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草 业 科 学
P R A T A C U I
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鬓 高羊茅遗传转化研究进展
吴关庭 , 陈锦清
(浙江省农业科学院病毒学与生 物技术研究所 ,浙 江 杭州 3 10 0 2 1)
摘要 : 高羊茅 eF s t u ca a ur , id an ce a 是一种在世界沮 带地 区广泛 种植 的很重要的 多年 生冷季型牧草和 草坪
草 , 长期以 来其品种改 良主要依靠常规育种方法 。 植物基因工程技术的发展为高羊茅新 品种选 育提供 了 一
种很有潜力的手段 , 目前国 内外的许多公司和 实脸室都在利 用转基 因技术 改 良该草种 的封逆性 、病 虫害和
除草剂杭性 以及品质等性状 。 本丈从受体 材料 、 转化 方法 、 目标基 因 、 影响 因素 、 转基 因遗传 等多个方 面 综
述 了迄今为止高羊茅遗传转化研究所取得 的进展 。
关挂词 : 高羊茅 ; 基因工程 ; 受体材料 ;转化 方法 ;转基因 ;遗传
中圈分类号 : 5 54 3 + . 9 0 3 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 1一 0 6 2 9 ( 2 0 0 6 ) 12 一 0 0 5 1一 0 4
高羊茅 F e s t u e a a r u , d i n a c e a 属于 禾本科羊
茅属 ,是一种异花授粉的六倍体多年生冷季型 草
种 , 在世界温带地 区广泛分布 , 既可作为牧草种
植 , 也可用作草坪草 。 近几年来 ,高羊茅作为草坪
草利用发展很快 , 我国许多省区都已引种栽培 〔` 〕 ,
且建植面积正在不断扩大 。 因此 , 高羊茅遗传改
良对发展草坪业和畜牧业具有十分重要的意义 。
一直以来 , 同其他牧草和草坪草一样 ,高羊茅
新品种培育基本上都是采用杂交育种和系统选育
等方法 ,这些常规育种方法对可利用 的种质资源
依赖性强 , 育种周期较长 。 植物基 因工程技术的
发展为高羊茅耐逆性 、病虫害和除草剂抗性 、 品质
以及其它诸多性状的遗传改良提供了一种很有潜
力的手段阁 。 作为一种单子 叶植物 , 高羊茅离体
遗传操纵困难 ,但自 20 世纪 90 年代初以来 ,经过
1 0 多年的不断努力以及随着植物组织培养技术
和转基因技术的日益成熟与完善 , 高羊茅遗传转
化研究已取得了较大进展 。
1 转化受体材料
在植物转基因研究中 , 多种材料可用作转化
受体 。 到 目前为止 , 高羊茅遗传转化研究采用 的
受体材料主要是原生质体〔3一 l0j 和胚性悬 浮培 养
物〔川幻 , 1 9 9 2 年首次获得的高羊茅转基 因植株 即
来源于原 生 质体 a[, 叼 。 由于 在 高羊 茅组 织 培 养
中 , 胚性悬浮培养物和原 生质体基本上都是直接
或间接来源于胚性愈伤组织 , 而由胚性愈伤组织
建立胚性悬浮培养物和原生质体不仅存在技术上
的难度 , 费时 、 费力 ,并且也会给植株再生尤其是
绿苗再生带来困难 ,所 以直接 以胚性愈伤组织作
为受体材料对高羊茅转基因改 良更具实际意义 。
最近 , 高羊茅胚性愈伤组 织 的遗传转化 已获 成
功 [ ” 一 ” 〕 。 此外 , C h o 等 [ 2。 ]通过转化从高羊茅胚性
愈伤组织诱导产生的高频再生组织获得 了转基因
植株 ,这种高频再生组织本身并不是胚胎发生 , 而
是器官发生的 , 具有 多个淡绿色 的芽分生组织样
的结构 ,能够再生出多个小苗 ,且再生能力可保持
很长时间 。
2 转化方法
根据受体材料的不同 , 迄今至少 已有 5 种方
法在高羊茅遗传转化研究 中得到 了应用 , 包括聚
乙二醇 ( P E G ) 法 、 电激法 、 碳化硅纤维法 、 基 因枪
法和农杆菌介导法 。 P E G 法 〔` 一 ’ 01 和电激法 s[] 用于
转化原生质体 , 而基 因枪法则用于转化胚性悬浮
细胞 lt · , ` · ’ 5〕 、 胚 性愈 伤组 织 〔’ 幻 和 高频 再 生 组
织 [2。 ] 。 D a l t o n 等 [ ’ 幻采用碳化硅纤维法转化高羊
茅细胞悬浮培养物 , 获得 了转基因植株 。 农杆菌
介导法与其它方法相 比 ,具有转化频率高 、 转基因
拷贝数低 、 导人片段确定性强 、 能够转化 大片段
D N A
、操作简便 、 费用低廉等多个优点 , 因而正在
收稿日期 : 20 0 6一 1 1一 0 3
作者简介 : 昊关庭 ( 1 9 63 一 ) , 男 , 浙江谙山人 , 研究员 , 博士 .
