全 文 ：畜牧兽医学报　２０１３，４４（１１）：１８３８－１８４３
Ａｃｔａ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｉａ　ｅｔ　Ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｃａ　Ｓｉｎｉｃａ
ｄｏｉ：１０．１１８４３／ｊ．ｉｓｓｎ．０３６６－６９６４．２０１３．１１．０２０
球兰皂苷对小鼠巨噬细胞免疫功能和
抗氧化作用的影响
陈义杰，黄志坚＊，江和基
（福建农林大学动物科学学院／福建省动物药物工程实验室，福州３５０００２）
摘　要：作者拟研究球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞免疫功能和抗氧化作用的影响。从球兰的茎和叶中提取皂苷，
采用细胞体外培养法，测定球兰皂苷对小鼠巨噬细胞活力、吞噬能力、ＮＯ生成量、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＴＮＦ－ɑ分泌量与谷
胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－Ｐｘ）活性及溶菌酶（ＬＳＺ）活性的影响。结果如下：球兰皂苷在２．５～３２０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度
范围内，能极显著地促进小鼠巨噬细胞增殖（Ｐ＜０．０１）；在５．０～８０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内能极显著地促进巨噬
细胞吞噬中性红能力（Ｐ＜０．０１）；在１０．０～８０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内能极显著地提高胞内ＬＳＺ活性（Ｐ＜０．０１）；
在２０．０～４０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内能显著地提高ＧＳＨ－Ｐｘ活性（Ｐ＜０．０５）；在１０．０～８０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围
内，能极显著地提高ＴＮＦ－ɑ分泌量（Ｐ＜０．０１）；在５．０～４０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内能极显著地提高ＩＬ－１β分泌量
（Ｐ＜０．０１）；在５．０～２０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内能极显著地提高ＩＬ－６分泌量（Ｐ＜０．０１）；在２．５～１６０．０
μｇ·ｍＬ
－１剂量范围内，能够极显著地增加ＮＯ生成量（Ｐ＜０．０１）。本研究表明球兰皂苷能够激活小鼠腹腔巨噬细
胞，提高其吞噬能力和能量代谢水平，增强抗氧化能力，提高机体的免疫力。
关键词：球兰皂苷；巨噬细胞；ＮＯ；ＬＳＺ；ＧＳＨ－Ｐｘ；ＩＬ－１β；ＩＬ－６；ＴＮＦ－ɑ
中图分类号：Ｓ８５３．７４　　　　文献标志码：Ａ　　　　文章编号：０３６６－６９６４（２０１３）１１－１８３８－０６
收稿日期：２０１３－０３－２８
作者简介：陈义杰（１９８８－），男，安徽六安人，硕士生，从事动物天然产物的分离与应用，Ｅ－ｍａｉｌ：８０４２２７６６４＠１６３．ｃｏｍ
＊通信作者：黄志坚，Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｕａｎｇｚｊ１９９９＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ
Ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　Ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　Ｉｍｍｕｎｅ　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ　Ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ
Ｍｏｕｓｅ　Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　Ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ
ＣＨＥＮ　Ｙｉ－ｊｉｅ，ＨＵＡＮＧ　Ｚｈｉ－ｊｉａｎ＊，ＪＩＡＮＧ　Ｈｅ－ｊｉ
（Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｆｕｊｉａｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ａｎｉｍａｌ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｕｚｈｏｕ３５０００２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ　ａｉｍ　ｏｆ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｔｏ　ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｉｍｍｕｎｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ
ａｎｄ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｆｒｏｍ　Ｈｏｙａ　ｓｔｅｍ　ａｎｄ
ｌｅａｆ．Ｔｈｅ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｌｅｖｅｌ，ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ，ｎｉｔｒｏｕｓ
ｏｘｉｄｅ（ＮＯ）ｒｅｌｅａｓｅ，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＬ－１β，ＩＬ－６，ＴＮＦ－ɑ，ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ　ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＧＳＨ－Ｐｘ）
ａｎｄ　Ｌｙｓｏｚｙｍｅ（ＬＳＺ）ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗｅｒｅ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｃｅｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　ｉｎｖｉｔｒｏｍｅｔｈｏｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｗｅｒｅ
ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｇｒｏｕｐ，ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉ－
ｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５．０－８０．０μｇ·ｍＬ
－１，ａｎｄ　ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｌｅｖｅｌ　ｗａｓ　ｅｎｈａｎｃｅｄ
ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　２．５－３２０．０μｇ·ｍＬ
－１，ＬＳＺ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｖｅｒｙ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１０．０－８０．０μｇ·ｍＬ
－１，ＧＳＨ－Ｐｘ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ　ｓｉｇ－
ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０５）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　２０．０－４０．０μｇ·ｍＬ
－１，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ－ɑｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅｄ
ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　１０．０－８０．０μｇ·ｍＬ
－１，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＬ－１βｗａｓ　ｉｎ－
ｃｒｅａｓｅｄ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５．０－４０．０μｇ·ｍＬ
－１，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＩＬ－６
　１１期 陈义杰等：球兰皂苷对小鼠巨噬细胞免疫功能和抗氧化作用的影响
ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　５．０－２０．０μｇ·ｍＬ
