全 文 ：本文2006年1月19日收到。2006年5月20日接受。
**浙江省自然科学基金项目(M303024,Y304128)资助。
***通讯作者,E-mail:pangrenshuiliang@yahoo.com.cn
前文发现在基本培养基上添加赤霉素和细胞
分裂素能促进离体培养的大岩桐花蕾直接再生花
芽[1],后又发现细胞分裂素能协同赤霉素促进离体
培养大岩桐花萼切块高频率直接再生花芽[2,3],所
得结果提示,这可能是一个研究赤霉素和细胞分
裂素在花分化发育中作用的良好实验系统。为了
完善这一实验系统,明确离体培养的大岩桐花萼
切块培养物直接再生花芽的起源以及花分化的形
态进程是十分必要的。为此我们对离体培养大岩
桐花萼切块的形态变化在体视显微镜下进行了系
统观察,并进行了石蜡切片及电镜扫描观察。
进行大岩桐(Sinningia speciosa Hiern)花萼切
块培养时,选取直径为 8-10mm大小的花蕾,75%
酒精浸 30s后,用 0.1%升汞消毒 7min,再用无菌
水冲洗4次。然后从花蕾上切取花萼,并将花萼横
切成 3段(宽约 3mm),以近轴端和中间的切段为
外植体,接入大岩桐诱花培养基。诱花培养基的基
本营养基配方与以前所用的配方相同[1],培养基中
另加入 1.0mg/L GA和 0.1mg/L BA。在 25℃,12h
光照条件下培养。分别于培养 14d、24d、30d、37d、
45d、60d、65d后,将花萼切块培养物从三角瓶中
取出,在蔡氏体视显微镜(Stemi 2000-C型)下拍
照记录花萼切块的外观形态变化。
石蜡切片时,花萼切块培养物分别于培养 0d、
7d、14d、17d、20d、30d时取材,在 FAA固定液中固
定,按常规方法进行石蜡切片,切片厚度为 8μm,
每天的样品切 10块材料,用段续川修订的海登汉
铁矾苏木精法染色[4]。电镜扫描时,花萼切块分别
于培养 14d、20d、24d、30d后取材,用 2.5%戊二醛
及 1%锇酸双重固定,然后按常规电镜扫描方法
进行电镜扫描观察。
离体培养 14-65d的花萼切块培养物在体视
显微镜下所观察到的形态变化
离体培养 14-65d花萼切块的形态变化见图
版Ⅰ,图 A-H。培养 14d的花萼切块在切口边缘膨
大,并有小的突起(图版Ⅰ,图 A)。培养 24d的花
萼切块在切块边缘及接触培养基的一面形成淡黄
色的颗粒状突起(图版Ⅰ,图B)。培养 30d后,花芽
样的原基从切块边缘及表面长出(图版Ⅰ,图 C);
培养 37d后,花芽原基进一步长大,可见花被原基
(图版Ⅰ,图 D);培养 45d后,花芽已长到肉眼可见
(图版Ⅰ,图 E);培养 60d后,在花萼切块的表面形
成成簇的花芽(图版Ⅰ,图 F),有的花萼切块培养
物既形成花芽也形成营养芽(图版Ⅰ,图 G);培养
65d后,切块表面形成的花芽中有一些花芽可开
放,此时可见花萼切块上所形成的花芽具有花瓣、
雄蕊和花柱(图版Ⅰ,图 H),但无花萼(多次试验
观察均如此),这是一个值得思索的现象。
离体培养 0-30d花萼切块培养物的石蜡切片
观察
培养 0-30d花萼切块的组织结构变化见图
版Ⅱ,图A-D。培养 0d切块组织的细胞排列整齐,
看不到分裂细胞(图版Ⅱ,图 A)。培养 7d的切块
在切口及表皮下出现小的分生细胞中心(图版Ⅱ,
图 B)。培养 14d至 17d切块中的分生组织不断增
多,并逐步增大。培养 20d的切块在切口处出现花
器官原基分化(图版Ⅱ,图C)。培养 30d后,切块上
分化的花芽已具有花瓣原基和雄蕊原基(图版Ⅱ,
图 D)。
离体培养 14-30d花萼切块培养物的电镜扫