通讯作者 : 陈锦清 E m a i l : y z n s z d z @ z a a s · o r g
PR A T A C U T U LR A L岌二I E N C E ( Vo l . 23 , N o . 12 ) 1 2 / 2 0 0 6
成为植物基因工程工作者开展遗传转化研究的首
选方法 。 高羊茅作为单子叶植物 , 农杆菌介导转
化难度很大 ,但随着该技术本身的不断发展和经
过研究者的努力 , 近年来这方 面的研究已取得突
破性进展 。 B e t t a n y 等 [ ’ ` ]和 H u 等 [ ’ ` ]先后采用农
杆菌介导法成功转化了高羊茅胚性悬浮细胞 。 吴
关庭〔` ’ 〕在一 系列研究的基础上 , 建立 了农杆菌介
导高羊茅胚性愈伤组织遗传转化体系 。 几乎与此
同时 , W a n g 等〔’ 叼采用农杆菌介导法也对 高羊茅
胚性愈伤组织进行了成功转化 。
3 转化的目标墓因
早期的高羊茅转基因研究的主要 目的是为了
建立遗传转化体系 , 因此所转的外源基因只局限
于选择基因 h p t( 潮霉素磷酸转移酶基 因 ) 和 b ar
(麟丝菌素 乙 酞转移酶基 因 ) 以及报 告基 因 g us
(葡搪昔酸酶基因 )[ 3一 , · ` ’ · ” · ’ 。 〕 。 虽然 ab r 基 因表达
产生的除草剂抗性可兼作一个有益性状利用 , 但
已有文献中真正有意识导人高羊茅的第一个农业
上有重 要用 途的 目标基 因则是 向 日葵 H el i a n 一
t人u 、 a n n u : 清蛋白基因 ( s f a s ) 〔` , ] 。 向日葵清蛋 白
含有 23 %的甲硫氨酸和半胧氨酸 ,这 2 种含硫氨
基酸都属于反当动物营养中最为限制性的必需氨
基酸 ,尤其是在正常放牧条件下 ,羊毛的生长经常
受到含硫氨基酸供应的限制 。 所 以 , 将 sf as 基因
导人牧草型高羊茅 , 表达产生含硫氨基酸丰富的
优质蛋 白质 ,对提高动物生产率 ,特别是促进羊毛
生长具有重要意义 。 研究结果表明 , s fas 基因在
高羊茅转基因植株中表达后 , 相应的富硫向日葵
清蛋白积累至总可溶性蛋 白的 0 . 2% 。 最 近 , 为
改良草坪型高羊茅的耐逆性 , 吴关廷〔” 〕将拟南芥
A ; a 吞i“ o P s i : t h a l i 。 n a C B F I 基 因通过农杆菌介
导法导入 4 个受体品种的基因组 , 获得 了耐逆性
增强的转基 因植株 。 H u 等〔’幻用根癌农杆菌的细
胞分裂素生物合成限速酶异戊烯基转移酶基因
iP t 转化高羊茅 ,获得的转基因植株的叶绿素 a 和
b 的含量明显提高 ,分萦能力和耐冷性大大增强 ,
低温下的滞绿期延长 。
4 遗传转化影响因素
基因型是影响植物遗传转化效果的一个重要
因素 , 高羊茅也不例外 。 研究表明 , 高羊茅转化频
率的品种间差异少则在 2 倍以上 仁` ’ · ” 〕 , 多则超过
6 倍〔’叼 。 所以 ,在开展高羊茅遗传转化研究时 , 对
品种进行选择是 十分必要 的 。 除 了品种间差异
外 ,源 自同一品种 的不同受体材料间转化效果亦
有较大差别 [ ’ 6〕 。
转化条件对高羊茅转化效率影响很大 。 昊关
庭在以 g us 基 因瞬时表达频率为指标 ,研究建立
农杆菌介导高羊茅胚性愈伤组织遗传转化体系时
发现 ,培养基尤其是共培养基 中乙酞丁香酮 的添
加对高羊茅的农杆菌介导转化至关重要 ;愈伤组
织预培养能使转化效率得到较大提高 , 特别是在
培养基 中添加 0 . 5 m g I/ J 的 B A P 和 N A A 后 , 获
得 了比含 2 . 0 m g / L Z , 4一D 的普通继代培养基更
高的转化效率 ;菌液浓度和共培养时间等因素对
转化效率也有很大影响 , 菌液浓度过低或共 培养
时间太短 , 因农杆菌细胞数或侵 染量不足使转化
效率较低 , 但若菌液浓度过高或共培养时间太长 ,
则由于对高羊茅细胞造成严 重伤害 ,也会导致转
化效率降低 [” J 。
在高羊茅遗传转化研究中 ,转化体大多采用
潮霉素筛选 。 高羊茅对潮霉素具有很强的内源抗
性川 ,潮霉素浓度为 150 m g I/ J 时 ,少量未经转化
的胚性愈伤组织或细胞团仍能生长比 ” 〕 , 只有 当
潮霉素浓度达到 25 0 m g / L 时 , 培养物才完全停
