全 文 ： 760　 第 二 军 医 大 学 学 报
Acad J S ec Mil Med Univ
　2006 Jul;27(7)
论　著
玄参中环烯醚萜 Epibueropyridinium A对醛糖还原酶的抑制作用
黄才国* , 魏善建 ,刘军华
(第二军医大学基础医学部生物化学和分子生物学教研室 ,上海 200433)
[ 摘要] 　目的:研究 Epibuer opy ridium A 对醛糖还原酶的抑制作用。方法:醛糖还原酶通过硫酸铵分级沉淀从牛眼晶状体
中提取 ,在含有 D L-甘油醛 、醛糖还原酶 、NADPH 的反应体系中 , 加入一定浓度的 Epibue ropyr idium A , 通过 340 nm 处光密度
的变化来反映 Epibueropy ridium A 对酶活性的抑制作用。阳性对照为依帕司他 ,采用双倒数作图的方法确定抑制类型 , 二次
作图法求 K i , 以抑制剂浓度对抑制率作图求 IC50 。结果:Epibueropy ridium A 能显著抑制醛糖还原酶的活性 , 为竞争性抑制 ,
其半数抑制剂量 IC50为 4. 2 μg /ml , K i值为 4. 88 μg /ml。结论:Epibuer opyridium A 是醛糖还原酶的竞争性抑制剂。
[ 关键词] 　Epibueropy ridium A;玄参;醛糖还原酶;酶抑制剂
[ 中图分类号] 　Q 285. 5　　　[文献标识码] 　A　　　[文章编号] 　0258-879X(2006)07-0760-03
Inhibitory effect of Epibueropyridium A extracted from scrophularia ningpoensis on aldose reductase
HUANG Cai-guo* , WEI Shan-jian , LIU Jun-hua (Depar tment of Bio chemist ry and M olecula r Bio log y , Co lleg e o f Basic Medical
Sciences , Second M ilitary Medical Univer sity , Shanghai 200433 , China)
[ ABSTRACT] 　Objective:To investig ate the inhibitory effect of Epibueropy ridinium A on aldose reductase. Methods:Aldo se
reductase w as ex tr acted f rom cattle cry stalline lens. Be sides Epibue ropy ridinium A , the reactive system also contained DL-g ly c-
er aldehyde , aldose reduc ta se , and NADPH. The activity changes of aldo se reductase w ere detected at 340 nm. Epalrestat w as
taken as the po sitive cont rol. The inhibito ry type , K i and IC50 w ere determined by double recipro cal plot , quadratic dr awing ,
and drawing of inhibito r’ s concentra tion to inhibito ry ratio , respectiv ely . Results:Epibue ropy ridinium A significantly inhibited
the activity of aldo se r eductase in a compe titiv e manner , w ith IC50 being 4. 2 μg /ml and K i being 4. 88 μg /ml. Conclusion:Epi-
bueropy ridinium A is compe titiv e inhibitor of aldo se reductase.
[ KEY WORDS] 　Epibue ropy ridinium A;scrophularia ningpoensis;aldo se reductase;enzyme inhibitor s
[ Acad J Sec M il Med Univ , 2006 , 27(7):760-762]
[ 基金项目] 　上海-SK 研究发展基金(2004004-t). Su pported by
S hanghai-SK Research and Development Foundation(2004004-t).
[ 作者简介] 　黄才国 ,副教授 ,硕士生导师.
