５’－ＣＣＴＣＣＡＡＴＡＡＡＧＡＣＡＣＴＧＴＡ－３’．
１．２．８　ＳｓＧＡＩ的载体构建和烟草转化
以ｐＢＩ１２１为基础，ＣａＭＶ　３５Ｓ为启动子，构建ＳｓＧＡＩ同源基因全长 ＯＲＦ序列的超表达载体．用
ＢａｍＨＩ和ＳａｃＩ对克隆载体ｐＭＤ１８－Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ进行双酶切，所得ＯＲＦ连接到用相同内切酶进行双酶切的
ｐＢＩ１２１载体上，取代ＧＵＳ基因，获得ｐＢＩ１２１－ＳｓＧＡＩ表达载体．将重组质粒转化大肠杆菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ．构建
过程中质粒ＤＮＡ小量提取、酶切、片段回收均参照试剂盒（上海生工公司产品）说明书进行．
０１５ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１４年　
使用冻融法（参考分子克隆实验指南第２版）将ｐＢＩＮ１９－３５Ｓ－ＳｓＧＡＩ 表达载体导入根癌农杆菌
ＧＶ３１０１中，用叶盘法转化烟草（品种为“黄苗鱼”），在含８０μｇ· ｍＬ
－１卡那霉素的 ＭＳ培养基上筛选幼
苗，转基因阳性苗经过炼苗后，移栽至花盆中，栽培基质为泥炭∶珍珠岩＝３∶１，培养在人工气候室，２４
℃，１２ｈ／１８℃，１２ｈ．
转基因烟草苗（Ｔ０代）移栽３０ｄ后，对９株转基因烟草的叶片进行了ＳｓＧＡＩ的ＲＴ－ＰＣＲ分析．并于
转基因烟草苗移栽７５ｄ后，仔细观察各种花器官的形态变化．
２　结果与分析
２．１　ＳｓＧＡＩ基因的序列
根据ＧＡＩ保守序列设计引物，以大岩桐花蕾ｃＤＮＡ为模板，经ＰＣＲ扩增获得一条６０８ｂｐ的特异片段，用
ＲＡＣＥ法分别获得３’端１１５０ｂｐ和５’端１２５６ｂｐ的目的片段．将已得到的三段序列通过ＤＮＡｍａｎ软件进行拼
接，根据拼接序列在ＯＲＦ两端设计引物进行ＰＣＲ扩增，获得ＳｓＧＡＩ的全长ＯＲＦ序列，长度为１６８９ｂｐ．
２．２　ＳｓＧＡＩ全长序列生物信息学分析
通过序列拼接得到ＳｓＧＡＩ的全长序列．ＳｓＧＡＩ的ｃＤＮＡ全长为２１４７ｂｐ，该序列包含一个完整的开放阅
读框（ＯＲＦ），长度为１６８９ｂｐ，编码５６２个氨基酸，起始密码子为ＡＴＧ，在序列的５’端１７－１８核苷酸处可能有
一段信号肽剪切位点，含有加尾信号ＡＡＴＡＡ１－３序列和ｐｏｌｙ（Ａ）１１序列（图１）．该序列的ＧｅｎＢａｎｋ登录号为
ＦＪ５９４７７３．Ｂｌａｓｔｐ分析发现，ＳｓＧＡＩ与葡萄的ＶｖＧＡＩ及陆地棉的ＧｈＧＡＩ相似性分别为６８％、６４％．
１１５　第５期 费　元，等：大岩桐ＧＡＩ同源基因的克隆及功能研究
图１　大岩桐ＳｓＧＡＩ基因全长序列和推测的氨基酸序列
Ｆｉｇ．１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａｓ　ＳｓＧＡＩ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
　　经过ＳｉｇｎａｌＰ　４．０Ｓｅｒｖｅｒ分析，结果表明ＳｓＧＡＩ无信号肽，通过比对分析发现，ＳｓＧＡＩ在３７－１０９个
氨基酸处有一个ＤＥＬＬＡ结构域，在第１７２－５２９个氨基酸处有一个ＧＲＡＳ结构域，含有植物ＤＥＬＬＡ蛋
白活性中心序列ＴＶＨＹＮＰ（见图２）．
２．３　ＳｓＧＡＩ氨基酸序列的系统进化分析
在软件 ＭＥＧＡ　４．１平台上构建系统进化树，对ＳｓＧＡＩ基因编码的氨基酸与ＧｅｎＢａｎｋ记载的１３种
ＧＡＩ蛋白之间构建系统进化树，进行聚类分析．图３结果显示：ＳｓＧＡＩ与葡萄的ＶｖＧＡＩ及陆地棉的Ｇｈ－
ＧＡＩ相似性分别为６８％、６４％．大岩桐ＳｓＧＡＩ归属于ＧＲＡＳ家族中的双子叶家族的分类群，而与单子叶
植物亲缘关系较远．
２．４　ＳｓＧＡＩ基因的器官特异性表达分析
如图４所示，以大岩桐Ａｃｔｉｎ为内参，ＳｓＧＡＩ在叶、花萼、直径５ｍｍ的花芽、根中都有表达，且在花萼
中表达量较高，但是在茎中表达沉默．
２１５ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１４年　
图２　大岩桐及其他植物ＧＡＩ氨基酸序列同源性比对
Ｆｉｇ．２　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ－ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＧＡＩｉｎ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ
３１５　第５期 费　元，等：大岩桐ＧＡＩ同源基因的克隆及功能研究
注：系统发育树分析及多序列比对所涉及到的有关基因序列如下：大岩桐的ＳｓＧＡＩ（ＡＣＭ４７２４４．１）；杜梨的ｐｂＧＡＩ（ＡＦＪ２３２１９．１）；
苹果的ｍｄＧＡＩ（ＡＤＷ８５８０５．１）；玫瑰的ＲｏＧＡＩ（ＡＧＫ０７２８７．１）；陆地棉的ＧｈＧＡＩ（ＡＣＲ５８４５５．１）；毛白杨的ＰｔＧＡＩ（ＡＦＰ５８８４４．１）；
海岛棉的ＧｂＧＡＩ（ＡＢＧ２６３７０．１）；胡桃的ＪｒＧＡＩ（ＡＥＥ６９０７４．２）；莴苣的ＬｓＧＡＩ（ＢＡＧ７１２００．１）；蓖麻的ＲｃＧＡＩ（ＸＰ＿００２５２７７９４．１）；
猕猴桃的ＡｄＧＡＩ（ＡＨＢ１７７４２．１）；可可的ＴｃＧＡＩ（ＸＰ＿００７０４５１９７．１）；葡萄的ＶｖＧＡＩ（ＡＥＫ０６２２９．１）
图３　１３种植物的ＧＡＩ基因氨基酸序列构建出的进化树
