全 文 ：分子植物育种,2006年,第4卷,第1期,第45-48页
MolecularPlantBreeding,2006,Vol.4,No.1,45-48
研究报告
ResearchReport
利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐
赵万苓 1* 姜世平 1 付新生 1 朱永莉 2 杨奎姝 1
1天津市园林绿化研究所,天津,300181;2上海商学院,上海,200235
*通讯作者,zhaowanling298@sohu.com
摘 要 本项研究通过植物基因工程技术,以改变花色为目的,对花卉进行遗传改良,以期产生新的花色品
种,来改变现有花卉花色单一、品种缺乏的现状,丰富我市花卉品种资源。在应用转基因技术进行定向改良
花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查尔酮合酶基因。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色
素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量可能影响花的颜色。本项目以查尔酮合酶(Chalconesyn-
thase,CHS)基因作为目的基因,以大岩桐为研究对象。具体从矮牵牛(Petuniahybrida)特定发育阶段的花瓣的
cDNA中,克隆到查尔酮合酶基因CHSA,进行质粒的重组后,插入到含有花椰菜花叶病毒 CaMV35S启动
子的植物中间表达载体中pBI121中,转化农杆菌LBA4404。通过农杆菌介导法(之叶盘法)遗传转化大岩桐,
具体过程如下:农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养 →农杆菌与大岩桐叶盘共培养 → 脱菌筛选→ 抗性芽
的扩繁与继代培养→抗性株的生根筛选→移栽成活。经过研究,成功地得到大岩桐转化植株,其中8个株
系的转基因植株经PCR检测呈阳性,证明外源基因已整合进入受体植物。有一株玫红品系植株的花瓣上出
现了白色的不规则斑点。
关键词 查尔酮合酶基因(CHSA),大岩桐,农杆菌介导法
IntroductionofChalconeSynthase-A(CHSA)GeneintoSninningiaspeciosa
viaAgrobacterium-mediatedTransformation
ZhaoWanling1* JiangShiping1 FuXinsheng1 ZhuYongli2 YangKuishu1
1TianjinLandscape-gardeninginstitute,Tianjin,300181;2ShanghaibusinessSchool,Shanghai,200235
*Corespondingauthor,zhaowanling298@sohu.com
Abstract Theaimofthisstudywastomodifyofflowercolorviageneticengineering.Thenewfloriculturevari-
etywithnovelflowercolorwouldbeproducedbyheredityimprovement.Thecurentstatusofmarketinourcity
thatthesinglenessofflowercolorandlackofvarietieswouldbeimprovement,andthefloriculturegermplasmre-
sourceswouldbealsoabundant.TheChalconesynthasegene(CHS)isthefocusgeneinthestudiesofdirectional
modificationofflowercolorbytransgenictechnology.TheCHSisakeyenzymeinthebiosynthesispathwayofal
classesofpigment,andthevariationofitsexpressionmightafectthecolorofflowers.Inthisstudy,CHSAgene
wasclonedfromflowerspetalsofpetunia(Petuniahybrida)justcomingintobloomandtheninsertedintothe
plantexpressionvector-pBI121,whichcontainsCaMV35Spromoter.Thentherecombinantvectorcontaining
CHSAgenewastransformedAgrobacteriumtumefaciensLBA4404.TransgenicSninningiaspeciosawereobtained
usingtheAgrobacterium-mediatedleaf-disctransformation.Thedetailedtransformationprocessisasfolows:cul-
tureofAgrobacteriumLBA4404pBI121chsA→co-cultureofAgrobacteriumandleafdisc→washingbacteriumand
screeningforantibiotic-resistance→cloneandmultiplicationcultureofresistantshoots→rootinductionculture
ofresistantshoots→transplantofresistantseedlings.Throughanalysis,itwasprovedthateightofthattransgenic
SninningiaspeciosaplantswerePCR-positive.WhitespecklestookonthepetalsinoneRose-redplantamong
them.