*Corresponding autho r. E-mail:hu angcaig@h otmail. com
　　多元醇代谢通路在高血糖条件下的激活是糖尿
病并发症发生与发展的重要原因之一 ,该通路的关
键限速酶醛糖还原酶(aldose reductase ,AR)在高血
糖时 ,催化葡萄糖大量转化为不易透过细胞膜的山
梨醇 ,致使山梨醇在晶状体等组织中大量蓄积 ,引起
细胞渗透性损伤 ,最后导致糖性白内障的发生[ 1 , 2] ,
因此 AR可以作为糖性白内障药物治疗的作用靶
点。本实验研究从传统中药玄参中分离提取的环烯
醚萜成分对 AR的抑制作用。
1　材料和方法
1. 1　仪器和试剂　新鲜的牛眼购自上海牛羊肉公
司 ,硫酸铵购自上海化学试剂有限公司 , DL-甘油醛
和 NADPH(还原型辅酶 Ⅱ)为 Sigma 公司产品 ,依
帕司他片由扬子江药业集团提供(批号:20050302),
752C 紫外分光度计为上海分析仪器厂生产。
1. 2　玄参中 Epibueropy ridinium A 的分离提取　
玄参根细粉经 95%、60%乙醇回流提取 5 h后 ,合并
提取液 ,减压浓缩 ,浓缩液加水后分别用乙酸乙酯及
正丁醇萃取 ,正丁醇部分经大孔吸附树脂柱 、水以及
30%、60%、95%乙醇水溶液洗脱 , 分为 4 个部分 ,
30%、60%乙醇洗脱部分再经 Sephadex LH 20硅胶
柱层析 、C18反相柱(甲醇 ：水=3：7)分得单体化
合物。
1. 3　牛眼晶状体中 AR 的分离 　参照 Chakrarti
等[ 3] 报道的分离方法 ,所有步骤在<4℃和 5 mmol /
L β-巯基乙醇条件下进行 。牛晶状体称质量 ,组织
匀浆 ,离心(18 000 r /min , 30 min),收集上清 ,硫酸
铵分离沉淀 ,最后硫酸铵的饱和度为 75%,沉淀溶
解后透析 ,即得 AR粗提物 。
1. 4 　酶活性测定[ 4] 　反应液包括 pH6. 2 , 67
mmol /L 的钠钾缓冲液 , 5 mmol /L β-巯基乙醇 , 1
mmol /L 的 DL-甘油醛 , 0. 2 mmo l /L 的 NADPH ,
0. 6 mmo l /L 的硫酸锂 ,酶溶液 60μl ,反应总体积为
720 μl ,反应在 25℃中进行 ,以加入 DL-甘油醛为启
第 7期. 黄才国 ,等. 玄参中环烯醚萜 Epibu eropyridinium A 对醛糖还原酶的抑制作用 761　
动 ,以 340 nm 处光密度的下降量表示 AR活性 。上
述反应体系中再加入一定浓度(2. 0 、4. 0 、8. 0 μg /
ml)的 Epibue ropy ridinium A 溶液 ,阳性对照采用依
帕司他(1 μg /ml),空白对照中不加样品 ,反应同样
以加入DL-甘油醛为开始 。
1. 5　酶抑制动力学参数的测定　采用双倒数作图
的方法 ,确定抑制剂的抑制类型。利用二次作图法
求取 K i值 。通过抑制剂的不同浓度对抑制率作图 ,
求得半数抑制剂量 IC50 。
2　结　果
2. 1　化合物的结构鉴定　通过层析 ,共得到 11种
水 溶 性 成 分 , 运 用 IR 、 FABMS 、 1HNMR 、
1 3C NMR 、1 H-1HCDSY 、HMBC 、HMQC 、CD 等多
种光谱学方法鉴定它们的结构。其中 Bueropyridi-
mium A , Epibueropy ridinium A 、Bueropy ridim ium
B 、Epibueropy ridinium B 为首次发现的新化合物 ,
经过初步筛选 ,我们采用 Epibueropy ridinium A 进
行药理试验。
2. 2　反应体系有效性确定　改变底物 DL-甘油醛
的浓度 ,酶促反应速度变化呈矩形双曲线(图 1),证
明此条件下反应体系是有效的 。
图 1　底物 DL-甘油醛浓度与反应速度的关系
Fig 1　Relationship between concentration of
DL-glyceraldehyde and reaction velocity
