全 文 ：书江西农业学报 2016，28(7):27～31
Acta Agriculturae Jiangxi
http:/ /www．jxnyxb．com
DOI:10．19386 / j．cnki．jxnyxb．2016．07．06
香石竹 ＲNAi 载体的转化体系对
转基因抗性芽分化的影响
徐笑寒1，李枝林1，蒋亚莲2，3，卢珍红2，3，余蓉培2，3，周旭红2，3*
收稿日期:2016－01－04
基金项目:国家自然科学基金项目(31460530、31260491);国家观赏园艺工程技术研究中心项目(2012FU125X10);云南省应用基础
研究计划(2014FA044);云南省中青年学术和技术带头人培养计划(2015HB077)。
作者简介:徐笑寒(1989─)，男，浙江杭州人，硕士生，主要从事观赏植物资源利用与创新研究。* 通讯作者:周旭红。
(1．云南农业大学 园林园艺学院，云南 昆明 650201;2．云南省农业科学院 花卉研究所，云南 昆明 650205;
3．国家观赏园艺工程技术研究中心，云南 昆明 650601)
摘 要:将已构建的与减数分裂相关的 OSD1基因的 ＲNAi载体通过农杆菌转化香石竹品种‘Nogalte’，通过正交试
验，筛选得出如下最佳转化条件:预培养 4 d、黑暗下共培养 5 d、农杆菌菌液浓度 OD600 = 0．5、共培养基中 AS浓度 30 mg /
L、农杆菌侵染时间 30 min。
关键词:基因工程;农杆菌介导;正交试验;香石竹
中图分类号:S681．5 文献标志码:A 文章编号:1001－8581(2016)07－0027－05
Influence of ＲNAi Vector Transformation System on
Differentiation of Transgenic Ｒesistant Buds of Carnation
XU Xiao－han1，LI Zhi－lin1，JIANG Ya－lian2，3，LU Zhen－hong2，3，YU Ｒong－pei2，3，ZHOU Xu－hong2，3*
(1． College of Horticulture and Landscape，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China;2． Flower Ｒesearch
Institute，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming 650205，China;3． National Engineering Ｒesearch Center for Or-
namental Horticulture，Kunming 650601，China)
Abstract:The ＲNAi vector of OSD1 gene which was connected with meiosis was constructed and integrated into carnation
cultivar‘Nogalte’by Agrobacterium－mediated genetic transformation． Through orthogonal test，the optimal transformation condi-
tions were screened out as follows:pre－culture for 4 days，co－cultivation in dark for 5 days，concentration (OD600)of Agrobacte-
rium suspension solution being 0． 5，concentration of AS (acetosyringone) in co － cultivation medium being 30 mg /L，and
infection time of Agrobacterium being 30 min．
Key words:Genetic engineering;Agrobacterium－mediated transformation;Orthogonal test;Carnation
香石竹(Dianthus caryophyllus)，又名麝香石竹和