Ｆｉｇ．３　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＧＡＩ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　１３ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｆ　ｐｌａｎｔｓ
２．５　转ＳｓＧＡＩ烟草的表型分析
利用农杆菌介导法将ＳｓＧＡＩ基因转化烟草，在转基因苗移栽３０ｄ后，对转基因烟草叶片进行了Ｓｓ－
ＧＡＩ表达的ＲＴ－ＰＣＲ检测分析．结果显示，在转基因烟草中检测到了ＳｓＧＡＩ的表达，野生型中未检测到
ＳｓＧＡＩ的表达（见图５），说明ＳｓＧＡＩ已整合进烟草基因组，并成功表达．
注：Ｌ：叶；Ｓ：花萼；Ｆ：直径５ｍｍ花芽；Ｒ：根；ＳＴ：茎
图４　大岩桐ＳｓＧＡＩ基因在各器官表达的ＲＴ－ＰＣＲ分析
Ｆｉｇ．４　Ｏｒｇａｎ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＳｓＧＡＩ　ｇｅｎｅ　ｂｙ
ＲＴ－ＰＣＲ　ｉｎ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ
　
注：Ｍ：ＭａｒｋｅｒⅢ；１－９：转化植物；１０：野生型植株
图５　转ＳｓＧＡＩ的基因烟草的ＲＴ－ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．５　ＲＴ－ＰＣＲ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＳｓＧＡＩｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ
转基因烟草移栽７５ｄ后开始观察并记录其表型变化，野生型烟草的花有５个花瓣，转ＳｓＧＡＩ烟草的
花表现出了两种新的表型：１）６瓣花，出现频率为１８．０６％；２）８瓣花，出现频率为３０．５６％（表１）．且转基
因烟草的植株高度显著下降，花期延迟（见图６）．
表１　移栽后转基因烟草的花型及株形变化
Ｔａｂ．１　Ｃｈａｎｇｅｓ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒ　ｔｙｐｅｓ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｏｆ　ＳｓＧＡＩｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏｓ　ａｆｔｅｒ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ
植株 ７５ｄ时株高／ｃｍ 花型 统计总花数 出现花型变化的花数 表型出现的频率／％
转基因 ３８．５　 ６瓣花 ７２　 １３　 １８．０６
８瓣花 ７２　 ２２　 ３０．５６
野生型 ７５．６　 ５瓣花 ／ ／ ／
４１５ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１４年　
Ａ．转化ＳｓＧＡＩ和野生型的烟草植株，ａ为转化ＳｓＧＡＩ的植株；ｂ为野生型植株；
Ｂ．野生型的开放花，花瓣５枚；Ｃ．转ＳｓＧＡＩ的开放花，花瓣６枚；Ｄ．转ＳｓＧＡＩ的开放花，花瓣８枚．
图６　ＳｓＧＡＩ转化烟草的表型
Ｆｉｇ．６　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＳｓＧＡＩｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄ　ｔｏｂａｃｃｏ
３　结　语
ＤＥＬＬＡ蛋白作为ＧＡ信号转导的主要反向作用因子，起着调节植物生长和发育过程的作用．本研究
克隆了大岩桐ＳｓＧＡＩ基因，并利用生物信息学对ＳｓＧＡＩ进行了系统分析．ＳｓＧＡＩ基因推导的蛋白序列与
其他植物有一定差异，但均含有保守的ＤＥＬＬＡ结构域，且Ｎ端都含有酶活性中心区域ＴＶＨＹＮＰ，表明
在进化中基因功能结构域的稳定性．大岩桐ＳｓＧＡＩ编码的多肽链无信号肽酶切位点，表明ＳｓＧＡＩ在细胞
中合成后，不进行蛋白转运，其在细胞内的准确定位还有待研究．
ＳｓＧＡＩ在根、叶、花萼、花芽中都有表达，但是在茎中表达沉默，推测该基因可能在各个器官中发挥着
不同的调节作用．
ＳｓＧＡＩ转化烟草植株株型矮化，花瓣数量增加，这表现为ＧＡ缺失的表型，这可能是ＤＥＬＬＡ蛋白的
过量表达使其抑制功能进一步加强，抑制了赤霉素的作用，使植株矮化、节间变短和花发育发生异常等．
Ｈａｎｉ等［１４］将一个拟南芥ＧＡＩ基因转化烟草，结果发现转基因植株也表现花瓣数增加，此外还有雄蕊花瓣
化现象发生．Ｌｌｅｗｅｌｙｎ等［１５］将３５Ｓ：ＧＡＩ转入烟草，转基因植株矮化，花和果荚发育异常．在番茄中过量表
达苹果 Ｍｈｇａｉ１，会表现出花器官变小和单性结实的性状［１６］．
综上所述，本研究克隆得到了大岩桐ＳｓＧＡＩ基因的全长ｃＤＮＡ，并对该基因序列，其编码的氨基酸序
列、功能结构域及在器官中的表达区域等进行了初步分析，并将其置于烟草中异位表达，进一步研究了它
对植物生长发育的影响．
参考文献：
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５１５　第５期 费　元，等：大岩桐ＧＡＩ同源基因的克隆及功能研究
