全 文 ：灰绿黄堇总生物碱对实验性溃疡性结肠炎的
作用研究
马国中
【摘要】　目的　研究灰绿黄堇总生物碱(ACAM)对小鼠结肠炎的作用及其机制 。方法 　实验设正
常 、模型 、柳氮磺胺吡啶组(SASP, 520 mg/kg)和 ACAM组(100、200、400 mg/kg)。正常组小鼠饮用蒸馏
水 ,其余组自由饮用 4%葡聚糖硫酸钠(DSS)水溶液 ,同时分别灌胃给予溶剂或干预药物(0.2 ml/10 g, 1
次 /d×7 d)。记录小鼠疾病活动指数(DAI);测定结肠组织 MDA含量 , SOD、MPO活性及 ICAM-1、NF-κB
p65表达水平 。结果　模型组 DAI显著增高 ,结肠黏膜损伤严重;MDA舍量 、MPO活性及 ICAM-1和 NF-
κBp65表达明显升高 。 SOD活性下降(P<0.01)。 SASP520 mg/kg能明显逆转上述改变;ACAM100 mg
具有相似的作用 。结论　ACAM可能通过抗氧自由基作用 ,抑制炎性细胞活化 、迁移及 NF-κB激活 ,缓
解小鼠结肠炎性反应 。
　　【关键词】　葡聚糖硫酸钠;灰绿黄堇总生物碱;结肠炎
Theeffectofalkaloidsofcorydalisaduncamaximonexperimentulcerativecolitisinducedbydextran
sulfatesodium　MAGuo-zhong.DepartmentofGeneralSurgery, TheThirdHospitalofMianyang, SichuanProv-
ince621000 , China
【Abstract】　Objective　Toinvestigatetheeffectofalkaloidsofcorydalisaduncamaxim(ACAM)onex-
perimentalulcerativecolitisinmice.Methods　BALB/Cmiceof6 groupswerealowedtodrinkeither4%dex-
transulfatesodium(DSS)solutionordistilledwaterfreelywithdifferentdosesofACAM(50 , 100, 200 mg/kg)or
salicylazosulfapyridine(SASP, 520 mg/kg), andsolvent(0.2 ml/10 g)onceadayfor7 days, respectively.The
symptomofulcerativecolitiswasevaluatedbydiseaseactivityindex(DAI), Myeloperoxidase(MPO)andsuper-
oxidedismutase(SOD)activitiesandmalondialdehyde(MDA)contentweredeterminedbyHEstainingandim-
munohistochemistryofexpressionsofNF-κBp65 andintercellularadhesionmolecule1(ICAM-1)proteinstoob-
servethedamageofcolontissuesand.possiblemechanisms.Results　DAI, MPOactivity, MDAcontentandex-
pressionsofICAM-1 andNF-κBweremarkedlyincreased, whileSODactivitydecreasedinDSS-treatedmice.
TreatmentofdiferentdosesofACAMorSASPinmicedecreasedsignificantlyDAI, MPOactivityandMDAcon-
tent, improvedhistologicalchangesofcolontissues, bluntedtheexpressionsofNF-κBp65 andICAM-1 proteins,
andpromotedSODactivity.Conclusion　ACAMhasexcellenttherapeuticefectonulcerativecolitiscausedby
DSS.Thepossiblemechanismmayberelatedtoitsantioxidantandanti-inflammatoryactivitiesassociatedwith
inhibitingtheNF-κBactivationandICAM-1 expression.
