全 文 ：抗肿瘤作用(P ＜ 0． 05) ，这说明 5F制成 5F － Na盐注射液后仍然
能保持其原有的抗肿瘤活性，且对体内荷瘤小鼠的肿瘤生长有明
显的抑制作用。
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收稿日期:2010-05-19; 修订日期:2010-10-25
基金项目:国家自然科学基金 (No． 30873364) ;
吉林省科技厅科研项目(No． 200905109) ;
吉林省教育厅“十一五”科研项目(No． 2008 － 167，2008 － 170)
作者简介:刘质净(1983-) ，女(汉族) ，黑龙江齐齐哈尔人，现为黑龙江中
医药大学在读硕士研究生，学士学位，主要从事天然产物化学研究工作．
* 通讯作者简介:刘春明(1964-) ，女(汉族) ，吉林通化人，现任长春师范
学院教授，博士学位，主要从事天然产物化学研究工作．
玄参中苯乙醇苷化合物的高效逆流色谱技术分离
刘质净2，李 丽1，桂语歌1，闫 静2，刘春明1*
(1．长春师范学院，吉林 长春 130032;2．黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)
摘要:目的 应用高效逆流色谱技术分离玄参中的苯乙醇苷化合物。方法 采用高效逆流色谱，以醋酸乙酯∶ 正丁醇∶ 乙
醇∶ 水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2)为溶剂体系，分离玄参中的苯乙醇苷类化合物，流速 3 ml /min，检测波长 320 nm。结果 分离得到
麦角甾苷和安格洛苷 C化合物纯度达 90%以上。结论 应用高效液相色谱技术和电喷雾质谱可快速鉴定化合物结构。
关键词:高效逆流色谱; 玄参; 苯乙醇苷化合物
DOI标识:doi:10． 3969 / j． issn． 1008-0805． 2011． 03． 012
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1008-0805(2011)03-0549-03
Isolation and Purification of Phenylethanoid Glycosides from the Scrophularia ningpoensis
by High － performance Counter － current Chromatography
LIU Zhi-jing2，LI Li1，GUI Yu-ge1，YAN Jing2，LIU Chun-ming1*
(1． The Central Laboratory，Changchun Normal University，Changchun 130032，China;2． Heilongjiang Universi-
ty of Traditional Chinese Medicine，Harbin 150040，China)
Abstract:Objective To isolate and purify two phenylethanoid glycosides，acteoside and angroside C from the Scrophularia ning-
poensis by high － performance counter － current chromatography(HPCCC)．Methods The HPCCC solvent system was consisted of
ethyl acetate － n － butanol － ethanol － water (1:1:0． 1:2，v:v:v:v) ，the flow rate was at 3． 0 ml /min，and the effluent was detec-
ted at 320nm． Results Acteoside and angvoside were isolated with purity at over 90% ． Conclusion The structures can be identi-
fied by HPLC and ESI － MSn in the negative mode．
Key words:HPCCC; S． ningpoensis; Henylethanoid glycosides