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［１１］Ｌ　Ｈａｍａｍａ　Ａ，Ｎａｏｕａｒ　Ｒ，Ｇａｌａ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ＲｏＤＥＬＬＡｉｍｐａｃｔｓ　ｔｈｅ　ｈｅｉｇｈｔ，ｂｒａｎｃｈｉｎｇ，ａｎｄ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ　ｂｅｈａｖｉｏｕｒ　ｏｆ　Ｐｅｌ－
ａｒｇｏｎｉｕｍ ×ｄｏｍｅｓｔｉｃｕｍｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ　Ｒｅｐ，２０１２，３１（１１）：２０１５－２０２９．
［１２］Ｐａｎｇ　Ｊ　Ｌ，Ｗａｎｇ　Ｌ　Ｌ，Ｈｕ　ＪＱ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ　ｐｒｏｍｏｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ　ａｎｄ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ　ｏｎ　ｄｉｒｅｃｔ　ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｏｒａｌ　ｂｕｄｓ　ｆｒｏｍ　ｉｎ
ｖｉｔｒｏ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ｓｅｐａｌ　ｓｅｇｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ　ｈｉｅｒｎ［Ｊ］．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｃｅｌｕｌａｒ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　Ｐｌａｎｔ，２００６，４２（５）：４５０－４５４．
［１３］Ｐａｎｇ　Ｊ　Ｌ，Ｗａｎｇ　Ｌ　Ｌ，Ｘｉａｎｇ　ＴＨ，ｅｔ　ａｌ．Ｈｉｇｈ－ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ　Ｆｌｏｒａｌ　Ｂｕｄ　Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ｐｅｔａｌ　Ｓｅｇｍｅｎｔ　Ｃｕｌｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ
Ｈｉｅｒｎ［Ｊ］．Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅｌ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１２，３４（３）：２７９－２８５．
［１４］ＡＩ－Ａｈｍａｄ　Ｈ，Ｇｒｅｓｓｅｌ　Ｔ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ　ｃｏｎｔａｉｎｍｅｎｔ　ｕｓｉｎｇ　ｃｙｔｏｋｉｎｉｎ－ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ　ｍａｌｅ　ｓｔｅｒｉｌｉｔｙ　ｉｎ　ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ，ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｃ　ａｃｉｄ－ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
（Δｇａｉ）ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｐｌａｎｔ　ｇｒｏｗｔｈ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，２００５，２４（１）：１９－２７．
［１５］Ｈｙｎｅｓ　Ｌ　Ｗ，Ｐｅｎｇ　Ｊ　Ｒ，Ｒｉｃｈａｒｄｓ　Ｄ　Ｅ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＤＥＬＬＡ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ＧＡＩ　ａｎｄ　ｇａｉ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ａｌｔｅｒｅｄ
ｇｉｂｂｅｒｅｌｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏ［Ｊ］．Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，１２（６）：７０７－７１４．
［１６］Ｗａｎｇ　Ｓ　Ｓ，Ｌｉｕ　Ｚ　Ｚ，Ｓｕｎ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｐｐｌｅ　ＭｈＧＡＩ１ｇｅｎｅ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｅｃｔｏｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｇｒａｆｔｉｎｇ　ｅｘｐｅｒ－
ｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　ｔｏｍａｔｏｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０１２，１６９（３）：３０３－３１０．