2. 3　Epibueropy ridinium A 对 AR的抑制作用　
固定 DL-甘油醛的浓度为 1 mmo l /L , 改变 Epi-
bue ropy ridinium A 的浓度(2. 0 、4. 0 、8. 0 μg /m l),
测定 340 nm 处光密度值的变化 ,通过双倒数作图
(图 2),确定 Epibueropy ridinium A 的抑制类型为
竞争性抑制。
　　抑制常数 K i通过双倒数图的斜率对抑制剂浓
度作图 ,即二次作图法(图 3),求得 Epibueropy ri-
dinium A抑制 AR的 K i值为 4. 88μg /ml 。通过抑
制剂浓度对抑制率作图(图 4),求得半数抑制剂量
IC50为 4. 2 μg /m l。
图 2　Epibueropyridinium A抑制 AR双倒数图
Fig 2　Double reciprocal plot of Epibueropyridinium
A inhibiting aldose reductase
图 3　二次作图法求抑制常数 Ki
Fig 3　Ki was obtained through quadratic drawing
图 4　抑制剂 Epibueropyridinium A浓度对抑制率作图
Fig 4　Plot of EpibueropyridiniumA
concentration influencing inhibitory rate
3　讨　论
　　AR作为治疗糖尿病并发症的药物作用靶点 ,
自 20世纪 70 年代开始有多种 AR抑制药物面世 ,
1978年辉瑞公司开发出第一个在体内外均有较高
活性的海因类 AR抑制剂 sorbinil ,但由于严重的过
敏反应被迫中止了临床试验 ,继 so rbinil之后 ,一些
活性更强的同系物也陆续被合成 ,对治疗糖尿病性
白内障起到积极的作用。但由于是化学合成药物 ,
长期应用会有较大的不良反应 。
　　我国科学工作者也长期在天然的中草药中寻找
762　 第二军医大学学报　2006年 7月 ,第 27卷
AR的有效抑制剂 ,这类化合物主要为黄酮类 ,如槲皮
素 、水飞蓟宾 、陈皮苷 、葛根素 、五味子石油醚的提取
物木脂素 、笕桥地黄根的甲醇提取物环烯醚萜苷等对
AR均有抑制作用[ 5] 。玄参是著名的传统中药 ,使用
历史悠久 ,本课题组长期从事玄参植物化学成分和药
理作用的研究 ,证明其主要有效成分为环烯醚萜苷类
化合物 ,获得十几个新的化合物 ,并首次发现 Epi-
bueropyridinium A体外对醛糖还原酶有较强的抑制
作用 ,有望开发成为新的治疗糖性白内障的药物。
[参 考 文 献]
[ 1] 　刘小鹏 ,文格波. 醛糖还原酶研究进展[ J] . 南华大学学报 医
学版 , 2004 , 32:94-96.
[ 2] 　Mis t ry KP , Bey MA , Diecke FP. Mechanism for D-glucose in-
hibi tion of myo-inositol inf lur into rat lens[ J] . Diabetes , 1993 ,
42:1737-1741.
[ 3] 　Chak rabart i S , Sima AA , Nakajima T , et al. Ald ose redutas e
in the BB rat:i solation , immun ological iden tif ication and locali-
zation in the retina and periph eral erve[ J] . Diabetologia , 1987 ,
30:244-251.
[ 4] 　杨　喆 ,余利岩 ,宋　京 , 等.醛糖还原酶抑制剂筛选模型的建
立和初步应用[ J] .中国抗生素杂志 , 2002 , 27:193-194.
[ 5] 　王　琦 ,周玲仙 ,罗晓东.植物中醛糖还原酶抑制剂的研究进展
[ J] . 中草药 , 2005 , 36:298-303.