－１，ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ
ＩＬ－６ｗａｓ　ｉｎｃｒｅａｓｅ　ｖｅｒｙ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ（Ｐ＜０．０１）ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　２．５－１６０．０μｇ·ｍＬ
－１．Ｏｕｒ　ｒｅｓｕｌｔｓ
ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｃａｎ　ａｃｔｉｖａｔｅ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ，ｉｍｐｒｏｖｅ　ｉｔｓ　ｐｈａｇｏｃｙ－
ｔｏｓｉｓ　ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ　ａｎｄ　ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｌｅｖｅｌ，ｅｎｈａｎｃｅ　ｔｈｅ　ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ　ａｂｉｌｉｔｙ，ａｎｄ　ｉｍｐｒｏｖｅ　ｂｏｄｙ＇ｓ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ；ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ；ＮＯ；ＬＳＺ；ＧＳＨ－Ｐｘ；ＩＬ－１β；ＩＬ－６；ＴＮＦ－ɑ
　　球兰，味微甘，性温，具有清热解毒、通脉活络等
功效，用于治疗脑炎、肺炎、支气管炎，外用治疗痈肿
疔疮［１］，在福建、广西等地的民间，被用来治疗风湿、
咳嗽等疾病［２］。皂苷是一类由糖与苷元缩合而成的
结构复杂的天然化合物，具有多种生物学活性，如抗
肿瘤、抗病毒、免疫调节、抗真菌、抗炎、保肝等活性。
目前对球兰皂苷免疫药理作用及机制的研究相关报
道不多，异叶球兰（Ｈｏｙａ　ｄｉｖｅｒｓｉｆｏｌｉａ）的甲醇提取物
具有抗癌活性［３］；Ｍ．Ｋｙｏｇｏｋｕ研究了因球兰过敏而
引发哮喘的相关原因［４］；Ｉ．Ｊｙｏ等探讨了球兰致过敏
的一些免疫因素［５］。本实验室陈炳华对球兰皂苷的
相关活性做了初步的研究［６］，在此基础上，本试验对
球兰皂苷的生物活性做进一步研究，通过体外培养
小鼠腹腔巨噬细胞，研究其对巨噬细胞免疫调节和
抗氧化作用的影响。
１　材料与方法
１．１　实验材料
１．１．１　动物　　ＫＭ小鼠，体重２０～２５ｇ，６～８周
龄，购自福州吴氏实验动物公司。
１．１．２　仪器设备　　Ｖａｒｉａｎ　９４０ＬＣ制备型液相色
谱 （Ｖａｒｉａｎ，美 国 ），ＫＱ３２００ＤＥ　ＣＯ２ 培 养 箱
（ＳＡＮＹＯ，日本），ＢＸ５１Ｔ－ＰＨＤ－ＪＩＩ型生物倒置显
微镜（Ｏｌｙｍｐｕｓ），酶标仪（Ｔｈｅｒｍｏ　Ｆｉｓｈｅｒ），离心机
（Ｔｈｅｒｍｏ，德国），紫外分光光度计：Ｖａｒｉａｎ　ＵＶ１６００
（ＵＳＡ）。
１．１．３　试剂　　ＲＰＭＩ－１６４０细胞培养基液Ｓｏｌａｒ－
ｂｉｏ公司；噻唑蓝（ＭＴＴ），脂多糖（ＬＰＳ）Ｓｉｇｍａ公
司；ＮＯ、ＬＳＺ、ＧＳＨ－Ｐｘ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６与 ＴＮＦ－ɑ检测
试剂盒购自南京建成生物工程研究所；胎牛血清
（ＦＢＳ）Ｓｏｌａｒｂｉｏ公司。
１．２　试验方法
１．２．１　球兰皂苷的提取　　准确称取１５０ｇ球兰
粉末于２Ｌ烧杯中，加入８０％乙醇溶剂１　５００ｍＬ，
浸泡１２ｈ并过夜，８０℃水浴中回流提取３次，过滤
合并滤液，减压浓缩至没有醇味为止，用水调至１５０
ｍＬ，过滤除去不溶物，上分液漏斗，依次用石油醚、
氯仿、乙酸乙酯、正丁醇萃取，每部分分别萃取５次，
收集正丁醇部，减压浓缩后冷冻干燥即得到球兰皂
苷。
１．２．２　小鼠腹腔巨噬细胞的分离与纯化　　小鼠
腹腔注射５ｍＬ无菌预冷ＰＢＳ缓冲液，轻揉腹部５
ｍｉｎ左右，颈椎脱臼处死，置于７５％酒精中浸泡１０
ｍｉｎ，取出固定在解剖版上，无菌条件下打开腹腔，
用注射器抽取腹腔液于离心管中，５　０００ｒ·ｍｉｎ－１
离心８ｍｉｎ，弃上清，用ＰＢＳ缓冲液洗涤２次，收集
细胞，台酚蓝染色计数活细胞＞９５％。用 ＲＰＭＩ－
１６４０完全培养液（１０％ＦＢＳ、２０ｍｍｏｌ·Ｌ－１谷氨酰
胺、１００Ｕ·ｍＬ－１青霉素、１００Ｕ·ｍＬ－１链霉素）重
新调整细胞浓度为１．５×１０６·ｍＬ－１。将细胞悬液
按每孔２００μＬ接种到９６孔培养板，置于３７℃，浓
度为５％的ＣＯ２ 培养箱中培养５ｈ，弃上清，用ＰＢＳ
缓冲液冲洗３次，洗去没有贴壁的细胞，即得纯化的
巨噬细胞。
１．２．３　小鼠腹腔巨噬细胞活力测定　　按上述方