康乃馨，为石竹科多年生草本植物，是世界四大切花
之一，被誉为“母亲节”之花，在花卉市场中占有重要
的地位［1］。随着经济和社会的发展，人们对花卉的
需求量日益增大，对花卉的色、香、形等奇异的新品
种的需求也日益强烈。在农作物新品种育种中，转基
因技术具有高效、快捷、目标明确、性状稳定、育种年
限短等特点，相比于传统的育种手段有着较大的优
势。植物基因工程，又称植物遗传工程(plant genetic
engineering)、植物遗传转化(plant genetic transforma-
tion)等，是指利用 DNA 重组(DNA recombination)、细
胞组织培养等技术，将外源基因导入植物细胞或组
织，进而获得转基因植株的技术方法［3］。正交试验
设计和分析方法是目前最常用的工艺优化试验设计
和分析方法［2］。我们在研究香石竹转基因体系的建
立中，通过正交试验的方法提高了试验效率，得到了
令人满意的结论。
已知的研究在单细胞真菌、非洲爪蟾和老鼠的卵
母细胞中发现，APC /C(后期促进复合物)是关键的
细胞周期修饰物，它同时作用于有丝分裂和减数分
裂［4］。OSD1 基因家族是在拟南芥中发现的，拟南芥
OSD1(At3g57860)基因是有丝分裂 APC /C 的抑制
剂［5］，OSD1 突变能导致 2n 配子的形成。2n 配子在
花卉多倍体育种中起重要作用［6］。利用转基因技
术，可沉默与 2n配子形成相关的 OSD1 基因，培育高
频 2n配子的种质，为香石竹多倍体育种打下基础。
本研究利用已构建的香石竹 OSD1 基因 ＲNAi 载
体，通过农杆菌介导的方法对乙酰丁香酮浓度、预培
养的时间、菌液浓度、侵染时间及共培养时间对香石
竹抗性芽分化的影响进行了优化，建立了最佳转基因
再生体系，为香石竹的遗传育种打下了基础。
1 材料与方法
1．1 正交试验设计
选定影响转基因抗性再生植株频率的 5 个因素:
预培养时间、AS终浓度、共培养时间、菌液浓度、侵染
时间，选用 L18(3
7)正交表，绘制了因素水平表(见表
1)。
表 1 正交试验设计表 L18(3
7)
处理号
预培养
时间 /d
AS终浓度 /
(mg /L)
共培养
时间 /d
菌液浓度
(OD600)
侵染时
间 /min
1 2 10 3 0．3 10
2 2 20 4 0．5 20
3 2 30 5 0．8 30
4 3 10 3 0．5 20
5 3 20 4 0．8 30
6 3 30 5 0．3 10
7 4 10 4 0．3 30
8 4 20 5 0．5 10
9 4 30 3 0．8 20
10 2 10 5 0．8 20
11 2 20 3 0．3 30
12 2 30 4 0．5 10
13 3 10 4 0．8 10
14 3 20 5 0．3 20
15 3 30 3 0．5 30
16 4 10 5 0．5 30
17 4 20 3 0．8 10
18 4 30 4 0．3 20
1．2 试验材料和试验仪器
试验材料:香石竹品种‘Nogalte’为云南省农科
院花卉研究所基地种植培养。试验仪器:超净工作
台、摇床、紫外分光光度计、接种器、镊子、手术刀等。
试验试剂:AS(乙酰丁香酮)、TDZ(植物生长调节
剂)、NAA(萘乙酸)、MS 培养基、km(卡那霉素)、
YEB培养基。
1．3 试验过程
1．3．1 预培养 配制含 0．22 mg /L TDZ和 0．50 mg /L
NAA 的 MS 培养基，作为香石竹‘Nogalte’外植体的
预培养基。在超净工作台中，切下香石竹茎尖部分约
1 cm的两小段(去掉茎尖生长点)作为外植体，将其
放入配制好的预培养基中，分别标记好处理号，每个
试验设置 3 个重复，每个重复中放置 10 个外植体。
依据不同的试验组合，放入组培室(23 ℃)中分别光
照培养 2 ～ 4 d。
1．3．2 菌液配制 将 OSD1 基因的 ＲNAi 干扰载体
导入农杆菌 EHA105 菌株，吸取 1 μL的菌液至 50 μL
的 YEB液体培养基中，并加入 km(终浓度为 50 mg /
L)，分别放入摇床(28 ℃)中，以 200 r /min 培养约
12、24、40 h，经过紫外分光光度计测试，分别得到
OD600 = 0．3、0．5、0．8 这 3 种新鲜菌液。
