全 文 ：第 33 卷 第 3 期
2011 年 5 月
北 京 林 业 大 学 学 报
JOURNAL OF BEIJING FORESTRY UNIVERSITY
Vol． 33，No． 3
May，2011
收稿日期:2010--12--26
基金项目:国家自然科学基金项目(30700559，30671476)。
第一作者:史军娜。主要研究方向:沙冬青抗逆基因的功能研究。电话:010--62390696 Email:sjn19851105@ bjfu． edu． cn 地址:100083
北京市清华东路 35 号北京林业大学生物学院。
责任作者:卢存福，博士，副教授。主要研究方向:植物抗逆性。电话:010--62338189 － 54 Email:lucunfu@ bjfu． edu． cn 地址:同上。
本刊网址:http:∥ journal． bjfu． edu． cn
沙冬青 GATA型锌指蛋白基因序列及表达分析
史军娜 刘美芹 师 静 王艳萍 智冠华 陈玉珍 卢存福
(北京林业大学林木育种国家工程实验室，教育部林木花卉遗传育种重点实验室)
摘要:根据沙冬青低温干旱诱导 cDNA 文库表达序列标签中锌指蛋白基因序列设计特异引物，采用 PCR 技术扩增
锌指蛋白基因 AmZFPG 的 cDNA 全长。序列分析表明，cDNA 全长 669 bp，推测编码 223 个氨基酸残基、分子量约
25 kD 的蛋白质。氨基酸保守性分析及同类锌指结构比对表明 AmZFPG 属于 GATA 结合蛋白家族，且具有高度的
保守性。系统发生分析表明，其与紫花苜蓿富含脯氨酸的细胞壁蛋白进化亲缘关系最近。半定量 RT-PCR 分析显
示，AmZFPG 基因是受低温和干旱诱导表达上调的基因，初步得出 AmZFPG 基因与沙冬青低温和干旱胁迫响应
相关。
关键词:沙冬青;锌指蛋白;序列分析;表达分析
中图分类号:S759. 95 文献标志码:A 文章编号:1000--1522(2011)03--0021--05
SHI Jun-na;LIU Mei-qin;SHI Jing;WANG Yan-ping;ZHI Guan-hua;CHEN Yu-zhen;LU Cun-fu．
Sequence analysis and expression pattern of AmZFPG encoding a GATA type zinc finger protein
in Ammopiptanthus mongolicus． Journal of Beijing Forestry University(2011)33(3)21--25 ［Ch，17
ref．］National Engineering Laboratory for Tree Breeding，Key Laboratory of Genetics and Breeding in
Forest Trees and Ornamental Plants of Ministry of Education，Beijing Forestry University，100083，P． R．
China．
We designed special primers according to the zinc finger protein gene sequence in expressed
sequence tags from a cold- and drought-treated Ammopiptanthus mongolicus cDNA library and amplified
cDNA of AmZFPG by PCR． The cDNA of AmZFPG is comprised of 669 base pairs which encode a zinc
finger protein with 273 amino acids and a molecular weight of 25 kD． Bioinformatic analysis indicates that
AmZFPG belongs to GATA-binding protein family and shares higher homology with given zinc finger