法纯化巨噬细胞后，设置对照组和试验组，对照组只
加细胞悬液，试验组添加终浓度分别为２．５、５．０、
１０．０、２０．０、４０．０、８０．０、１６０．０和３２０．０μｇ·ｍＬ
－１
的球兰皂苷，每个浓度设３个复孔，置于３７℃，浓度
为５％的ＣＯ２ 培养箱中培养２４ｈ，吸去培养液，补充
不含ＦＢＳ的ＲＰＭＩ－１６４０培养液２００μＬ·孔
－１，同
时每孔加入５ｍｇ·ｍＬ－１　ＭＴＴ　２０μＬ，继续培养４
ｈ后，弃上清，加ＤＭＳＯ，每孔２００μＬ，形成的紫色
结晶完全溶解后，用酶标仪在４９０ｎｍ处测定吸光
度。
１．２．４　小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红（ＮＲ）试验　
　方法同上，细胞培养２４ｈ，弃去上清，每孔加入
０．１％的中性红生理盐水２００μＬ，继续培养４ｈ后，
取出，弃中性红，然后用预温的ＰＢＳ缓冲液清洗９６
孔培养板３次，弃上清液，每孔加入细胞裂解液２００
μＬ，静置过夜，在酶标仪上测定４９０ｎｍ的吸光度。
１．２．５　小鼠腹腔巨噬细胞内溶菌酶（ＬＳＺ）含量和
９３８１
畜　牧　兽　医　学　报 ４４卷　
上清液中ＧＳＨ－Ｐｘ含量的测定　　按上述方法分离
纯化巨噬细胞，将９６孔培养板分为对照组、ＬＰＳ组
（终浓度１０μｇ·ｍＬ
－１）、ＬＰＳ（终浓度１０μｇ·ｍＬ
－１）
＋球兰皂苷组，每孔２５０μＬ，置于３７℃，浓度为５％
的ＣＯ２ 培养箱中培养２４ｈ，轻轻吸取上清液２００
μＬ，采用二硫代二硝基苯甲酸（ＤＴＮＢ）法测定
ＧＳＨ－Ｐｘ含量；然后每孔加入２００μＬ细胞裂解液，
静置过夜，取２００μＬ上清液采用空白对照法测定溶
菌酶含量，所有操作步骤严格按照南京建成试剂盒
的说明书进行操作。
１．２．６　小鼠腹腔巨噬细胞 ＮＯ生成量的测定　　
方法同上，细胞培养２４ｈ，轻轻吸取上清液１００μＬ，
－２０℃保存，待测。严格按照南京建成试剂盒的说
明书进行操作，采用硝酸还原酶法检测细胞培养上
清液中的ＮＯ－２ 含量，用可见紫外分光光度计在５５０
ｎｍ处测定其ＯＤ值。
１．２．７　小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液中 ＴＮＦ－ɑ、
ＩＬ－１β和ＩＬ－６含量的测定　　方法同上，细胞培养
２４ｈ，轻轻吸取上清液１００μＬ，采用酶联免疫法
（ＥＬＩＳＡ），具体操作严格按照南京建成试剂盒的说
明书进行，酶标仪４５０ｎｍ处测定吸光度。
１．３　数据分析与处理
数据用ＳＰＳＳ１３．０ｆｏｒ　Ｗｉｎｄｏｗｓ统计软件进行
处理，采用单因子方差分析（Ｏｎｅ－Ｗａｙ　ＡＮＯＶＡ）方
法分析数据。
２　结　果
２．１　球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞生长代谢和吞
噬中性红的影响
　　由表１可知，在２．５～３２０．０μｇ·ｍＬ
－１的剂量
范围内，小鼠腹腔巨噬细胞呈现出不同程度的增长，
且增长极显著（Ｐ＜０．０１），增长率分别提高了
１９．９％、２９．０％、３１．８％、４７．２％、８５．８％、７９．５％、
５８．０％和４３．８％，但并不是随着剂量的增高而增
大，从２．５到４０．０μｇ·ｍＬ
－１该指标逐渐增大，在
４０．０μｇ·ｍＬ
－１的浓度达到峰值后逐渐呈下降趋
势。
在２．５～８０．０μｇ·ｍＬ
－１的剂量范围内，对小鼠
腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力有增强，在２．５
μｇ·ｍＬ
－１浓度时，作用显著（Ｐ＜０．０５），在５．０～
８０．０μｇ·ｍＬ
－１浓度范围内，作用极显著（Ｐ＜
０．０１），对中性红的吞噬率分别增加了 ６．８％、
１７．１％、１８．８％、１９．６％、２９．９％和３４．２％，且在
８０．０μｇ·ｍＬ
－１时作用最强。但是，在高剂量的时
候，反而会抑制巨噬细胞的吞噬能力，在１６０．０和
３２０．０μｇ·ｍＬ
－１时，抑制率分别为 １５．４％ 和
２２．２％，且差异极显著（Ｐ＜０．０１）。
表１　球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞生长代谢和吞噬中性
红的影响
Ｔａｂｌｅ　１　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｈａｇｏ－
ｃｙｔｏｓｉｓ　ｎｅｕｔｒａｌ　ｒｅｄ　ａｎｄ　ｅｎｅｒｇｙ　ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ　ｆｒｏｍ
ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
组别 Ｇｒｏｕｐ
ＯＤ４９０ｎｍ值Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ａｔ　４９０ｎｍ