止生长或褐化致死 l[ ` · ’ 7〕 。 由于这个原因 , 在以往
的研究中 , 即使是同一种受体材料 ,不同研究所使
用的潮霉素筛选浓度也相差很大 [` ’ 一 ’ 3 ] 。 为明确最
佳的潮霉素筛选浓度 , 昊关庭 〔” 〕研究 比较 了不同
浓度潮霉素对高羊茅转化效率的影 响 。 结果表
明 ,在 50 和 1 0 0 m g I/ J 潮霉素的低选择压下连续
筛选 , 会有非转化细胞的逃逸但不能再生 ,最终获
得的转基因植株数最多 , 当潮霉素浓度超过 1 50
m g / L 后 , 转化频率逐渐降低 。 n a l t o n 等〔5〕亦获
得了类似的研究结果 , 同时还发现 , 筛选方式与转
基因拷贝数有关 。 不连续筛选和低浓度连续筛选
所产生的转基因植株 中 , 含 2 个或 2 个以下转基
. 因拷贝的植株比例很高 , 分别达 87 %和 8 % , 而
高浓度潮霉素连续筛选则有利于多拷贝转基因植
株的再生 。 S p a n g e n b e r g 等 [” 〕也研究 比较了不同
筛选方式对高羊茅遗传转化效果的影响 。 他们用
2 1/2 0 0 6 草 业 科 学 (第 2 3 卷 2 1期 )
基因枪轰击高羊茅胚性悬 浮细胞 , 然后采用两种
方式进行转化体的筛选 , 一种是处理后的胚性悬
浮细胞先在潮霉素浓度逐步提高的液体培养基 中
筛选 ,然后转至固体培养基上继续筛选 ;另一种是
只在固体培养基上连续筛选 。 结果证明 , 采用前
一方式可使抗潮霉素愈伤组织的得率比后一方式
提高一倍 。 此外 ,该研究还表明 ,基因枪轰击前对
胚性悬浮细胞进行高渗预处理可导致 g u s 基因瞬
间表达事件大量增加 。
细胞悬浮培养物的培养时间对高羊茅转基因
植株再 生 至关 重要 [ ’ 2 ] 。 K u a i 和 M o r r i s 研究 表
明 ,用于分离原生质体的细胞培养物的继代保存
时间和分离前的继代培养时间对 g u s 基因的瞬间
和稳定表达有显著影响 6j[ 。 随着悬浮培养物继代
保存时间的延长 , 一方 面 ,植株再生能力下 降 , 白
苗增多 , 另一方面 , g us 基 因瞬间表达水平和稳定
表达频率逐渐降低 。 使用从继代培养 3 ~ 4 d 的
悬浮培养物分离的原生质体 , g u s 基 因瞬间表达
水平最高 , 而使用从继代培养 1 和 7 d 的悬 浮培
养物分离的原生质体 , g u s 基 因瞬间表达水平 还
不到其一半 。 原生质体分离前的继代培养时间对
g u s 基因瞬间表达的影响与细胞培养物 的生长率
和蛋白合成速率密切相关 。 K ua i 和 M or ir s 还发
现 , 延长细胞壁 消化酶消化细胞的时间会对 g us
基因的瞬间表达产生抑制作用困 。 培养基的渗透
势也是影响高羊茅遗传转化效果 的一个重要 因
素 。 在一定范围内 , 随着转化培养基 中渗透势的
提高 , g u s 基因的瞬间和稳定 表达水平增强 。 同
样 , 原生质体培养基的渗透势对 g u s 阳性细胞团
数和转化频率也有显著作用 。
采用裸露 D N A 基因转化方法时 ,大多数研究
者使用 l : l 的克分子 基因 比 ( m o l a r g e n e r a t io ,
M G R )进行共转化 。 B e t t a n y 等 [` 。 ]用不 同 M G R
的标记基因 g u s 和选择基因 h tP 共转化高羊茅原
生质体 ,在再生获得的独立转基因植株中 ,共转化
植株的比例倾向于随着标记基因比例的提高而提
高 ,而共表达植株的比例则以 M G R 为 4 , 1时最
高 。 这一研究结果 表明 , 以较高的 M G R 添加非
选择性和选择性转基因可能会提高两基因共表达
植株的比例 。
5 转基因在后代中的遗传
在植物遗传转化研究 中 ,仅仅将 目标基因导
入受体植物基因组是不够的 , 还必须保证其能够
稳定表达和遗传 , 这样才能得 到真正有利用价值
的转基因后代 。 目前 , 有关高羊茅转基 因遗传的
报道还不多 , 已有的研究结果也不尽一致 。 W a gn
等 l0[ ,川在采用基因枪法 和农 杆菌介 导法获得 的
高羊茅转基因后代中观察到 , 外源基 因能够按照
孟德尔分离 比正常传递 。 然而 , 吴关庭在对 l 个