玄参为玄参科植物玄参 Scrophularia ningpoensis Hemsl．的干
燥根，是常用的传统道地药材之一［1］。玄参又名元参、黑参、浙
玄参，始载于《神农本草经》，列为中品，性微寒，味甘、苦、咸，归
肺、脾、肾经，具有凉血滋阴、泄火解毒等功效，可用于热病烦渴，
发斑，骨蒸劳热，夜寐不宁，自汗盗汗，津伤便秘，吐血衄血，喉咙
肿痛，痈肿，瘰疬等症［2］。
高效逆流色谱技术(High － performance counter － current chro-
matography，HPCCC)是一种新型的液液色谱技术，可以在短时间
内实现目标化合物的高效分离和制备，并且可以达到几千个理论
塔板数［3，4］。由于其不同于高效液相色谱，不使用固相载体作为
固定相，从而克服了固相载体带来的样品吸附、损失、污染和峰形
脱尾等缺点［5］，具有回收率高，制备量大等优点，是一种理想的
制备分离手段［6］。目前尚未见应用高效逆流色谱技术分离玄参
中苯乙醇苷化合物的报道。本文采用高效逆流色谱技术分离了
玄参中的两种苯乙醇苷化合物，即麦角甾苷和安格洛苷 C，并根
据液相色谱的保留时间和电喷雾质谱碎裂规律鉴定了化合物的
结构。
1 试剂与仪器
玄参 Scrophularia ningpoensis 药材购于北京同仁堂药店(长
春分店) ;HPCCC所用试剂均为分析纯试剂，购于北京北化精细
化学品有限责任公司;HPLC 所用试剂为色谱纯试剂(Laborato-
riesL，加拿大) ;麦角甾苷(Acteoside)从车前子药材中分离制
备［7］;水为超纯水(18． 2ΩPa) ，0． 45μm滤膜(安捷伦公司)。
高效逆流色谱(Spectrum HPCCC，England，Dynamic extrac-
tion) ;逆流色谱泵(Smartline Pump 100，Germany，KNAUER ) ;检
测器 (Smartline UV Detector 2500，Germany，KNAUER )。高效液
相色谱实验采用 Agilent Technology 1100 Series HPLC 系统，二极
管阵列检测器(photodiode array detector，DAD) ;Phenomenex ODS
－ C18色谱柱 (150 mm ×4． 6 mm，5 μm)和 C18保护柱。质谱分
析采用 Finngan LCQ ion － trap 电喷雾离子阱质谱(MAT，San Jo-
se，CA，USA)。
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LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL ． 22 NO． 3 时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 3 期
2 方法
2． 1 样品制备 称取玄参药材粉末 500 g，用 1 500 ml，80%乙醇
室温下浸泡提取 5 次，每次提取 12 h。将 80%乙醇提取液过滤，
合并滤液。减压回收乙醇溶液，蒸至 300 ml(水液)。水液部分
用正己烷脱脂 2 次，300 ml /次，弃去正己烷溶液，水液部分再用
水饱和正丁醇萃取 5 次，300 ml /次，合并正丁醇层，减压回收至
干(＜ 40℃) ，得到正丁醇提取物 6． 724 g。取出 150 mg进逆流色
谱，用醋酸乙酯 －正丁醇 －乙醇 －水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2，V∶ V∶ V∶
V)溶剂系统洗脱，流出物用于 HPLC和 ESI － MSn 分析。
2． 2 HPCCC溶剂体系的选择 根据苯乙醇苷化合物化学性质选
择了 6 种溶剂系统。称取大约 1 mg 玄参正丁醇提取物(6 份) ，
分别加入到 6 个 10 ml试管中，加入 2 ml 的固定相和流动相 (V
∶ V，1∶ 1) ，振摇 1 min后静止，待分层后，分别取出 100 μl 上层
和 100 μl下层溶剂，减压蒸干后(＜ 40 ℃) ，用 500 μl甲醇溶解
后过滤，通过 HPLC － DAD 测量溶质在两相中的质量浓度之比，
得到目标化合物的分配系数 K，列于表 1。
表 1 化合物在不同溶剂体系中的 K值
溶解系统 1 2 3 4
醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水