proteins which are involved in stress resistance in other plant species． Phylogenetic analysis indicates that
AmZFPG is most closely related to Medicago sativa proline-rich cell wall protein． Semiquantitative RT-
PCR analysis shows that the expression of AmZFPG is constitutive and up-regulated under cold and
drought stresses and that AmZFPG is related to response to drought and chilling stresses．
Key words Ammopiptanthu mongolicus;zinc finger protein;sequence analysis;expression analysis
锌指蛋白是常见的转录因子之一，普遍存在于
真核生物中。锌指 (zinc finger，ZFs)是识别核酸
的一种普遍性蛋白结构元件，它通过一对半胱氨酸
和一对组氨酸与 Zn2 +络合，自我折叠形成相对独立
的“指”状四面体结构［1］，这一结构最早由 Miller
等［2］于 1985 年在非洲爪蟾(Xenopus laevis)转录因
子 TFⅢA 中发现。锌指蛋白在真核生物中表达广
泛，参与细胞的分化、增殖和凋亡等多种重要生命过
程。由于其特殊的指状结构，锌指蛋白在对 DNA、蛋
白质和 RNA 的识别中起重要作用。研究表明，一些
与逆境胁迫相关的锌指蛋白基因，能够调控植物的
抗逆性［3
--6］。
沙冬青 (Ammopiptanthus mongolicus)属豆科
(Leguminosae)沙冬青属，国家二级濒危保护植物，
是我国西北阿拉善荒漠地区特有的常绿阔叶灌木和
特有的建群植物，具有耐旱、耐寒、耐瘠薄、根系发达
等抗逆性的特点，对维持当地的生态平衡、延缓沙漠
的扩展发挥重要作用，沙冬青是一种研究植物抗逆
DOI:10.13332/j.1000-1522.2011.03.017
性的理想材料。本文在我们前期工作的基础
上［7
--11］，根据我们实验室构建的沙冬青低温、干旱诱
导 ESTs 文库中锌指蛋白基因序列设计特异引物，
采用 PCR 技术扩增锌指蛋白基因 AmZFPG 的 cDNA
全长，分析其分子生物学特性，并检测其对低温和干
旱胁迫的响应，以期利用基因工程手段，改善和提高
植物，特别是木本植物的抗逆性。
1 材料与方法
1. 1 材 料
根据沙冬青 cDNA 文库中锌指蛋白基因序列设
计特异引物，采用 PCR 技术扩增沙冬青锌指蛋白基
因的 cDNA 全长。PCR 产物送至北京奥科生物科技
有限公司测序。特异性引物:PZFE 5--AgAATTCA
TgAACATggATgTgTgCCAAAATg--3;EZFn 5--AgCgg
CCgCCTAgTgCTCACTgggAATggAAg--3。
1. 2 生物信息学分析
用 Protparam (http:∥ au． expasy． org / cgi-bin /
protparam)分析锌指蛋白 AmZFPG 编码氨基酸的理
化性质;cDNA 序列在 NCBI(http:∥www． ncbi． nlm．
nih． gov / Structure / cdd /wrpsb． cgi)进行保守结构域
分析;用 BLAST(http:∥ www． ncbi． nlm． nih． gov /
blast /Blast． cgi)与一些抗逆相关的锌指蛋白做同源
性分析;利用 Bioedit 5. 0 及 MEGA 4 构建进化树;利
用 http:∥ cubic． bioc． columbia． edu / cgi / var / nair /
resonline． pl 预测氨基酸的核定位信号;利用 Psort
(http:∥ www． psort． org /)预测蛋白质的亚细胞定