1．3．3 侵染 在超净工作台上将预培养结束的外植
体取出，放入 10 mL的离心管中，分别加入上述 OD600
为 0．3、0． 5、0． 8 的 3 种菌液，在摇床(28 ℃、80 r /
min)中侵染 10 ～ 30 min。
1．3．4 共培养 在上述预培养基中加入终浓度为 10
～ 30 mg /L的 AS，作为共培养基。在超净工作台中将
侵染完成的外植体从离心管中取出，在吸水纸上先将
多余的农杆菌菌液吸干，再根据试验组合放入含不同
浓度 AS的共培养基中。标记好处理号，依据不同试
验组合在培养箱(23 ℃)中暗培养 3 ～ 5 d。
1．3．5 筛选培养 配制含 0．22 mg /L TDZ、0．50 mg /L
NAA 和 50 mg /L km 的 MS 培养基作为筛选培养基。
在超净工作台中，将共培养完成的香石竹外植体接入
筛选培养基中，放入组培室(23 ℃)继续培养。
2 结果与分析
采用 SPSS 20．0 软件统计香石竹外植体分化形
成的愈伤组织数、愈伤组织的状态、愈伤组织分化形
成的植株数和分化植株的状态，结果见表 2 和图 1。
由图 1 可见:将经农杆菌侵染的外植体放入筛选培养
基上(图 1a)，2 ～ 5 d后，外植体开始膨大(图 1b)，形
成黄色或黄绿色的疏松愈伤组织(图 1c ～图 1d);培
养 20 d左右时，黄绿色的愈伤组织开始分化成植株
(图 1e)，有些分化植株为正常的绿色植株(图 1f)，
有些植株出现玻璃化和白化现象(图 1g)，少数植株
叶片边缘出现褐化现象(图 1h)，大多数植株都呈现
玻璃化状态(图 1i)。
由表 2 可见，香石竹茎尖愈伤形成率很高，最高
可达 100%，最低为 22．22%，分化植株的愈伤比例从
12．50%至 73．33%，每个愈伤分化的植株数为 1．67 ～
55．00 棵。其中，12 号处理分化植株的愈伤比例最
高，13 号处理每个愈伤分化的植株数最多;刚分化出
来的愈伤大多数为黄绿色疏松的胚性愈伤，由愈伤分
化的植株大多数呈玻璃化状态。
从表 3 中可以看出:预培养 4 d 的愈伤形成率和
愈伤组织分化植株的比率最高;分化植株数以预培养
2 d最高，预培养 2、3 和 4 d 间无显著差异。综合考
虑，选择预培养 4 d为最佳预培养天数。
当 AS终浓度为 10 mg /L时愈伤形成率和分化植
株数最高;当 AS终浓度为 30 mg /L 时愈伤组织分化
植株的比率最高。从愈伤组织分化植株比率的角度
来看，共培养基中 AS浓度以 30 mg /L为宜。
当共培养时间为 3 d 时，愈伤形成率最高;当共
培养时间为 5 d 时，愈伤组织分化植株的比率最高;
当共培养时间为 4 d 时，愈伤组织分化植株数最多。
从愈伤组织分化植株比率的角度来看，共培养时间以
5 d为宜。
82 江 西 农 业 学 报 28卷
当菌液浓度 OD600 = 0．8 时，愈伤形成率最高;当
菌液浓度 OD600 = 0．5 时，愈伤组织分化植株的比率和
愈伤组织分化的植株数最高。综合考虑，菌液浓度
OD600 = 0．5 为最佳农杆菌侵染的浓度。
当侵染时间为 30 min 时，愈伤形成率和愈伤组
织分化植株的比率最高;当侵染时间为 10 min 时，愈
伤组织分化的植株数最多。综合考虑，菌液侵染时间
30 min为最佳侵染时间。
a:刚开始筛选的外植体;b:外植体开始膨大;c:黄色的疏松愈伤组织;d:黄绿色的疏松愈伤组织;e:黄绿色愈伤组织开始分化形
成植株;f:绿色正常的分化植株;g:白化和绿色玻璃化的分化植株;h:绿色玻璃化且边缘褐化的分化植株;i:绿色玻璃化的分化植株。
图中标尺长度为 1 cm。
图 1 转基因香石竹抗性芽的再生
表 2 香石竹外植体形成愈伤组织比率、分化植株比率、分化植株数及其状态
处理号 外植体数 愈伤形成率 /% 愈伤分化植株率 /% 分化植株数 愈伤组织状态 分化植株状态
1 25 100±0．00 ab 38．61±21．74 abcd 30．55±8．29 abc 黄绿色、疏松 绿色正常、绿色玻璃化
2 26 81．82±18．18 ab 52．38±30．28 abcd 29．78±11．44 abcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化且边缘褐化