(4∶ 0． 6∶ 0． 6∶ 5)
0． 86 － 0． 16 0． 18
醋酸乙酯-乙醇-水(5∶ 0． 5∶ 4． 5) 0． 20 0． 34 0． 05 0． 15
醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水 (1∶ 1∶ 0． 1∶ 2) 1． 98 1． 89 1． 67 1． 59
醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水
(0． 2∶ 0． 8∶ 0． 1∶ 1)
3． 66 3． 36 2． 12 2． 05
正乙烷-醋酸乙酯-正丁醇-乙醇-水
(0． 5∶ 0． 5∶ 1∶ 0． 1∶ 2)
1． 13 0． 61 0． 33 0． 40
醋酸乙酯-正丁醇-水(4∶ 1∶ 5) 0． 33 0． 2 0． 22 0． 27
根据表 1，醋酸乙酯∶ 正丁醇∶ 乙醇∶ 水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2，V
∶ V∶ V∶ V)溶剂体系，大致满足高效逆流色谱溶剂体系对分配
系数 0． 5 ～ 2． 5 之间的要求，所以选用醋酸乙酯∶ 正丁醇∶ 乙醇
∶ 水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2，V∶ V∶ V∶ V)溶剂体系。
2． 3 HPLC分析条件 实验采用二元线性梯度洗脱，流动相组成
为已腈(A)、0． 5%的醋酸水溶液(B) ，梯度洗脱程序:0 ～ 1 min，
90% ～90%B;1 ～ 30 min，90% ～ 70% B;30 ～ 35 min，70% ～ 30%
B;35 ～ 40 min，30% ～90%B。流速为 0． 8 ml /min，样品分析时间
为 40 min。检测波长为 320 nm，柱温为 25 ℃。样品进样量为 10
μl。
2． 4 质谱分析条件 质量范围 50 ～ 2000，实验前质量数经过校
正;实验中采用负离子模式，样品通过流动注射泵进样，流速
5μl /min，喷雾电压为 4kV，毛细管温度为 200℃;鞘气为氮气，碰
撞气为氦气;碰撞诱导解离(CID)的碰撞能量为 20% ～28%。
3 结果与讨论
3． 1 高效逆流色谱分离
(1)R1 = Rham，R2 = H，R3 = H，R4 = H;
(2)R1 = Rham，R2 = arabinosy，R3 = Me，R4 = Me
(1)Acteoside (2)Angroside C
图 1 麦角甾苷(1)安格洛苷 C(2)化合物结构式
醋酸乙酯∶ 正丁醇∶ 乙醇∶ 水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2，V∶ V∶ V∶
V)充分混合并在分液漏斗中达到平衡后，取上层溶液作为固定
相，以 9 ml /min的速度泵入螺旋管使之充满。之后调节逆流色
谱转速为1 500 r /min．，之后以 3 ml /min 的速度泵入水液(从柱
头到柱尾) ，作为逆流色谱分离的流动相。当流动相从柱出口流
出，两相达到平衡状态后，称取 150 mg玄参粗提物溶解在 4 ml醋
酸乙酯:正丁醇∶ 乙醇∶ 水(1∶ 1∶ 0． 1∶ 2，V∶ V∶ V∶ V)混合溶
剂中，通过进样阀注射到样品管中。样品经过 HSCCC分离，流出
液经紫外检测器(UV detector，320 nm) ，根据液相色谱保留时间，
合并相同的组分。将含有相同化合物的峰合并，旋转蒸发至干，
经高效逆流色谱设备进行二次分离，纯化。得到的纯化物用
HPLC和 ESI － MS分析。检测玄参正丁醇提取物的 HPCCC － UV
色谱分离效果如图 2 所示。
图 2 玄参正丁醇提取物的 HSCCC － UV谱图
3． 2 化合物结构鉴定 应用高效液相色谱技术结合二极管阵列
检测器分别对高效逆流色谱分离出的每个峰进行检测，并与玄参
粗提物和混合标准品样品的色谱图比较，如图 3 ～ 4 所示。检测
结果为图 4 中的峰 1 和峰 3 一次分离纯度可达到 80%以上。峰
3 浓缩物再经 HPCCC 用相同的溶剂系统纯化后，纯度可达到
95%以上，而峰 1 浓缩物再采用高效逆流色谱用正己烷∶ 醋酸乙
酯∶ 正丁醇∶ 乙醇∶ 水(0． 5∶ 0． 5∶ 1∶ 0． 1∶ 2)溶剂系统纯化，