细胞活力
Ｃｅｌ　ｖｉａｂｉｌｉｔｙ
吞噬能力
Ｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ　ａｂｉｌｉｔｙ
空白对照 ０．１７６±０．０７５　 ０．１１７±０．０７０
２．５μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２１１±０．０５７ｂ　 ０．１２５±０．０４２ａ
５．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２２７±０．１０３ｂ　 ０．１３７±０．００９ｂ
１０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２３２±０．０７３ｂ　 ０．１３９±０．０３７ｂ
２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２５９±０．０４０ｂ　 ０．１４０±０．０４９ｂ
４０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３２７±０．１０３ｂ　 ０．１５２±０．０１２ｂ
８０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３１６±０．０９４ｂ　 ０．１５７±０．０１８ｂ
１６０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２７８±０．０７４ｂ　 ０．０９９±０．０２４ｂ
３２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．２５３±０．０５１ｂ　 ０．０９１±０．０５４ｂ
与对照组相比，ａ．Ｐ＜０．０５；ｂ．Ｐ＜０．０１。下表同
Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂｌａｎｋ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ａ．Ｐ＜０．０５；ｂ．Ｐ＜０．０１．
Ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ａｓ　ｂｅｌｏｗ
２．２　球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞内ＬＳＺ活性、
胞外ＧＳＨ－Ｐｘ活性和ＮＯ生成量的影响
　　由表２可知，ＬＰＳ能够显著地提高细胞内ＬＳＺ
的活性（Ｐ＜０．０５），球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞
ＬＳＺ活性的提高随着浓度的逐渐增高呈现出先升
后降的趋势。在２．５～５．０μｇ·ｍＬ
－１的低浓度时，
对ＬＳＺ活性提升显著（Ｐ＜０．０５）；在１０．０～８０．０
μｇ·ｍＬ
－１的剂量范围内，对ＬＳＺ的活性提升作用极
显著（Ｐ＜０．０１），且在４０．０μｇ·ｍＬ
－１时，作用达到最
强，之后对ＬＳＺ活性的提高作用逐渐降低。
球兰皂苷能明显提高小鼠腹腔巨噬细胞ＧＳＨ－
Ｐｘ的活性，在低剂量时，作用不显著，在２０．０～
４０．０μｇ·ｍＬ
－１范围内，能够显著地（Ｐ＜０．０５）提高
ＧＳＨ－Ｐｘ的活性，且４０．０μｇ·ｍＬ
－１时作用最强，能
够极显著地（Ｐ＜０．０１）提升 ＧＳＨ－Ｐｘ的活性。之
后，随着剂量的增大，作用也逐渐减弱。
０４８１
　１１期 陈义杰等：球兰皂苷对小鼠巨噬细胞免疫功能和抗氧化作用的影响
如表２所示，ＬＰＳ能够极显著地增加巨噬细胞
ＮＯ的生成量（Ｐ＜０．０１），增加率达１３．１％。在２．５～
１６０．０μｇ·ｍＬ
－１剂量范围，能够极显著地（Ｐ＜
０．０１）增加巨噬细胞 ＮＯ 的生成量，分别增加了
２７．２％、２９．８％、２２．５％、１６．８％、１４．６％、１８．８％、
１３．９％和１１．７％，以５．０μｇ·ｍＬ
－１作用最强。与
ＬＰＳ对照组相比，球兰皂苷能够对ＬＰＳ刺激巨噬细
胞产生ＮＯ起到协同促进作用，在５．０μｇ·ｍＬ
－１浓
度时，促进作用极显著（Ｐ＜０．０１），在２．５和１０．０
μｇ·ｍＬ
－１时，均能够显著地（Ｐ＜０．０５）促进ＮＯ的
生成。
表２　球兰皂苷小鼠对腹腔巨噬细胞内ＬＳＺ活性、胞外ＧＳＨ－Ｐｘ活性和ＮＯ生成量的影响
Ｔａｂｌｅ　２　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ＬＳＺ　ａｎｄ　ＧＳＨ－Ｐｘ，ａｎｄ　ＮＯ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
组别 Ｇｒｏｕｐ
ＬＳＺ活性／（μｇ·ｍＬ
－１）
ＬＳＺ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＧＳＨ－Ｐｘ活性／（μｍｏｌ·Ｌ