[ 收稿日期] 　2006-03-30　　 [ 修回日期] 　2006-06-26
[ 本文编辑] 　尹　茶
个案报告
小肠克罗恩病一例报告
Small intestine Crohn’ s disease:a case report
余梦楠 ,叶　萍 (第二军医大学长海医院消化科 ,上海 200433)
[ 关键词] 　克罗恩病;小肠;病例报告
[ 中图分类号] 　R 574. 5　　　[ 文献标识码] 　B　　　[文章编号] 　0258-879X(2006)07-0762-01
1　病例资料　患者女性 , 27 岁 ,江苏人。因“便血 12 d , 加重
3 d”急诊收入院。患者于 12 d 前无明显诱因出现大便呈暗
红色血样 , 2 ～ 3 次 /d , 总量约为 500～ 800 g , 排便时伴下腹部
不适 ,到当地医院给予对症治疗(具体不详), 无明显好转 , 3 d
前上述情况加重 , 大便中含有暗红色血凝块 , 伴头晕 、乏力 ,
无呕吐 ,无发热 、腹痛 , 黄疸。 急诊行胃镜示浅表性胃炎 , 未
见出血灶。肠镜未见明显异常。急诊行肠系膜上 、下动脉造
影检查仍未见明显异常。为进一步治疗转入我科 。入院查
体:重度贫血貌 , 皮肤巩膜未见黄染 , 全身未触及肿大的淋巴
结 ,双肺未见异常 , 心率 100 次 /min , 未闻及病理性杂音 , 腹
软 ,无明显压痛及反跳痛 , 无腹块 , 腹水征阴性 , 肠鸣音活跃。
查血色素 79 g /L ,予禁食 、补液 、输血 、止血 、抗感染等积极治
疗 ,但患者病情仍不断加重 , 每天便血总量仍在 1 000 ml以
上 , 7 月 20 日到外院行小肠镜检查 , 发现回肠内多个节段性
浅表溃疡形成 ,大小不规则 , 部分呈纵行 , 溃疡周边有较明显
的充血水肿和肉芽组织增生改变 , 诊断为回肠克罗恩病。取
活检病理提示符合克罗恩病。经给予输液 、输血 , 激素加 5-
氨基水杨酸治疗后 , 大便出血停止 , 病情稳定出院 。既往有
“痔疮”病史 , 2 个月前有“肛瘘切除术”病史。
2　讨　论　克罗恩病是一种病因不十分明确的胃肠道慢性
炎性肉芽肿性疾病 , 多见于回盲部 , 临床上以腹痛 、腹泻 、腹
块 、瘘管形成和肠梗阻为特点 , 可伴有发热 、贫血 、营养障碍
及关节 、皮肤 、眼 、口腔黏膜 、肝脏等肠外损害 ,发病年龄多在
15 ～ 30 岁 ,以欧美多见 , 我国发病率不高 , 但并非罕见 。诊断
上主要依据临床表现和 X线检查与结肠镜检查所见进行综
合分析 , X线表现为肠道炎性病变 ,可见黏膜皱襞粗乱 、纵行
性溃疡或裂沟 、鹅卵石征 、假息肉 、多发性狭窄 、瘘管形成的 X
线征象 ,病变呈节段性分布;结肠镜作全结肠及回肠末段检
查 ,并变成节段性分布 , 见纵行或匐行性溃疡 , 溃疡周围黏膜
正常或呈鹅卵石样 ,肠腔狭窄 ,炎性息肉 , 病变肠段之间黏膜
外观正常。病理提示为非干酪样肉芽肿。在临床上与肠道
结核病和肿瘤的鉴别较为困难 , 往往需行手术探查以及病理
方明确诊断。
　　本患者为青年女性 , 临床表现不典型, 以消化道出血就
诊 ,且以大量便血为主 ,无呕血 、发热 、腹痛等症状 ,即往无胃肠
道疾病病史 ,否认肝胆系统疾病;对于消化道出血患者 ,胃镜可
排除消化性溃疡 、胃癌 、食管胃底静脉曲张破裂出血等引起上
消化道出血的疾病;肠镜可除外结肠癌、溃疡性结肠炎等病变;
对小肠引起的出血 ,肠系膜上、下动脉造影可了解有无小肠血
管畸形 、小肠肿瘤等引起出血并判断出血部位。对于上述检
查均为阴性的患者 ,考虑行双气囊推进式小肠镜检查。
　　小肠克罗恩病的临床表现较为多样 , 以消化道出血为首
发 、突出症状者 ,在临床上实属少见 , 尤其是常规胃镜 、肠镜
及肠系膜上 、下动脉造影检查均为阴性患者 , 诊断非常困难。
临床医生对青年患者 , 无明显诱因出现消化道出血患者 , 要
考虑到小肠克罗恩病的可能性 , 有条件者可行双气囊推进式
小肠镜辅助诊断 , 或行小肠气钡双重造影以明确病变的部位
及诊断。
[ 收稿日期] 　2005-12-04　　 [ 修回日期] 　2006-07-03
[ 本文编辑] 　曹　静
[ 作者简介] 　余梦楠 ,第二军医大学临床医学院 2002级学员.