【Keywords】　Dextransulfatesodium;Alkaloidsofcorydalisaduncamaxim;Colitis
　　作者单位:621000 四川省绵阳市第三人民医院普外科
　　灰绿黄堇又名蛇含七 , 在藏药中又称为巴牛丝哇。 为婴
粟科植物灰绿黄堇 Corydalisaduncamaxim干燥块根。主要分
布于内蒙古 、宁夏 、甘肃 、陕西 、青海 、四川 、西藏 , 生于海拔
1000 ～ 3900 m的干旱山地 、河滩地或石缝中 , 资源丰富 [ 1] 。
它是一种具有较好的消炎 、利胆 、排石 、止痛作用的草药 [ 2] 。
王继生等 [ 3]对其灰绿黄堇的水提物进行研究 ,发现灰绿黄堇
的水提取物具有明显的镇痛 、抗炎作用。 作者对灰绿黄堇水
提物镇痛抗炎的有效部位进行筛选 , 发现灰绿黄堇水提物镇
痛抗炎的有效部位为灰绿黄堇总生物碱(thecrudealkaloidsof
corydalisaduncamaxim, ACAM)[ 4] , 同时发现灰绿黄堇总生物
碱对实验性溃疡性结肠炎有很好疗效 ,本实验采用小鼠实验
性溃疡性结肠炎模型观察 ACAM的药效学及其作用机制 , 现
报道如下。
1　材料与方法
1.1　材料　清洁级 BALB/c小鼠 , 雌雄兼用 ,体质量(20±2)
g, 由重庆医科大学实验动物中心提供;ACAM由重庆医科大
学化学教研室提供(纯度大于 95%)。 DSS由 Sigma公司(美
国)提供;SASP由浙江九州药业股份有限公司提供;SOD、
MDA、MPO检测试剂盒购于南京建成生物研究所;ICAM-1、
NF-kBp65一抗均购自美国 SantaCruz公司;SP试剂盒由北
京中山生物技术有限公司提供。
1.2　方法　参照 Cooper等 [ 5]的方法建立小鼠溃疡性结肠炎
模型:将 DSS溶于蒸馏水 ,配成 4%DSS溶液 ,让 BALB/c小鼠
自由饮用 7 d。实验设正常对照组 、模型组 、SASP组(520 mg/
kg)、和 ACAM组(50、 100、 200 mg/kg)。 正常对照组小鼠饮
用蒸饮水 , 造模组自由饮用蒸饮水配制的 4%DSS溶液;同时
灌胃给予干预药物或溶剂对照(0.2 ml/10 g, 1次 /d×7 d)。
其间 , 每天称量体质量 , 采用联苯胺法检测大便稳血 , 观察粪
便性状;以体质量下降百分比 、隐血试验及大便性状评分之和
除以 3作为 DAI[ 3] (见表 1)。 第 8天处死小鼠 , 取下整段结
肠 ,用冰冷生理盐水冲洗干净。结肠组织分两部分:一部分快
速放入氮中速冻 , 转入-70℃低湿冰箱保存 , 用于检测 SOD、
MDA、MPO,检测操作按相应试剂盒说明进行;另取远端结肠
约 1 cm的组织块放入 4%甲醛溶液中固定 、切片 、HE染色 ,
·8· 中国实用医药 2008年 10月第 3卷第 29期　ChinaPracMed, Oct2008, Vol.3, No.29DOI :10.14163/j.cnki .11-5547/r.2008.29.031
检测 ICAM-1、NF-κBp65表达。 免疫组化检测步骤严格按相
应试剂盒说明进行 , 均以非免疫性山羊血清封闭非特异性抗
原 , 一抗分别为 1:200的 ICAM-1与 NF-κBp65;二抗均为生
物素化头号抗免 IgG工作液 ,以 PBS缓冲液代替一抗做阴性
对照;ICAM-1以细胞膜呈橙黄色为阳性 , NF-kBp65以胞膜或
胞核呈橙黄色为阳性。每张切片选取 10个 X400视野 , 采用
GD-8型病理影像多媒体分析系统 ,测定面积积分光密度作为
ICAM-1、NF-κBp65表达含量。
表 1　疾病活动指数评分
体质量减轻百分比 隐血试验 粪便性状 评分
未减轻 3 min后不显蓝色 正常 0
1% ～ 5% 1 ～ 3 min显淡蓝色 松软 1
6% ～ 10% 0.5～ 1 min逐渐显蓝色 松软 2
11% ～ 15% 立即显蓝色 腹泻 3
>15% 显深蓝色 腹泻 4
1.3　统计学方法　所有用 SPSS12.0统计软件处理 , 计量资