位;利用 ProFun(http:∥www． cbs． dtu． dk / services /
ProtFun /)对蛋白质功能进行预测;利用 http:∥
www． predictprotein． org 预测蛋白二级结构。
1. 3 低温、干旱胁迫处理
将沙冬青种子种在只含有珍珠岩的基质中，约
10 d 后有 2 片叶片展开。取对照后，一部分幼苗放
4 ℃的冷库中作低温处理，处理时间分别为 2、24、48
h。另一部分幼苗作干旱处理，处理时间分别为 1、
2、3、4 d。
1. 4 RT-PCR 分析
将经过胁迫处理的沙冬青叶片用液氮研磨后，
用 RNA 提取试剂盒(北京科百奥生物技术有限公
司)提取总 RNA。第一链 cDNA 以 Oligo (dT)
(Takara)为引物反转录获得的 cDNA 为模板，以
Anctin 基因为内标设计参比引物与沙冬青锌指蛋白
特异引物 PCR 扩增。20 μL PCR 反应体系循环:94
℃变性 5 min，以 94 ℃ 30 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1
min 进行 25 个循环，72 ℃ 延伸 15 min。取 5 μL
PCR 产物上样，用琼脂糖凝胶电泳分析检测，琼脂
糖凝胶用 紫 外 凝 胶 成 像 仪 扫 描，目 的 条 带 用
Quantity One4. 4 软件处理，计算相对表达量。锌
指特异引物:R5 5--CACggAAgTggATgTTggCTTgg--
3;R3 5--CTCCTT ggCATTggATgCTgACC--3。参比
引物:Acn5 5--ACC TTgCTggCCgTgATTTAA Cg--3;
Acn3 5--ATAgTggAC CCACCACTAAgCACg--3。
2 结果与分析
2. 1 cDNA 序列分析
以含有目的基因的大肠杆菌为模板，通过设定
的两对特异性引物进行 PCR 扩增，得到长度约为
700 bp 的目的条带，将 PCR 产物测序。测序结果分
析显示，cDNA 序列长度为 669 bp，编码 223 个氨基
酸(图 1)。
2. 2 生物信息学分析
2. 2. 1 氨基酸性质
用 Protparam 预测 AmZFPG 锌指蛋白的理化性
质，推测该蛋白相对分子质量为 24. 9 kD，等电点为
5. 88;理论推导半衰期为 30 h，不稳定参数为
53. 64，属于不稳定蛋白。蛋白二级结构预测表明，
锌指蛋白 AmZFPG 二级结构中螺旋、链和环分别占
7. 7%、2. 3%、90. 1%。
2. 2. 2 锌指蛋白 AmZFPG 的保守区域
将沙冬青锌指蛋白 AmZFPG 氨基酸序列于
NCBI(http:∥www. ncbi. nlm． nih． gov / Structure / cdd /
wrpsb． cgi?)进行氨基酸保守性分析，在氨基酸
149 ～ 174 残基间存在一个 ZnF_GATA 保守结构域，
初步断定，AmZFPG 锌指蛋白属于 GATA 结合蛋白
家族，其锌指结构的序列模式为:C-X(2)-C-X(17)-
C-X(2)-C。GATA 结合蛋白家族特异识别并结合
DNA 序列的 GATA 启动子元件，有些也可以结合蛋
白。与 植 物 同 类 GATA 锌 指 结 构 比 对 表 明，
AmZFPG 的锌指结构与其他植物的 GATA 结合锌指
蛋白具有高度的保守性(图 2)。
2. 2. 3 与逆境胁迫相关锌指蛋白的系统发生
为了进一步分析 AmZFPG 和其他植物抗逆锌
指蛋 白 之 间 的 进 化 亲 缘 关 系，选 取 拟 南 芥
(Arabidopsis thaliana)、玉 米 (Zea mays)、大 麦
(Hordeum)、大豆(Glycine max)、紫花苜蓿(Medicago
sativa)、念 珠 菌 球 虫 (coccidium)、柑 橘 (Citrus
reticulata)、粳稻(Oryza sativa)、葡萄(Vitis vinifera)、
毛果 杨 (Pinus trichocarpa)、丝 盘 虫 (Trichoplax
adhaerens)的锌指蛋白序列进行氨基酸同源性比较，
在此基础上构建系统进化树 (图 3)。结果表明，沙