由转基因植株与对照植株异交产生的 T l 代群体
进行检测后发现 , 外源基 因的遗传严重偏离 了孟
德尔分离比〔” ] 。 K u a i 等 [ 9 ]共转化 获得 b a r 基因
稳定高效表达的高羊茅转基因植株 , 但在其异交
的 2 个后代群体中 ,都没有检测到该转基因的存
在 。 据推测 , 造成这种现象的原因之一可能是转
基因使单倍体花粉丧失了一种重要功能 , 正如在
玉米中所观察到的那样2[ 〕 , 从而使得外源基因通
过花粉传递的效率非常低 。
6 结束语
综上所述 ,迄今为止 的高羊茅遗传转化研究
已建立起多种方法 的转基 因技术体系 , 尤其是农
杆菌介导胚性愈伤组织遗传转化体系的建立为高
羊茅遗传改 良提供了一条有效的技术途径 , 同时 ,
最新的研究结果也令人鼓舞仁` 5 , ” · ’ `〕 。 高羊茅是在
我国应用的主要草坪草之一 , 但草坪建植所需种
子基本上都依靠从国外进 口 , 因此 , 培育拥有自主
知识产权 、 更适合于本国生态条件的高羊茅新品
种并实现产业化已成为我国草坪业界所面临的一
项重要任务 。 可 以相信 , 在这一高羊茅新品种选
育进程中 ,转基因技术将发挥重要作用 。
参考文献 :
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[ 9〕 K u a i B K , aD l t o n S J , eB t t a n y A J E , 以 a l . R e g e n -
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q u e n e y o f e -o t r a n s f o r m a t io n a n d e -o e x p r e s s io n o f
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r e g e n e r a t iv e t is s u e s [ J〕 . P la n t C e l l R e p . , 20 0 0 ,
19
: 1 0 8 4
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10 8 9
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20 0 3
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39 ( 3 ) : 2 7 7
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28 2
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1 9 96
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: 7 52
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7 6 1
.
23 卷 1 2期
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23
,
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.
1 2
草 业 科 学
P R A T A C U I T U R A L S C I E N C E
5 5
1 2 / 20 0 6
根癌农杆菌介导 A t N H X I 基因
转化紫花首蓓的研究
王 强龙 ` , 2 , 王锁民 ` , 张金林 ` , 包爱科 ’ , 陈托兄 ’ , 楼洁琼 ’ , 陆 妮
(1
. 兰州大学草地农业科技学院 , 甘肃 兰州 7 3 0 0 0 ; 2 . 内江师范学院 , 四川 内江 6 4 1 11 2 )
摘要 :在已 建立的萦花首篇 M云id ca g o s at i va 体细胞胚高频 再生体 系的基础上 , 研究 了 0 氏。 。 、 俊染时 间 、 负
压处理 、预 培养及共培养时间 、 脱菌及选择方 法等因子 对转化 效率的影响 , 并初 步获得 了杭性体胚 .