描观察
培养 14-30d花萼切块的电镜扫描结果见图
版Ⅱ,图 E-H。培养 14d的切块,在切块的切口处
出现多处突起(图版Ⅱ,图E)。培养 20d后,切块的
大岩桐花萼切块离体培养直接再生花芽的形态观察(简报)*
庞基良 1**王利琳 1 胡江琴 1 向太和 1 梁海曼 2
(1杭州师范学院生命科学学院,杭州 310018;2浙江大学生命科学学院,杭州 310012)
关键词:大岩桐 花萼切块 直接再生花芽 形态观察
第39卷 第4期 Vol. 39, No.4
August 20062006年8月
分 子 细 胞 生 物 学 报
Journal ofMolecular Cell Biology
39卷庞基良 王利琳 胡江琴 向太和 梁海曼
表面及切口处均出现较多突起,并突出于表面之
上(图版Ⅱ,图 F)。培养 24d后,切块表面形成的花
被原基已清晰可见(图版Ⅱ,图 G)。培养 30d后,
可见切块表面形成的花芽已具有几轮花器官原基
(图版Ⅱ,图 H)。
本文通过一系列的体视显微镜观察及石蜡切
片、电镜扫描观察,对离体培养的大岩桐花萼切块
培养物直接再生花芽的起源及花芽分化的形态变
化进程有了较初步的了解。花萼切块直接再生的
花芽一部分起源于切块切口处的细胞(见图版Ⅱ,
图 B),一部分起源于切块接触培养基一面的表皮
内侧的细胞(见图版Ⅰ,图 B)。从花芽分化的进程
来看,切块培养 7d,在切口处的细胞及表皮内侧的
细胞开始分裂,并形成小的分生细胞中心,切块培
养至 20d,在切口处开始出现花器官原基的分化,
表明切块培养 20d左右是花启动和花器官原基分
化的关键时间;切块培养 30d,切块上分化的花芽
已具多轮花器官原基,说明切块培养 20d至 30d
是花器官原基进一步分化的时期;接下来,培养
30d至 65d应是花器官原基生长发育的时期。这一
实验系统花分化时程的明确将是我们研究 GA和
细胞分裂素在成花中作用机理的基础之一。
已知赤霉素能促进开花整合子基因 LFY[5]、
SOC1[6]及花同源异型基因 AP3、PI、AG[7]的表达。
尽管大量的生理学证据表明细胞分裂素是诱导成
花的信号,但还缺乏细胞分裂素促进成花的遗传
学证据[8],仅见细胞分裂素能促进白芥中 SaMADS
A基因(SOC1的同源基因)表达的报告[9]。我们的
研究表明大岩桐花萼切块培养直接再生花芽,必
须要有赤霉素和细胞分裂素的配合协同作用,才
能高效率诱导花芽分化[2,3],因此,明确离体培养大
岩桐花萼切块直接再生花芽的起源及花芽分化的
时程,将有助于进一步开展赤霉素、细胞分裂素在
花分化发育过程中的作用时间及如何配合作用等
的分子机理研究。
参 考 文 献
[1]庞基良,王利琳,胡江琴,梁海曼,2004,赤霉素对
大岩桐花蕾离体培养直接再生花芽的影响。实验
生物学报,37(3):242-246。
[2]庞基良,王利琳,胡江琴,向太和,梁海曼,2005,赤霉素
和细胞分裂素协同促进离体培养大岩桐花萼切块
高频率直接再生花芽。《全国植物分子生物学与生
物技术研讨会暨 IAPTC&B中国会员大会会议论
文摘要集》,29。
[3]Pang,J.L.,L.L.Wang,J.Q.Hu,T.H.Xiang&H.M.
Liang,2006,Synergisticpromotionofgibberelinand
cytokininondirectregenerationoffloralbudsfromin
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Hiern.InvitroPant,(inpress).