冬青锌指蛋白 AmZFPG 与紫花苜蓿富含脯氨酸的
细胞壁蛋白(AAD03487. 1 )的亲缘关系最近;其次
22 北 京 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
图 1 AmZFPG 全长 cDNA 序列及氨基酸序列
Fig． 1 cDNA full sequence and corresponding amino acid sequence of AmZFPG
注:黑体的字母分别代表起始密码子和终止密码子;黑体且倾斜的字母代表锌指结构域;下划线部分是 DNA 结合区域。
图 2 AmZFPG 保守氨基酸序列及与同源氨基酸
序列的多序列比对
Fig． 2 Conserved amino acid sequence of AmZFPG
and multiple sequence alignment with that of other plants
注:ZFPG． 锌指蛋白氨基酸序列;Am． 沙冬青;Pv． 四季
豆(Phaseolus vulgaris CV533766． 1 );Lc． 百 脉 根
(Lotuscorniculatus FS352778． 1 );Gs． 棉 花 (Gossypium
hirsutum ES817339． 1 );Ca． 酸 橙 (Citrus aurantium
EY845842. 1);Et．绿玉树(Euphorbia tirucalli BP953627. 1);
Vv． 葡 萄 (Vitis vinifera EE081096. 1 );Sr． 蓖 麻 子
(Ricinuscommunis EG661229. 1)。
与玉米胁迫响应锌指蛋白 (ACG38807. 1)和粳稻锌
指蛋白(NP_001051719. 1)亲缘关系比较近。而与
念珠菌球虫锌指蛋白(EEB88778. 1)、柑橘胁迫响应
图 3 沙冬青锌指蛋白 AmZFPG 与其他已知逆境
胁迫相关锌指蛋白的系统发生分析
Fig． 3 Phylogenetic analysis of AmZFPG and other
reported stress-responsive zinc finger proteins
锌指蛋白(ABL67658. 1)、拟南芥锌指蛋白 AZF2、大
豆锌指蛋白 SCOF-1 等亲缘关系较远。
2. 2. 4 沙冬青锌指蛋白 AmZFPG 的功能预测
利用 SignalP(http:∥www. cbs． dtu． dk / services /
32第 3 期 史军娜等:沙冬青 GATA 型锌指蛋白基因序列及表达分析
SignalP)程序分析沙冬青锌指蛋白 AmZFPG 的 N 末
端序列，发现该蛋白没有信号肽结构。跨膜结构预
测(http:∥www． ch． embnet． org / software /TMPRED_
form． html)表明，该蛋白也不存在跨膜区。通过蛋
白质亚细胞定位软件 PSORT 预测发现 AmZFPG
可能存在于叶绿体基质、类囊体和线粒体中。通
过 ProtFun 进一步预测沙冬青锌指蛋白 AmZFPG
的主要功能，发现该蛋白有转录调控功能。综合
上述分析，推测沙冬青锌指蛋白与叶绿体、线粒体
中的特定靶 DNA 或靶蛋白结合，参与植物转录过
程调控。
2. 3 锌指蛋白基因 AmZFPG 在沙冬青胁迫处理叶
片中的表达
图 4 干旱胁迫下沙冬青叶片 AmZFPG 的表达
Fig． 4 Expression of AmZFPG in Ammopiptanthus
mongolicus leaves incubated under drought
注:A. 沙冬青幼苗干旱处理 0、1、2、3、4 d 后，RT-PCR 检测 AmZFPG
在干旱处理过的沙冬青叶片中的表达量;B. Quantity One 分析 PR-PC
结果中 AmZFPG 的条带，估测 AmZFPG 在干旱处理 0、1、2、3、4 d 的
沙冬青叶片中的表达量。
用 RT-PCR 来检测沙冬青在胁迫处理下的
AmZFPG 的表达模式(图 4、5)。AmZFPG 在对照和
经过低温、干旱处理的沙冬青叶片中均表达。在干
旱处理条件下，与对照相比，随着处理时间的延长，