纯度可达到 91%以上。根据图 3 中麦角甾苷标准品与 3 号峰的
保留时间可推断 3 号峰可能为麦角甾苷。
图 3 玄参粗提物和 acteoside，isoacteoside对照品的 HPLC图
图 4 应用 HPCCC分离得到的 2 个峰和玄参正丁醇提取物的色谱图
对合并峰 1 得到的较纯化物和合并峰 3 得到的较纯化物
(图 2)以及 acteoside 和 isoacteoside 两种标准化合物进行了串联
质谱研究，ESI － MSn 分析结果见表 2。
从表 2 可以看出，这些化合物在多级串联质谱中表现出一些
类似的质谱研究，如水分子(分子量 18)、咖啡酰基或端基六碳糖
基(分子量 162)或端基脱氧六碳糖(分子量 146)等中性碎片的
丢失，另外还容易产生苯乙醇苷脱氢离子等，这些特征中性碎片
的丢失和产生的一些特征的碎片离子为有效鉴定该类化合物提
供了重要的结构信息。
峰 1 化合物在 ESI 一级全扫描负离子模式下，得到 m/z783
·055·
时珍国医国药 2011 年第 22 卷第 3 期 LISHIZHEN MEDICINE AND MATERIA MEDICA RESEARCH 2011 VOL． 22 NO． 3
( ［M － H］－)准分子离子，可推断其分子量为 784。在 MS2 谱中
可以观察到两个主要的碎片离子峰，分别为 m/z607，589(图
5A)。m/z607 离子是 m/z783( ［M － H］－)离子丢失 176 的中性
碎片(阿魏酰基)形成的。m/z589 离子可能是由 m/z783 离子先
丢失 176 的中性碎片，再继续丢失质量数为 18 的碎片形成。在
MS3 负离子谱中(图 5B) ，m/z 607 离子继续碎裂生成 m/z 461 和
443 的离子峰。其中 m/z461 离子为基峰，是由 m/z607 离子丢失
146的中性碎片(端基脱氧六碳糖基)产生的。m/z 443 离子可能
是由 m/z607 先丢失 146，再丢失 18(H2O)的中性碎片生成。根
据峰 1 在质谱中获得的分子量数据及其 MSn 碎裂规律与文献中
angroside C的分子量［8，11，13］及结构式［图 1(2) ］对比分析，可推
断化合物 1 为 angroside C。
表 2 化合物 1，2 在峰 1 和峰 3 中的电喷雾质谱碎裂规律
compounds ［M － H］－ 分子量 MS2 MS3
麦角甾苷 623 624 461 315，161，135
异麦角甾苷 623 624 461 315，161
峰 1 783 784 607 461，443
589 461，443
峰 3 623 624 461 315，297，179，161，135
图 5 m /z783 的二级串联(a)
m/z607 离子的三级串联(b)
m/z589 的三级串联(c)质谱图
M/z783 离子可能的碎裂机理见图 6。
峰 3 化合物在电喷雾质谱一级全扫描负离子模式下，以 m/
z623( ［M － H］－)准分子离子存在，可推断其分子量为 624。、在
MS － MS的负离子谱中，m/z 623 离子丢失 162Da的中性碎片(咖
啡酰基) ，生成质荷比为 m/z461 离子。在 MS3 的负离子谱中，m/
z461 离子进一步碎裂生成碎片离子 m/z315，297，161，135。其中
m/z315 离子为基峰，是由 m/z461 离子丢失 146Da 的中性碎片
(脱氧六碳糖基)产生的。m/z297 离子是由 m/z461 离子丢失
146Da的中性碎片的同时丢失一分子水形成的。m/z 161 离子可
能是葡萄糖残基脱氢离子，m/z135 离子是苯乙醇苷脱水离子。
根据质谱中获得的分子量信息及 MSn 碎裂规律［7，9，11，12］与对照品
麦角甾苷的碎裂规律对比，确定峰 3 化合物可能为麦角甾苷或异
麦角甾苷，结合液相色谱的结果，最后确定峰 3 化合物为麦角甾
苷。
图 6 m /z 783 离子的电喷雾质谱碎裂图
4 结论
本文首次应用高效逆流色谱分离玄参中的苯乙醇苷类化合
物，成功地在短时间内分离得到了较纯的安格洛苷 C 和麦角甾
苷单体化合物，说明该方法是分离天然产物的一种好方法。随着
分离技术的不断完善，高效逆流色谱在天然产物的分离提取中将
具有更加广泛的应用前景。
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