－１）
ＧＳＨ－Ｐｘ　ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＮＯ生成量／（μｍｏｌ·Ｌ
－１）
ＮＯ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
空白对照 ２．２５２±０．０９９　 １７５．３２４±４１．９００　 ５６４．８１７±１４．８００
ＬＰＳ对照 ２．５０４±０．０３４　 １９７．０７０±６１．８００　 ６３８．９５７±５１．７００ａ
２．５μｇ·ｍＬ
－１　 ２．５９０±０．０８３ａ １５４．９２９±４７．５００　 ７１８．２１４±２３．１００ｂ
５．０μｇ·ｍＬ
－１　 ２．６７４±０．０４７ａ ２３０．６４７±２０．５００　 ７３３．０１７±６３．７００ｂ
１０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ２．７２６±０．１２６ｂ　 ２４８．１１２±２４．６００　 ６９１．８６８±１７．８００ｂ
２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ２．７５１±０．０２３ｂ　 ３０５．４５１±７５．５００ａ ６５９．５８９±９．７００ｂ
４０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ７．５７３±０．４５６ｂ　 ５３９．９６４±６２．６００ｂ　 ６４７．０６１±６．１００ｂ
８０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ６．９３５±０．２６４ｂ　 １７９．８１７±３２．９００　 ６７０．８０５±２２．２００ｂ
１６０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ２．６３８±０．０９９ａ ２１９．８３１±１１９．４００　 ６４３．１１７±８．５００ｂ
３２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ２．５０７±０．１８１　 １１８．８７３±９．９００　 ６３１．１３７±３３．４００ａ
２．３　球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞ＴＮＦ－ɑ、ＩＬ－１β
和ＩＬ－６分泌量的影响
　　如表３所示，在ＬＰＳ（５．０μｇ·ｍＬ
－１）的诱导作
用下，球兰皂苷与小鼠巨噬细胞共同培养２４ｈ，能
够明显地促进巨噬细胞ＴＮＦ－ɑ的分泌，随着添加量
的增加，促进作用呈现上升趋势，但是当大于２０
μｇ·ｍＬ
－１时，作 用 逐 渐 减 弱。在 ２．５～５．０
μｇ·ｍＬ
－１的低剂量时，诱导作用显著（Ｐ＜０．０５），在
１０．０～３２０．０μｇ·ｍＬ
－１范围内，能够极显著地诱导巨
噬细胞分泌ＴＮＦ－ɑ（Ｐ＜０．０１），且在２０．０μｇ·ｍＬ
－１
时作用达到最强。
表３　球兰皂苷对小鼠腹腔巨噬细胞ＴＮＦ－ɑ、ＩＬ－１β和ＩＬ－６分泌量的影响
Ｔａｂｌｅ　３　Ｅｆｆｅｃｔ　ｏｆ　Ｈｏｙａ　ｓａｐｏｎｉｎｓ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ＴＮＦ－ɑ，ＩＬ－１βａｎｄ　ＩＬ－６ｆｒｏｍ　ｍｏｕｓｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ　ｉｎ　ｖｉｔｒｏ
组别 Ｇｒｏｕｐ
ＯＤ４５０ｎｍ值　 Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ　ａｔ　４５０ｎｍ
ＴＮＦ－ɑ ＩＬ－１β ＩＬ－６
空白对照 ０．２７８±０．０６３　 ０．３６４±０．０１２　 ０．３０６±０．００７
ＬＰＳ对照 ０．３４９±０．０１８　 ０．４４０±０．０１１ａ ０．３４５±０．０５９
２．５μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３５２±０．０５２ａ ０．８２７±０．０２１ｂ　 ０．４３８±０．０１７ａ
５．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３７３±０．０６４ａ １．２９８±０．０４５ｂ　 ０．４６１±０．０９９ｂ
１０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３９２±０．０２２ｂ　 １．３３７±０．０５１ｂ　 ０．５３２±０．１１８ｂ
２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．４１４±０．０６２ｂ　 １．４５９±０．０５０ｂ　 ０．４５４±０．０３９ａ