[4]郑国锠,谷祝平,1993,《生物显微技术》(第二版)。
高等教育出版社,95。
[5]Bl#zquez,M.A.,R.Green,O.Nilsson,M.Sussman
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Cel,10:791-800.
[6]Moon,J.,S.S.Suh,H.Lee,K.R.Choi,C.B.Hong,N.
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nalsforfloweringinArabidopsis.PlantJ,35:613-623.
[7]Yu,H,T.Ito,Y.Zhao,J.Peng,P.Kumar& E.M.
Meyerowitz,2004,Floralhomeoticgenesaretargets
ofgibberelinsignalinginflowerdevelopment.PNAS,
101(20):7827-7832.
[8]Boss,P.K.,R.M.Bastow,J.S.Mylne&C.Dean,2004,
Multiplepathwaysinthedecisiontoflower:enabling,
promoting,andreseting.PlantCel,16:S18-S31.
[9]Bonhomme,F.,B.Kurz,S.Melzer,G.Bernier& A.
Jacqmard,2000,Cytokinin and gibberelin activate
SaMADSA,ageneapparentlyinvolvedinregulation
ofthefloraltransitioninSinapisalba. PlantJ. 24
(1):103-111.
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4期 大岩桐花萼切块离体培养直接再生花芽的形态观察
ABSTRACT ThemorphologicalchangesintheculturesofsepalsegmentsinSinningiaspeciosa
HiernwereobservedwithZeissStemi2000-CStereomicroscopefrom0to65daysafterculturein
vitro. Thelightyelowglobularprotuberanceswereobservedonthecutedgeandthesurfaceof
sepalsegmentsafterculturefor24days.Thentheglobularprotuberancesgrewbiggergradualy.A
lotoffloralbudsonthesurfaceofsepalsegmentsformedafterculturefor60days.Themorpho-
logicalchangesintheculturesofsepalsegmentswerestudiedwithlightmicroscopyafterculture
for0to30daysaswel.Thecelsoftissuesofsepalsegmentsarangedregularlyandnodivid-
ingcelwasobservedonthefirstdayculture.Thereappearedsomesmalmeristematiccentersof
dividingcelsoncutedgeandthelowerepidermisonthe7thday afterculture. Tothe20th
daycultureinvitro,thefloralorganprimordiawerediferentiatedonthecutedge.Onthe30th
dayculture,floralbudswithpetal,stamenprimordiawereobserved.Inaddition,themorphological
changesintheculturesofsepalsegment werestudiedduringthe14to30daysculturewith
scanningmicroscopyaswel.
Keywords:SinningiaspeciosaHiern. Sepalsegment. Direct regenerationoffloralbuds.
Morphologicalobservation.
MORPHOLOGICALSTUDIESONDIRECTREGENERATIONOF
FLORALBUDSFROM INVITROCULTURESOFSEPAL
SEGMENTSINSINNINGIASPECIOSAHIERN*
PANGJiLiang1** WANGLiLin1 HUJiangQin1 XIANGTaiHe1 LIANGHaiMan2
(1SchoolofLifeSciences,HangzhouNormalColege,Hangzhou 310018;
2ColegeofLifeSciences,ZhejiangUniversity,Hangzhou 310012)
*ThisworkwassupprtedbyNaturalScienceFoundationofZhejiangProvince(No.M303024,Y304128).
**Corespondingauthor,E-mail:pangrenshuiliang@yahoo.com.cn
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39卷庞基良 王利琳 胡江琴 向太和 梁海曼
图 版 说 明
图 版 Ⅰ
离体培养大岩桐花萼切块直接再生花芽的显微形态变化
图 A 培养14d的花萼切块,切口边缘膨大(箭头);×20
图B 培养24d的花萼切块,切块边缘及表面形成淡黄色的颗粒状突起(箭头);×20
图C 培养30d的花萼切块,花芽样的原基从切块边缘及表面长出(箭头);×20
图D 培养37d的花萼切块表面可见花被原基(箭头);×20
图E 培养45d的花萼切块,花芽长到肉眼可见(箭头);×10
图F 培养60d的花萼切块,在切块的表面形成成簇的花芽;×10。
图G 培养60d的花萼切块,在切块上既形成花芽也形成营养芽(箭头);×10
图H 培养65d的花萼切块,切块表面形成的花芽开放。 ×10
EXPLANATIONOFFIGURES
PLATE Ⅰ
Themicromorphologicalchangesofdirectfloralbudregenerationfrom invitrosepalsegmentsinSinningia
speciosaHiern.