3 30 93．94±6．06 ab 63．70±17．96 ab 14．44±2．66 cd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化且边缘褐化
4 19 100±0．00 ab 37．14±7．56 abcd 28．14±5．66 abcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化且边缘褐化
5 23 87．50±7．22 ab 38．10±43．64 abcd 20．13±7．61 bcd 黄色或黄绿色、疏松 绿色玻璃化
6 28 86．67±13．33 ab 44．44±19．25 abcd 20．08±7．10 bcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
7 28 100±0．00 ab 38．89±9．62 abcd 29．27±4．79 abcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
8 28 90．00±10．00 ab 58．73±13．75 abc 31．22±8．06 abc 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
9 24 100±0．00 ab 16．67±5．56 d 33．50±12．76 abcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
10 18 100±0．00 ab 21．25±12．37 cd 19．00±6．82 bcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
11 27 80．95±19．05 ab 23．33±20．82 cd 33．00±10．92 abc 黄色或黄绿色、疏松 绿色玻璃化
12 24 52．05±15．14 bc 73．33±23．09 a 38．13±9．02 ab 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
13 19 71．85±8．15 ab 16．67±28．87 d 55．00±25．32 a 黄色或黄绿色、疏松 绿色玻璃化
14 27 22．22±22．22 c 12．50±17．68 d 1．67±1．67 d 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
15 25 85．00±7．64 ab 35．32±27．67 bcd 27．00±8．66 abcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
16 20 85．71±14．29 ab 51．25±15．91 abcd 18．00±6．29 bcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
17 19 100±0．00 ab 42．22±23．41 abcd 15．25±4．43 cd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
18 23 91．67±22．93 ab 41．11±8．39 abcd 19．83±6．27 bcd 黄绿色、疏松 绿色玻璃化
3 讨论
3．1 香石竹转化条件的筛选
预培养在提高植物的遗传转化率中发挥重要作
用，预培养有利于促进植物创伤口处的细胞分裂，分
927期 徐笑寒等:香石竹 ＲNAi载体的转化体系对转基因抗性芽分化的影响
裂状态的细胞更容易整合外源 DNA，从而提高外源
基因的瞬时表达和转化率。在根癌农杆菌介导的
ACC氧化酶基因转化香石竹幼叶的研究中，最佳转
化条件是预培养 2 d［7］。Kanwar J K 等的试验表明 4
d是外植体分化愈伤组织的最佳预培养时间［8］。在
本试验中，最佳预培养时间也为 4 d。
表 3 各试验因素对香石竹愈伤组织形成及分化的影响
影响因素 处理值 愈伤形成率 /% 愈伤分化植株率 /% 分化植株数