４０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．４０４±０．０４０ｂ　 １．０３５±０．０４３ｂ　 ０．４０５±０．０３８
８０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３９８±０．０３３ｂ　 ０．７４４±０．０２６ｂ　 ０．４８１±０．０８２ａ
１６０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．４０７±０．００６ｂ　 １．１３１±０．０１６ｂ　 ０．５２９±０．０７３ｂ
３２０．０μｇ·ｍＬ
－１　 ０．３８１±０．０１３ｂ　 ０．５８９±０．０２６ｂ　 ０．４５１±０．０５５ａ
　　在ＬＰＳ（５．０μｇ·ｍＬ
－１）的诱导作用下，能够显 著地（Ｐ＜０．０５）促进小鼠腹腔巨噬细胞ＩＬ－１β的分
１４８１
畜　牧　兽　医　学　报 ４４卷　
泌，与不同浓度的球兰皂苷共同培养２４ｈ，可以明
显增强其诱导作用。在所设球兰皂苷的剂量范围
内，对ＬＰＳ诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌ＩＬ－β的促进
作用都极显著（Ｐ＜０．０１），且这种增强作用在２０．０
μｇ·ｍＬ
－１时最强。
ＬＰＳ作为巨噬细胞的有效刺激原，在 ５．０
μｇ·ｍＬ
－１时，刺激小鼠腹腔巨噬细胞，能够诱导细
胞分泌ＩＬ－６。在ＬＰＳ的诱导下，用不同浓度的球兰
皂苷与小鼠腹腔巨噬细胞共同培养２４ｈ后，测定细
胞上清液中的ＩＬ－６含量，结果表明球兰皂苷能够促
进ＬＰＳ对巨噬细胞的诱导作用，效果明显，但是并
不呈现剂量依存关系。
３　讨　论
３．１　巨噬细胞在机体的免疫系统中有着非常重要
的作用，是机体最重要的免疫细胞之一，具有吞噬、
消灭病原体、分泌细胞因子、免疫调节、抗原递呈等
作用，它同时参与机体的非特异性免疫和特异性免
疫。在非特异性免疫中，主要通过吞噬作用来消灭
和清除进入机体的病原体和异物，并介导炎症反应；
在特异性免疫中，巨噬细胞主要发挥免疫调节和抗
原递呈作用［７］。本研究结果表明，球兰皂苷能够显
著地促进小鼠腹腔巨噬细胞的增殖和提高细胞对中
性红的吞噬能力，在一定的剂量范围内，呈现剂量依
存关系。活细胞内存在乳酸脱氢酶，能够还原
ＭＴＴ，并形成不溶于水的紫色结晶物，结晶物的形
成数量与活细胞的量和细胞的活力成正比例。本研
究显示，小鼠腹腔巨噬细胞经球兰皂苷刺激后，结晶
物的形成量显著地高于对照组，表明球兰皂苷可以
活化巨噬细胞，提高巨噬细胞的增殖能力。对巨噬
细胞吞噬中性红能力的结果显示，球兰皂苷同样可
以显著地提高巨噬细胞的吞噬能力，说明球兰皂苷
具有一定的免疫增强作用，可以提高机体的非特异
性免疫。
３．２　一氧化氮（ＮＯ）广泛分布于生物体内各组织
中，是一种生物活性分子。一方面，适量的ＮＯ可以
杀伤肿瘤细胞等病原微生物，参与机体多种重要的
生理功能和防御机制；另一方面，过量的ＮＯ可对机
体产生伤害，是介导炎症的重要因素之一［８］。ＬＰＳ
作为巨噬细胞有效的刺激原，能够激活巨噬细胞并
诱导其产生 ＮＯ和分泌相关细胞因子。本研究显
示，球兰皂苷在２．５～１０．０μｇ·ｍＬ
－１范围内，能显
著地提高正常小鼠腹腔巨噬细胞 ＮＯ的生成水平，
表明球兰皂苷能够刺激小鼠腹腔巨噬细胞ＮＯ的生
成，且可能是通过诱导巨噬细胞上调ｉＮＯＳ的表达
这一作用机制，提高巨噬细胞ＮＯ的生成量，从而增
强机体的免疫功能，提高机体杀菌、抗病毒能力。
３．３　ＬＳＺ广泛存在于人体多种组织中，主要参与
机体的非特异性免疫反应，具有多种生理学功能，如
抗菌、抗病毒、抗肿瘤、止血、消肿止痛及加快组织恢
复功能等作用［９－１０］。谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨ－
Ｐｘ）是机体内广泛存在的一种重要的过氧化物分解
酶，能有效地保护机体免受过氧化物的损害。在本试
验中，以ＬＰＳ作为小鼠腹腔巨噬细胞的有效刺激原，
同时添加不同浓度的球兰皂苷，结果表明，在细胞中
添加１０．０～８０．０μｇ·ｍＬ
－１的球兰皂苷能显著地提
高ＬＳＺ的活性，添加剂量在１０．０～４０．０μｇ·ｍＬ
－１范
围内，可以显著地增强ＧＳＨ－Ｐｘ的活性，且都在４０．０
μｇ·ｍＬ
－１时作用最强。ＬＳＺ和ＧＳＨ－Ｐｘ在机体免
疫和防御过程中起着非常重要的作用，球兰皂苷能
够明显地提高小鼠腹腔巨噬细胞ＬＳＺ和 ＧＳＨ－Ｐｘ
和活性，增强机体的抗氧化能力，因而起到提高机体
免疫能力的作用。
３．４　ＴＮＦ－ɑ、ＩＬ－１β和ＩＬ－６是巨噬细胞分泌的最主
要的几种细胞因子，这几种细胞因子在机体的免疫
系统中都有着非常重要的作用，是机体免疫系统的
重要组成部分，有着非常广泛的生物学功能，特别是
在机体的免疫反应中，不但参与机体的各种免疫应