Fig.A Thesweledcutedgeofsegmentculturesfor14daysafterculture(Arow);×20
Fig.B Somegranularstructuresappearedattheedgeandonthesurfaceofsegmentsonthe24thdayafterculture
(Arow);×20
Fig.C Somefloralbud-likestructuresonthesurfaceofsegmentsonthe30thdayafterculture(Arow);×20
Fig.D Theperianthprimordiaonthesurfaceofsegmentculturedfor37days(Arow);×20
Fig.E Afterculturefor45days,floralbudswerebigenoughtobeseenwithnakedeye(Arow);×10
Fig.F Alotoffloralbudsonthesurfaceofsepalsegmentsculturedfor60days;×10
Fig.G Bothfloralbudsandvegetativebudsonthesurfaceofsepalsegmentsculturedfor60days(Arow);×10
Fig.H Bloomingflowerbudswithredpetalsandpistilsafterculturefor65days.×10
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4期 大岩桐花萼切块离体培养直接再生花芽的形态观察
图 版 Ⅰ
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39卷庞基良 王利琳 胡江琴 向太和 梁海曼
图 版 Ⅱ
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4期 大岩桐花萼切块离体培养直接再生花芽的形态观察
图 版 Ⅱ
离体培养大岩桐花萼切块的石蜡切片及电镜扫描图
图A 培养0d花萼切块的纵切面,细胞排列整齐,未见分裂细胞;×100
图B 培养7d花萼切块的纵切面,在切块的切口及表皮下出现小的分生细胞中心(箭头);×100
图C 培养20d花萼切块的纵切面,在切口处出现花器官原基分化(箭头);×100
图D 培养30d花萼切块的纵切面,切块上分化的花芽已具有花瓣原基和雄蕊原基(箭头);×100
图E 培养14d花萼切块的电镜扫描图,在切块的切口处出现多处突起(箭头);×50
图F 培养20d花萼切块的电镜扫描图,在切块的表面出现许多突起(箭头);×50
图G 培养24d花萼切块的电镜扫描图,切块表面形成的花被原基已清晰可见(箭头);×50
图H 培养30d花萼切块的电镜扫描图,切块表面形成的花芽已具有几轮花被原基(箭头)。 ×50
PLATE Ⅱ
Longitudinalsections(From Fig.AtoFig.D)andSEM photographs(From Fig.EtoFig.H)ofinvitrosepal
segmentinSinningiaspeciosaHiern.
Fig.A Thecelsoftissuesofsepalsegmentculturedfor0dayarangedregularlyandnodividingcelwasob-
served;×100
Fig.B Thesmalmeristematiccentersofdividingcelsoncutedgeandthelowerepidermisofsepalsegmentcul-
turedfor7days(Arow);×100
Fig.C Tothe20thdaycultureinvitro,thefloralorganprimordiawerediferentiatedonthecutedge(Arow);×100
Fig.D Floralbudwithpetal,stamenprimordialonsepalsegmentculturedfor30days.(Arow);×100
Fig.E Alotofthesmalprotuberancesatthecutedgeofsepalsegmentculturedfor14days.(Arow);×50
Fig.F Alotofprotuberancesonthesurfaceofsepalsegmentsculturedfor20days(Arow);×50
Fig.G Theperianthprimordiaonsepalsegmentculturedfor24days(Arow);×50
Fig.H Thefloralbudswithseveralwhorlsofperianthprimordiaonsepalsegmentculturedfor30days(Arow).×50
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