料数据用(x±s)表示 , 采用单因素方差分析和非参数 Wilcox
on秩和检验 , 比较各组资料间的差异 , 以 P<0.05为差异有
统计学意义。
2　结果
2.1　ACAM对 4%DSS诱导小鼠 DAI的影响　 SASP520
mg/kg对 4%DSS诱导小鼠 DAI增高 ,而且在后 2 d呈现下降
的趋势;ACAM各剂量组表现出相似的抑制作用(P<0.01)。
2.2　ACAM对 4%DSS诱导小鼠结肠组织中 SOD、MPO活性
及 MDA含量的影响　与正常对照组比较 , DSS模型组小鼠结
肠组织 MPO活性 , MDA含量明显增高 , SOD活性下降(P<
0.01);SASP520 mg/kg和 ACAM 100、200 mg/kg能明显减小
MPO活性 MDA含量 , 阻遏 SOD活性降低(P<0.01), 但两组
之间比较差异无统计学意义 , 见表 2。
表 2　灰绿黄堇总生物碱对 MPO, SOD和 MDA含量的影响(x±s, n=8)
组别 剂量(mg/kg) SOD(U/mg· prot) MPO(U/g) MDA(nmol/mg· prot)
正常组 11.54±0.30 0.21±0.02 0.96±0.09
对照组 6.34±0.21## 0.48±0.03## 2.64 ±0.21##
SASP 520 9.61 ±0.43＊＊ 0.39±0.10＊＊ 1.53±0.08＊＊
ACAM 50 7.56±0.34＊ 0.38±0.07＊＊ 1.88±0.05＊＊
100 8.45 ±0.43＊＊ 0.35±0.06＊＊ 1.58±0.10＊＊
200 9.45 ±0.56＊＊ 0.32±0.05＊＊ 1.47±0.06＊＊
　　注:与正常组比较 , ##P<0.01;与对照组比较 , ＊＊ P<0.01, ＊ P
<0.01
2.3　ACAM以 4%DSS诱导小鼠结肠组织病理变化的影响　
与正常对照组相比 , DSS模型对照组结肠黏膜损伤明显:黏膜
上皮糜烂 , 隐窝破坏;杯状细胞丢失 , 伴有大量炎性细胞浸润。
SASP组结肠黏膜损伤明显减轻 , 上皮结构较完整 , 有少量的
炎性细胞存在;ACAM 100 mg/kg组结肠上皮尚存 , 隐窝腺体
排列较整齐 , 炎性细胞浸润明显减少。
图 1　灰绿黄堇总生物碱对 DSS诱导小鼠结肠组织病理变化的影响　(HE染色 , ×100)
A:正常组;B:模型组;C:SASP(520 mg/kg);D:ACAM(100 mg/kg)
2.4　ACAM对 4%DSS诱导小鼠结肠组织中 ICAM-1表达的
影响　如图 2所示 , DSS模型组小鼠结肠上皮 、固有层和黏膜
下层细胞膜上 LCAM-1有明显表达;正常组小鼠结肠黏膜几
乎看不到表达。 SASP和 ACAM各剂量组具有相似作用 , 均显
著抑制 ICAM-1的表达(P<0.01),见表 3。
图 2　灰绿黄堇总生物碱对 DSS诱导 ICAM-1表达的影响(SP×400)
A:正常组;B:模型组;C:SASP(520 mg/kg);D:ACAM(100 mg/kg)
2.5　ACAM对 4%DSS诱导小鼠结肠组织中 NF-κBp65表达
的影响　如图 3所示, DSS模型组小鼠结肠上皮 、固有层和黏
膜下层细胞膜上 LCAM-1有明显表达;NF-κBp65激活后主要
表达在上皮和固有层细胞的胞质及胞核上;正常组小鼠结肠黏
膜几乎看不到表达。 SASP和 ACAM各剂量组具有相似作用 ,
均显著抑制 ICAM-1和 NF-κBp65的表达(P<0.01), 见表 3。
·9·中国实用医药 2008年 10月第 3卷第 29期　ChinaPracMed, Oct2008, Vol.3, No.29
图 3　灰绿黄堇总生物碱对DSS小鼠结肠组织中 NF-kBp65表达的影响(SP×400)
A:正常组;B:模型组;C:SASP(520 mg/kg);D:ACAM(100 mg/kg)
表 3　灰绿黄堇总生物碱对 DSS小鼠结肠组织中 ICAM-1,NF-κBp65表达的影响(x±s, n=8)
组别 剂量(mg/kg) ICAM-1 NF-κBp65