Keywords Chalconesynthase-A(CHSA)gene,Sninningiaspeciosa,Agrobacterium-mediatedtransformation
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
花色的形成与植物体内花色素的合成及液泡的
PH值有关(赵云鹏等,2003),所涉及到的有关基因很
多。在花色形成中起最主要作用的是花色素,花色素
的增高或降地都可能改变花的颜色(Stevenson,
1990)。查尔酮合酶(Chalconesynthase,CHS)是花色
素合成途径中的一个关键酶,它在植物中表达的量
可能影响花的颜色。在应用转基因技术进行定向改
良花色的研究中用的最多也最成功的基因就是:查
尔酮合酶基因(赵云鹏等,2003)。CHS是由多基因编
码的,矮牵牛的 CHS基因家族共有 8~10个成员
(Koesetal.,1989a;邵莉等,1996)。在植物正常发育过
程中,只有 CHSA和 CHSJ能被表达,并且这种表达
限于花组织中(花冠、花粉管和花药),其中由 CHSA
转录的mRNA占总CHSmRNA的90%。在幼苗中,
CHSA、CHSJ以及 CHSB、CHSG基因可以被紫外线
诱导表达(Koesetal.,1989b;邵莉等,1996)。本研究通
过植物基因工程技术,以改变花色为目的,利用查尔
酮合酶基因(CHSA)对大岩桐进行遗传转化,以期产
生新花色品种。
1材料和方法
1.1材料
菌株采用根癌农杆菌 Agrobacterieatumefaxiens
LBA4404pBI121chsA,质粒为pBI121chsA。
植物材料采用重瓣大岩桐 (Sninningiaspeciosa)
“ 玫红色”品系和“ 玫红白边”品系,栽培基质采用蛭
石和珍珠岩。
1.2试剂和酶
植物总 DNA提取及 PCR反应试剂、TaqDNA
聚合酶以及培养农杆菌的生物试剂等均购自鼎国
生物公司,PCR反应引物购自联星生物试剂公司,
卡那霉素等生物试剂和耗材购自鼎国生物公司和
联星生物试剂公司,组培用试剂和其它试剂均为国
产分析纯。
1.3遗传转化
采用农杆菌介导法进行遗传转化,具体采用叶
盘法。
1.3.1农杆菌LBA4404pBI121chsA的培养
(1)取 10mlLB液体培养基,加入抗生素——卡
那霉素和利福平,使其终浓度为 K+100mg/L,Rif+
80mg/L。从新鲜平板中挑取单菌落加入其中,摇匀
(如必要,可旋涡混匀),于28℃,180r/min过夜培养至
对数期。
(2)将菌液用LB液体培养基或1/2MS稀释10
倍左右,再摇约4h,备用。
1.3.2共培
(1)将摇好的菌种再稀释 3~4倍,至菌液略显混
即可,备用。
(2)取大岩桐组培苗中、上部的叶片,沿叶缘剪一
圈,大叶脉处划一道儿,置于菌液中浸3min左右。
(3)取出叶片,在无菌滤纸上吸干多余的菌液,叶
背朝上置于纯MS培养基上,培养3~5d。
1.3.3脱菌筛选
(1)将叶片从共培培养基中取出,放入无菌水中
浸洗 (如菌生长过多,可在无菌水中加入羧苄或噻
孢),用滤纸吸干。
(2)然后转入抗性直接分化培养基上,进行脱菌
与筛选培养。
培养基①:MS+BA1mg/L+NAA0.1mg/L+LH
200mg/L+K+300mg/L+Carb+(或Cef+)500mg/L
1.3.4抗性芽的扩繁与继代培养
(1)将培养基①上再生的大于1cm的卡那霉素抗
性芽切下转置抗性继代培养基②和③上。
培养基②:MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+LH
200mg/L+K+300mg/L+Carb+(或Cef+)250mg/L
培养基③:MS+BA0.3mg/L+IBA1.5mg/L+K+
300mg/L+Carb+(或Cef+)250mg/L
(2)将在抗性继代培养基②和③上长至 2~3cm
的植株再继代(Carb+或Cef+减半)。
(3)还可将抗性继代培养基上长出的大苗的叶片
反接于抗性分化培养基上(抑菌抗生素适当逐减),促
其分化,再扩繁和继代。
1.3.5抗性株的生根筛选
将抗性继代培养基②和③上长至2~3cm的植株
移入抗性生根培养基④或⑤上 ,做生根与筛选。
培养基④:MS+K+300mg/L+Carb+(或 Cef+)
125mg/L
培养基⑤:1/2MS+IBA0.2mg/L+K+300mg/L+
Carb+(或Cef+)125mg/L
1.3.6出苗移栽
将在加有抗生素的生根培养基上生根的苗在常
温下放置 3d,再在移栽温室开盖炼苗3d。将炼过的
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苗从瓶中取出,洗去琼脂,栽入 6:4的蛭石 /珍珠岩
混合基质中,用0.1%的高锰酸钾浇透,遮荫养护。
1.4转基因植株的分子检测
(1)使用 CTAB(王关林和方宏筠,1998)法提取
植物总DNA。
(2)PCR扩增:以提取的总DNA为模板,以NPTI
为引物,进行PCR扩增,引物序列为:
5端引物:5-AGGCTATTCGGCTATGACTGG-3
3端引物:5-GCGGTCCGCCACACCCAGCCG-3
(3)PCR产物电泳检测:琼脂糖凝胶的浓度为