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＧＡＩ　Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　Ｇｅｎｅ　ｉｎ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　Ｓｐｅｃｉｏｓａ
ＦＥＩ　Ｙｕａｎ１，ＺＨＯＮＧ　Ｄａｎ２，ＨＡＮ　Ｘｕｅ１，ＰＡＮＧ　Ｊｉｌｉａｎｇ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　Ｎｏｒｍａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ　３１００３６，Ｃｈｉｎａ；２．Ｂｒａｎｃｈ　Ｃａｍｐｕｓ　ｏｆ　Ｌｕｘｕｎ
Ｍｉｄｄｌｅ　Ｓｃｈｏｏｌ，Ｓｈａｏｘｉｎｇ　３１２０００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ　ｔｈｅ　ｆｌｏｒａｌ　ｂｕｄｓ　ＲＮＡ　ｏｆ　Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ，ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＧＡＩ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ　ｉｓ　ｃｌｏｎｅｄ
ｂｙ　ｒａｐｉｄ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃＤＮＡ　ｅｎｄｓ（ＲＡＣＥ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ　ｎａｍｅｄ　ＳｓＧＡＩ．Ｔｈｅ　ＳｓＧＡＩｈａｓ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）
ｏｆ　１６８９ｂｐ　ｌｅｎｇｔｈ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　５６２ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ａｓ　ｗｅｌ　ａｓ　ｔｈｅ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｐｌａｎｔ　ＤＥＬＬＡｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　ＧＲＡＳ　ｄｏｍａｉｎ．Ｔｈｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ　ＳｓＧＡＩｉｓ　ｓｉｍｉｌａｒ　ｔｏ　ＶｖＧＡＩ（Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ）ａｎｄ　ＧｈＧＡＩ（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ）ｗｉｔｈ　ｔｈｅ
ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｏｆ　６８％ａｎｄ　６４％．ＳｓＧＡＩｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｈｉｇｈｌｙ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｅｐａｌｓ，ｂｕｔ　ｉｓ　ｓｉｌｅｎｃｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｓｔｅｍ．Ｐｌａｃｉｎｇ　ＳｓＧＡＩ　ｕｎｄｅｒ　ｔｈｅ
ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ＣａＭＶ３５Ｓｐｒｏｍｏｔｅｒ　ａｎｄ　ｅｃｔｏｐｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ　ｉｎ　ｔｏｂａｃｃｏｓ，ｔｈｅ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｅｘｈｉｂｉｔ　ｎｏｖｅｌ　ｐｈｅｎｏｔｙｐｅｓ
ｗｉｔｈ　ｄｗａｒｆ　ｐｌａｎｔ，ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｐｅｔａｌ　ｎｕｍｂｅｒ　ａｎｄ　ｌａｔｅ　ｆｌｏｗｅｒｉｎｇ．Ｔｈｅｓｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈａｔ　ＳｓＧＡＩ　ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ
ｈｅｉｇｈｔ　ａｎｄ　ｆｌｏｒａｌ　ｏｒｇａｎ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏｓ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｓｉｎｎｉｎｇｉａ　ｓｐｅｃｉｏｓａ；ＧＡＩ　ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ　ｇｅｎｅ；ｆｌｏｗｅｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
６１５ 杭州师范大学学报（自然科学版） ２０１４年