正常组 - 0 0
对照组 - 0.22±0.08## 0.18±0.12##
SASP 520 0.17±0.10＊ 0.11±0.09＊＊
ICAM 50 0.18±0.07＊ 0.11±0.08＊＊
100 0.15 ±0.04＊＊ 0.09±0.04＊＊
200 0.14 ±0.07＊＊ 0.09±0.10＊＊
　　注:与正常组比较 , ##P<0.01;与模型组比较 , ＊＊ P<0.01, ＊P
<0.01
3　讨论
溃疡性结肠(UC)的发病机制尚不十分清楚 ,目前认为主
要与结肠黏膜免疫功能紊乱有关。 本实验采用 DSS诱导小
鼠结肠炎 , 此模型是研究 UC发病机制和药物筛选的经典免
疫性模型 , 其表现与临床 UC患者相似 ,为腹痛 、腹泻 、黏液性
血便 、体质量减轻;病变部位主要发生在直肠和结肠远端 , 累
及黏膜和黏膜下层 , 同时伴有大量炎性细胞浸润。 SASP是目
前治疗 UC最常用的药物之一。 本实验结果显示 , SASP520
mg/kg能显著降低模型动物粪便隐血的发生率和严重程度 ,
减少腹泻次数 , 抑制体质量下降。 ACAM 150 mg/kg有类似
SASP作用。
DielemanLA等 [ 4]认为 , DSS通过对结肠上皮细胞的直接
毒性作用以及激活炎性细胞 ,释放炎性介质和细胞因子 , 后者
诱发非特异性免疫反应 , 导致结肠黏膜损伤。临床检验证实 ,
中性粒细胞活化 、浸润是 UC活动期的突出特点;MPO是存在
于中性粒细胞 , 被认作是量化炎性反应的一项重要指标 [ 5] 。
中性粒细胞呼吸暴发 ,产生大量氧自由基 ,诱发脂质过氧化 ,
引起蛋白质变性和交联 , 细胞膜结构受损。 SOD是存在于生
物体内的重要的抗氧化酶系 ,能有效地清除氧自由基 , 从而抑
制肠组织中的脂质过氧化损伤;MDA为脂质过氧化的终末产
物 , 其含量反映了组织中过氧化损伤程度。 本实验显示 ,
SASP和 ACAM能明显抑制 DSS诱导小鼠结肠组织 MPO活性
和 MDA含量升高 ,阻遏 SOD活性下降 ,提示 ACAM可能抑制
中性粒细胞浸润 , 减轻机体抗氧系统破坏 , 促进氧自由基的清
除。中性粒细胞和其他炎性细胞释放大量炎症介质(白细胞
三烯 、前列腺素等)[ 4]用 DSS诱导严生最新合免疫缺陷小鼠
(缺乏 T和 B淋巴细胞), 同样能诱导出严重的结肠炎性反
应 , 提示特异性免疫反应在形成实验性结肠炎的初始阶段中
不起决定性作用;鉴于 UC患者及 DSS结肠黏膜固有层中有
淋巴细胞 、浆细胞浸润 ,提示特异性免疫应答(细胞免疫和体
液免疫)可能参与了 UC病程的发展。因此 , ACAM抑制中性
粒细胞浸润和抗氧化只是其发挥抗 EUC作用的一个方面。
黏附分子是一类跨膜蛋白 , 能介导细胞黏附 、趋化和淋巴
细胞归巢等 , 参与机体的炎性反应和免疫反应。目前已证实
细胞黏附分子与 UC炎症反应关系密切 , 多种黏附分子在 UC
患者结织和血细胞中表达增强。 Wong等 [ 7]对乙酸诱发的
IBD小鼠给予抗 ICAM-1抗体 ,结果显示小鼠肠上皮细胞破坏
程度减轻 , 白细胞浸润浸少 , 髓过氧化物酶活性降低 2倍 , 超
氧化物减少将近 85%, 提示 ICAM-1在 UC发病有密切关
系 [ 6] 。 ICAM-1和 VCAM-1基因启动子上均含有 NF-κB结合
位点 , 各种刺激信号使胞质中未活化的 NF-κB激活并进入胞
核 , 后者与 NF-κB位点结合即能启动相关基因转录 , 促使细
胞黏附分子的表达;细胞黏附分子反过来进一步活化 NF-κB,
形成一个正反馈调节 , 使炎症级联放大 [ 8-9] 。本研究显示 ,
SASP和 ACAM能明显抑 ICAM-1表达和 NF-κB激活 , 且
ICAM-1表达与 NF-κB的活化程度之间存在一定的相关性。
因此 , 有理由认为 ACAM与 SASP可能存在相似的作用机制 ,
但 ACAM的具体作用机制尚需进一步报道。
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