0.8%。
2结果与分析
2.1转基因植株的获得
采用叶盘法对大岩桐的叶片侵染后,可直接放
入脱菌筛选培养基中进行立即选择培养,20多天后
开始在个别叶的叶柄等处长出不定芽,继续培养不
定芽可长大。而对照叶片未有不定芽长出。大于1cm
的卡那霉素抗性芽均可成功地进行继代与增殖培
养。将生长至2~3cm的植株移入抗性生根培养基进
行生根与筛选培养,多数转化植株生根正常,少数不
能生根从而做为假转化体被排除。炼过的苗移栽后,
成活率明显低于未做基因导入的植株。
2.2转基因植株的PCR检测
因为植物自身含有CHSA基因,可通过检测选
择标记基因NPTⅡ,进而知道外源CHSA基因是否
整合。将经过多次筛选的植株提取植物总 DNA,以
NPTⅡ基因引物进行PCR扩增,以阳性质粒为对照,
其中一次电泳检测结果见图1。从图1可见,样品1、
2和3在预期的约600bp的位置有条带,说明外源基
因已整合进去了。本研究中共有8个株系的转基因
植株经PCR检测呈阳性。
2.3转基因植株表现型的改变情况
进行转基因操作得到的后代显蕾后普遍生长很
慢,比对照晚约一个月。开花后,有1株玫红品系植
株的花瓣上出现了白色斑纹(图2)。
3讨论
在研究工作中我们发现,植物遗传转化的成功
首先依赖于良好的植物转化受体系统的建立。植物
进行基因转化后,如何有效选择和筛选转化体也是
图1转基因植株的PCR检测
注:M:!/EcoRⅠ,HindⅢ;+:为正对照 pBⅠ121chsA;1~3:阳
性样品
Figure1PCRassayofNPTⅡgeneoftransgenicplangts
Note:M:/EcoRⅠ,HindⅢ;+:Positivecontrol(plasmidpBI121
chsA);1~3:Positiveplangts
图2 玫红色花的花瓣镶上出现了白色斑纹
Figure2WhitespecklestookonthepetalsinoneRose-redplant
一个很重要的问题。因此,构建植物基因工程载体
时,为便于转化体的选择和筛选,在连入目的基因的
同时,插入了标记基因。另外,对抗生素不太敏感的
植物材料,进行基因操作后立即加入选择压、使用抗
生素进行多次筛选、在生根培养基上进行筛选等,可
以有效筛选转化体,避免假阳性。
我们还发现,转基因植株长势普遍稍低于未做
基因导入的植株,转基因植株的抗性也较差,分析这
些情况的发生,考虑可能与受基因操作有关,可能是
外源基因带来的影响,或许操作中使用的生物试剂
也会影响植物本身。
在国内,我们首次应用查尔酮合酶基因,采用农
杆菌介导法对大岩桐成功地进行了遗传转化,得到
了转化植株,其中一株玫红品系植株开花时表现型
得到了改变。由于任何开花植物体内自身均含有
CHSA基因,当外源 CHSA基因导入植物后,会因为
利用农杆菌介导法将查尔酮合酶基因导入大岩桐
IntroductionofChalconeSynthase-AGeneintoSninningiaspeciosaviaAgrobacterium-mediatedTransformation
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分子植物育种
MolecularPlantBreeding
内外源基因相同或同源性很高而发生一种叫“ 共抑
制(cosuppression)”的现象,从而导致内外源基因均不
会得到表达。vanderKrol等曾报道使用反义CHS基
因抑制色素合成系统,结果使得矮牵牛的花色由紫
色变成白色 (vanderKroletal.,1988)。北大曾利用
CHSA基因转化矮牵牛,使花色变为白色或紫白相
间(邵莉等,1996)。我们用CHSA基因转化仙客来,结
果 8株白花植株的花瓣出现了黄斑或略显黄色,个
别花瓣变成了黄色花瓣;3株白花植株的个别花瓣出
现了桃红色条带(二乔),甚至整个花朵完全变成了桃
红色。
通常情况下,当外源基因整合进受体植物后,要
经过转录和翻译,表现型才有可能改变。但是我们转
入的是植物自身含有的基因,因而共抑制的发生情
况要复杂的多。另外,也有报道说,pH、外界环境因素
等对花的显色也有可能起到一定的影响。
致谢
本项目由天津市应用基础研究重点项目
(033803611)资助。感谢北京大学生命科学院博士后
导师李毅老师在试验研究中给予的大力支持与指
导;感谢北京大学生命科学院门淑珍博士、蔡国林博
士、朱士峰博士、杜云龙博士在试验研究中给予的支
持与帮助;感谢本所刘亮梅、刘凤琴、陈广萍同志细
心养护实验植物材料大岩桐。
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〔 美〕CM费雷泽TD里德 KE纳尔逊 编
许朝晖 喻子牛 主译
科学出版社2006年1月出版ISBN7-03-015664-1定价:75.00
本书是由微生物基因组学开创者们撰写,重点介绍了10年来微生物学转
向全基因组序列研究的进展,包括微生物基因组学历史,作为基因组学工具的
生物信息学,核心功能,微生物基因组的进化,微生物基因组的调查和基因组数
据库的应用共6个部分,所有内容均涉及本学科前沿,作者们现身说法,深入浅
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