沙冬青 AmZFPG 表达呈上调趋势，由此可以推断该
基因的表达是与干旱胁迫正向相关的。在低温 4 ℃
处理 2 h 后，AmZFPG 的表达量比对照表达量增大，
而 4 ℃处理 24 h 后，AmZFPG 的表达量比处理 2 h
的表达量减小，尽管此时的表达量仍比对照的表达
量高。这种现象可能与该蛋白的稳定性有关，这点
与前面对该蛋白的稳定性预测吻合。从低温处理的
结果可以推断，AmZFPG 的表达与低温相关，而且受
低温影响更大。
图 5 低温(4 ℃)胁迫下沙冬青叶片 AmZFPG 的表达
Fig． 5 Expression of AmZFPG in Ammopiptanthus
mongolicus leaves incubated at 4 ℃
注:A. 沙冬青幼苗 4 ℃处理 0、2、24 h 后，RT-PCR 检测 AmZFPG 在
低温处理过的沙冬青叶片中的表达量;B. Quantity One 分析 PR-PCR
结果中 AmZFPG 的条带，估测 AmZFPG 在低温处理 0、2、24 h 的沙冬
青叶片中的表达量。
3 结论与讨论
植物对逆境的适应涉及到基因的表达调控，尤
其是对低温和干旱等胁迫的抗逆反应是多个基因参
与的协同防御反应。植物在低温和干旱的逆境条件
下，通过一系列信号传递途径激发转录因子与相应
顺式作用元件结合，从而启动和调控特定基因的转
录表达。而锌指蛋白是真核生物中普遍存在的转录
因子，至今已发现了 4 种锌指蛋白(Zfp)。Ⅰ型为
Cys-X2-4-Cys-X3-Phe-X5-Leu-X2-His-X3-His，简 写
C2H2。Ⅱ型为 Cys-X \-2-Cys-X13-Cys-X2-Cys，简写
为 C4。Ⅲ 型 为 Cys-X2-Cys-X6-Cys-X5-6-Cys-X6-
Cys-X2-Cys，即 C6 结合 2 个 Zn2 +，酵母细胞的 GAL4
具有这类结构。识别 GATA 模体(motif)并与之结
合的 GATA 结合蛋白，是一个具有Ⅳ型锌指结构的
转录因子，其家族成员已发现在动物、真菌等生物中
广泛存在［12］。不论是动物还是真菌 GATA 结合蛋
白，都有相似的锌指结构及其下游碱性区，二者协同
完成转录激活功能。通过资料分析，植物中也具有
GATA 模体及其结合蛋白，也具有相似的锌指结构，
从而确定了植物中也广泛存在着 GATA 家族的Ⅳ型
锌指蛋白，它是通过与 DNA 序列中的 TATA 盒 /启
动子结合来调控相关功能基因的表达［13］。近几年
的研究表明，植物 GATA DNA 模体同光依赖及硝酸
根依赖的转录调控有关［14
--15］。
新近的研究表明，拟南芥两个 GATA 类转录因
42 北 京 林 业 大 学 学 报 第 33 卷
子 GNC 和 GNL，是赤霉素信号通路的阻抑蛋白，调
控拟南芥开花时间，叶绿素合成，种子萌发，叶片伸
展生长［16］，花的发育以及碳代谢与氮代谢［17］等生
理过程。但 GATA 型锌指蛋白是否调控植物抗非生
物胁迫基因的表达，未见相关研究报道。
本研究首次从沙冬青中获得 AmZFPG 基因，同
源性分析表明，其与紫花苜蓿富含脯氨酸的细胞壁
蛋白亲缘关系最近。氨基酸保守性分析及植物同类
GATA 锌指结构比对表明，AmZFPG 属于 GATA 结
合蛋白家族，且具有高度的保守性。
RT-PCR 分析显示，低温和干旱胁迫使 AmZFPG
基因表达量增加(图 4、5)，AmZFPG 可能与沙冬青
抵御低温和干旱胁迫性状的形成相关，即 AmZFPG
基因在逆境条件下被胁迫相关信号激发与相应的顺
式作用元件结合，激活 RNA 聚合酶Ⅱ转录复合物，
从而启动特定基因的转录表达，对内、外界信号做出
调节反应。但是该基因的表达对植物在受到逆境胁
迫时是否会提高植物的抗逆性还需要通过转基因等
其他实验进一步验证。目前，已经将该基因构建表
达载体，转入烟草中，以进一步研究转基因烟草的抗
寒、抗旱性的变化及该基因发挥调控作用的机制。
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(责任编辑 赵 勃)
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