预培养时间 /d 2 83．74±7．87 a 36．27±5．43 a 25．89±3．25 a
3 78．26±7．91 a 26．76±5．27 a 23．87±3．87 a
4 94．03±2．69 a 39．81±5．32 a 24．53±2．77 a
AS终浓度 /(mg /L) 10 92．51±5．29 a 32．10±5．40 a 28．42±3．39 a
20 79．96±7．88 a 35．31±6．24 a 24．27±3．78 a
30 83．55±7．11 a 35．43±5．86 a 22．61±2．81 a
共培养时间 /d 3 94．86±3．25 a 31．97±4．37 a 27．49±3．40 ab
4 77．92±7．21 a 32．06±4．42 a 29．78±3．80 a
5 83．24±80．5 a 38．81±7．68 a 18．66±2．58 b
菌液浓度(OD600) 0．3 83．93±8．36 a 31．32±4．52 a 25．08±3．26 a
0．5 80．64±7．03 a 39．59±3．77 a 29．11±3．51 a
0．8 91．45±5．08 a 31．93±7．79 a 20．40±3．02 a
侵染时间 /min 10 82．24±8．00 a 36．85±6．06 a 28．43±3．63 a
20 84．43±9．04 a 26．88±4．81 a 24．21±4．01 a
30 89．36±2．50 a 39．11±5．19 a 22．14±2．48 a
3 讨论
3．1 香石竹转化条件的筛选
预培养在提高植物的遗传转化率中发挥重要作
用，预培养有利于促进植物创伤口处的细胞分裂，分
裂状态的细胞更容易整合外源 DNA，从而提高外源
基因的瞬时表达和转化率。在根癌农杆菌介导的
ACC氧化酶基因转化香石竹幼叶的研究中，最佳转
化条件是预培养 2 d［7］。Kanwar J K 等的试验表明 4
d是外植体分化愈伤组织的最佳预培养时间［8］。在
本试验中，最佳预培养时间也为 4 d。
农杆菌和外植体共培养是整个转化过程中非常
重要的环节，它决定着植物细胞与农杆菌是否相互作
用。农杆菌附着、T－DNA 的转移及外源基因的整合
都在共培养时期进行。前人的研究表明适宜的共培
养时间为 3 ～ 4 d［8］。本试验的最佳共培养时间为
5 d。
共培养是 Ti质粒实现 T－DNA 转化的途径，而乙
酞丁香酮(AS)对 Vir 区基因的活化具有重要的作
用。本实验经过测定，得出在添加 30 mg /L AS 的培
养基中进行共培养，能获得较高的抗性植株百分率。
农杆菌的侵染时间及菌液浓度对遗传转化起着
非常重要的作用。若外植体在菌液中浸泡时间太短，
则农杆菌尚未接种到伤口面，在培养时无农杆菌生
长，不能转化;如果外植体在菌液中浸泡时间太长，
则容易出现污染。故要选择合适的农杆菌的浓度及
侵染时间。本实验得出菌液浓度 OD600 = 0．5、侵染时
间 30 min为最佳条件。
3．2 外植体材料的选择
香石竹再生体系多选用叶片为外植体［7，9－10］。而
本实验以茎尖作为外植体也能获得较高的再生率，而
以叶片为外植体获得再生植株的数量少(实验结果
未发表)。这可能是因为顶芽主要由分生组织构成，
而分生组织是由未分化状态的细胞构成的细胞群体，
所以顶芽具有分裂速度快的特点，以茎尖作为外植体
能够直接通过器官发生途径产生完整植株，避免经过
脱分化和再分化的复杂过程，这样就避免了由于这些
复杂过程而引发的突变以及不正常株形的产生。但
是也存在着不利因素，由于将农杆菌的 T－DNA 转入
植物细胞中，不能保证转化全部细胞，所以所得到的
转基因植株有可能是完全转化的植株，也有可能是部
分被转化的嵌合体植株，而嵌合体是不具有遗传功能
的，只能在后期再进行筛选观察。
3．3 再生植株玻璃化的防治
香石竹再生植株绝大多数会出现玻璃化，可能是
因为从愈伤诱导植株时培养基中所含激素水平过高。
因此可将再生植株接入激素水平较低的繁殖培养基
中，经过 2 ～ 3 轮的培养，可将玻璃化苗培养成正常的
绿色植株［11］。
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(责任编辑:黄荣华)
137期 徐笑寒等:香石竹 ＲNAi载体的转化体系对转基因抗性芽分化的影响