答反应，而且对机体的免疫反应有着重要的调节作
用。本研究表明，球兰皂苷在一定的剂量范围内，能
提高上述小鼠腹腔巨噬细胞几种细胞因子的分泌
量，因而能够增强机体的免疫力，提高机体的免疫功
能。
４　结　论
球兰皂苷在适当的剂量范围内，对小鼠腹腔巨
噬细胞的增殖能力、吞噬能力、ＬＳＺ和 ＧＳＨ－Ｐｘ的
活性、ＮＯ生成量、ＴＮＦ－ɑ、ＩＬ－１β和ＩＬ－６分泌量都
具有显著的提升作用，说明球兰皂苷对正常小鼠的
免疫功能具有明显地增强作用。
参考文献：
［１］　魏金婷，曾　碧，刘文奇．球兰属植物的研究进展
［Ｊ］．海南医学院学报，２００９，１５（１）：１－４．
［２］　洪敏俐，林向前．球兰止咳糖浆制备及临床观察［Ｊ］．
时珍国医国药，１９９９，１０（１１）：１－２．
２４８１
　１１期 陈义杰等：球兰皂苷对小鼠巨噬细胞免疫功能和抗氧化作用的影响
［３］　ＡＬＥＮ　Ｙ，ＮＡＫＡＪＩＭＡ　Ｓ，ＮＩＴＯＤＡ　Ｔ，ｅｔ　ａ１．
Ａｍｉｎｅｍａｔｏｄａｌ　ａｃｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｓｏｍｅ　ｔｒｏｐｉｃａｌ　ｒａｉｎｆｏｒｅｓｔ
ｐｌａｎｔｓ　ａｇａｉｎｓｔ　ｔｈｅ　ｐｉｎｅｗｏｏｄ　ｎｅｍａｔｏｄｅ ［Ｊ］．Ｚ
Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｅｈ，２０００，５５：２９５－２９９．
［４］　ＫＹＯＧＯＫＵ　Ｍ．Ｔｙｐｅ　Ｉ　ａｌｅｒｇｙ，Ｏｃｃｕｐａｔｉｏｎａｌ　ｓｔｈｍａ，
ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ａｌｅｒｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｈｅｐｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ　ｆｏｃｕｓｅｄ　ｏｎ
Ｈｏｙａ （ｓｅａｓｑｕｉｒｔ）ａｓｔｈｍａ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ　Ｆｒｏｎｉｅｒ，
１９９４，４：３８７－３９２．
［５］　ＪＹＯ　Ｉ，ＯＫＡ　Ｓ．Ｉｍｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　ａｎｄ　ｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｒｕｃ－
ｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｈｏｙａ（ｓｅａｓｑｕｉｒｔ）ａｎｔｉｇｅｎ［Ｊ］．Ｉｇａｋｕｎｏ　Ａｙｕ－
ｍｉ，１９９１，１５９：５６５－５６８．
［６］　陈炳华．球兰体外抑菌作用及球兰粗皂苷部分活性
研究［Ｄ］．福州：福建农林大学，２０１１．
［７］　ＳＯＤＨＩ　Ａ，ＰＡＮＤＥＹ　Ａ　Ｋ．Ｉｎ　ｖｉｔｒｏ　ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍｕ－
ｒｉｎｅ　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ　ｂｙ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　Ｙｏｐ：
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ，ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ　ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ
ａｎｄ　ｃｈｅｍｏｋｉｎｅｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，２０１１，２１６（３）：
３５８－３６６．
［８］　ＮＡＴＨＡＮ　Ｃ，ＸＩＥ　Ｑ　Ｗ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ｏｆ　ｎｉｔｒｉｃ　ｏｘｉｄｅ［Ｊ］．Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ，１９９４，２６９（１９）：
１３７２５－１３７２８．
［９］　程安玮，金征宇，万发春．甘草多糖对小鼠腹腔巨噬细
胞化学成分及胞内酶的影响［Ｊ］．食品与生物技术学
报，２００８，２７：７６－７９．
［１０］　程安玮，金征宇，万发春．甘草多糖对小鼠腹腔巨噬
细胞的激活作用［Ｊ］．食品科学，２００７，２８：４３１－４３４．
（编辑　白永平）
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