关健词 : 萦花首枪 ; 体细胞胚 ;根疮农杆菌 ; A t N H X I ;遗传 转化
中圈分类号 : 5 5 5 1+ . 7 0 1 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 1一0 6 2 9 ( 2 0 0 6 ) 12一 0 0 5 5 一 0 5
土壤盐碱化是人类面临的世界性难题 。 据不
完全统计 , 全球 约有 9 . 5 X 10 “ h m Z 盐碱地 , 分布
于 1 0 0 多个国家 ,其中中国的盐渍地面积约为9 . 9
x 10
,
hm Z
, 并有逐年扩大的趋势 l[, 2〕 。 通过生物
技术培育耐盐作物 品种是 改 良利用大面积盐荒
地 、 缓解我国现有人 口 对土地压力的有效措施之
一 。 紫花首楷 M e d i ca g o s at i va 素有 “ 牧草之王 ”
的美称 , 具有丰富的营养价值和广泛的生态适应
性闭 。 研究表明 ,在盐碱地 上种植紫花首楷可以
显著改善盐渍土的理化性质 ,降低土壤含盐量闭 。
但由于紫花首箱数千年来生 长在低盐或非盐渍
化土壤 中 , 其抗 盐 能力较 弱 , 属 于 中等抗 盐作
物 ,所 以较难在盐碱地上种植 。 N +a 是造 成植 物
盐害的主要离子之一 。 植 物细胞抵御其内部 盐
胁迫 的主要方式是将细胞内过多 的 N +a 泵入液
泡 , 这一过 程是 由液 泡膜 N +a / H 十 逆 向转运 蛋
白 ( A t N H X I ) 完成的 。 将抗盐基因 A t N H X I 转
入其它作物如番茄 I J y e o p e r s ie o n e s e u l e n t u m [ 5 ] 、
油菜 B r a s s i e a n a p u s [ 6 ] 、 小麦 T r i t i v u m a e s t i v u m 〔 ’ 〕
和玉米 Z ea m ao ys sj[ 等 已有许多成功 报道 , 而且
抗盐基 因 A t N H X I的表达确实能够明显提 高上
收稿日期 : 2 0 0 6一 0 3一 0 6
基金项 目 : 国家自然科学 基金项 目 ( 30 67 14 8 8) 和新世纪优秀
人才支持计划 ( N C E T 一 0 5一 0 8 8 2 )
作者简介 : 王强龙 ( 1 9 78一 ) , 男 , 甘肃甘谷人 , 在读硕 士生 , 研 究
方向为植物基因工程 。
通迅作者 : 王锁民 E _ m a i l : s m w a n g @ l z u . e d u . c n
A d v a n ce s i n s t ud ie s
o n g e n e t ie t r a n s fo rm
a t io n o f t a l l fe SC u e
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C H E N J i n
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,
Z h ej i a n g A e a d e m y o f A g r i e u l t u r a l
S e i e n e e s
,
H a n g z h o u 3 1 0 0 2 1
,
C h i n a )
A b s t ar e t
:
T a l l f e s e u e ( F e s t u e a a r u n d i n a c e a ) 15 a n im P o r t a n t P e r e n n i a l e o o l
一 s e a s o n g r a s s s P e e i e s w id e ly
p l a n t e d f o r f o r a g e a n d t u r f p u r P o s e s i n t e m p e r a t e r e g io n s t h r o u g h o u t t h e w o r ld
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F o r a lo n g t im e
,
t a l l
f e s e u e h a s b e e n im p r o v e d b y t r a d i t i o n a l b r e e d i n g
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A d v a n e e s i n t r a n s g e n i e t e e h n o l o g y h a v e p r o v id e d a n
e f f e e t i v e w a y f o r d e v e l o pm e n t o f n e w e u l t iv a r s o f t a l l f e s e u e
.
A t p r e s e n t
, s t u d i e s t o im p r o v e t o le r
-
a n e e s t o a d v e r s e e n v i r o n m e n t s
, r e s i s t a n e e s t o d i s e a s e s
,
p e s t s a n d h e r b i e id e s a s w e l l a s q u a l i t y t r a i t s o f
t h i s g r a s s s p e e i e s b y g e n e t i e e n g i n e e r i n g a r e b e i n g e a r r i e d o u t i n a l o t o f e o m p a n i e s a n d la b o r a t o r i e s a t
h o m e a n d a b r o a d
.
I n t h i s p a P e r
, P r o g r e s s e s i n g e n e t i e t r a n s f o r m a t io n o f t a l l f e s e u e w e r e r e v ie w e d i n
t e r m s o f r e e i p i e n t m a t e r i a l s
,
t r a n s f o r m a t i o n m e t h o d s
, t a r g e t g e n e s
,
i n f l u e n e i n g f a e t o r s a n d t r a n s g e n e
i n h e r i t a n e e
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K e y w o dr s
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