全 文 ：羽苔素 E对白念珠菌细胞内氟康唑浓度的影响研究＊
冷萍1, 2 ,郭秀丽 1＊＊ ,邢杰 1 ,娄红祥 1＊＊
(1.山东大学药学院 ,济南 250012;2.青岛大学附属医院药剂科 , 青岛 266003)
摘要　目的:建立高效液相色谱质谱联用技术测定耐药真菌细胞内氟康唑的浓度并观察羽苔素 E对细胞内氟康唑聚集的影
响。方法:将白念耐药株菌悬液与氟康唑单独培养或氟康唑和羽苔素 E联合培养 24h后 , 经离心 、皂化 、提取等过程得到菌体
细胞内聚集的氟康唑。样品以 Phenomenex-C18柱(250mm×4.6 mm, 5 μm)色谱柱进行分离 ,流动相为醋酸铵 -乙腈(3∶7, v/
v), 流速 0.8 mL· min-1。正离子方式检测 ,多反应监测(MRM)方式测定样品浓度 ,监测离子对分别为 m/z307.4※ 220.3 (氟
康唑)和 m/z531.2 ※ 489.3(内标酮康唑)。通过测定氟康唑的浓度 , 观察不同浓度羽苔素 E对细胞内氟康唑浓度的影响。
结果:高效液相色谱质谱联用法可用于真菌细胞内氟康唑浓度的测定。氟康唑在 1 ～ 100 μg· L-1浓度范围内线性关系良好
(r=0.9956), 最低定量限为 1 μg· L-1。低 、中 、高 3种浓度质控样品的日内 、日间精密度小于 6.4%, 方法回收率 94.1% ～
98.3%。并且羽苔素 E能显著增加耐药株细胞内氟康唑的浓度 , 呈剂量依赖性。结论:羽苔素 E能显著提高耐药株菌体细胞
内氟康唑的浓度 , 是羽苔素 E和氟康唑合用产生协同作用的重要机理 , 提示羽苔素 E可能具有逆转氟康唑耐药的作用。
关键词:羽苔素 E;氟康唑;白色念珠菌;液相色谱质谱联用;真菌耐药
中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:0254-1793(2009)04-0564-05
HPLC-MSdeterminationconcentrationoffluconazoleandthe
impactofplagiochinEinCandidaalbicans＊
LENGPing1, 2 , GUOXiu-li1＊＊ , XINGJie1 , LOUHong-xiang1＊＊
(1.SchoolofPharmacy, ShandongUniversity, Jinan250012, China;
2.DepartmentofPharmacy, TheAfiliatedHospitalofQingdaoUniversity, Qingdao266003, China)
Abstract　Objective:TodevelopabioanalyticalmethodusingHPLC-MSfordetectingtheconcentrationofflu-
conazole(FLC)inCandidaalbican(C.albicans)celsandconsequentlyevaluatingtheimpactofplagiochinE
(PLE)ontheaccumulationofFLCinFLC-resistantC.albicanscels.Methods:FLC-resistantC.albicanscels
weretreatedwithFLCorFLCwithPLEtogether.SamplesofC.albicansthalusthatwereobtainedbycentrifuging
after24hincubationsaponifiedandcentrifugedtoextractFLC.TheHPLCseparationwasperformedonaPhenome-
nex-C18(250 mm×4.6mm, 5 μm)column, usingammoniumacetate-acetonitrile(3∶7, v/v)asmobilephase,
withaflowrateof0.8mL· min-1.Thesamplewasanalyzedinthepositive-ionmode.Thenmultiplereactionmo-
nitoringmodewiththetransitionofm/z307.4※220.3andm/z531.2※489.3 wereusedtoquantifyfluconazole
andketoconazole(IS), respectively.Results:AgoodlinearityofFLCwasobtainedintheconcentrationrangeof1
-100 μg· L-1(r=0.9956).Thelowerquantitativelimitwas1 μgL-1.Theinter-andintra-dayRSDswere
lessthan6.4%, themethodrecoverieswereintherangeof94.1%-98.3%.ResultsshowedthatPLEfacilitated
theaccumulationofFLCinFLC-resistantC.albicanscelssignificantlyinadose-dependentmanner.Conclu-
sion:PLEcanincreasetheconcentrationofFLCinFLC-resistantC.albicanscelsmarkedly.Thiscanbeoneof
theimportantmechanismsatributedtothesynergeticefectofPLEincombinationwithFLCagainsttheresistant
strains.
Keywords:plagiochinE;fluconazole;Candidaalbicans;HPLC-MS;fungalresistance
—564— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)
＊
＊＊
国家自然科学基金资助课题(30672531)
通讯作者　郭秀丽　Tel:(0531)88382542;E-mail:guoxl@sdu.edu.cn
　　　　　娄红祥　Tel:(0531)88382019;E-mail:louhongxiang@sdu.edu.cn
DOI :10.16155/j.0254-1793.2009.04.014
　　羽苔素 E(plagiochinE, PLE)是一种新型的双
联苄类化合物 ,是由苔藓植物地钱中提取分离得到
的一系列天然植物酚类化合物之一。本课题组前期
的实验结果表明 PLE与氟康唑(fluconazole, FLC)合
用 ,可明显降低 FLC对白念耐药菌株的用量 ,使
FLC在低剂量时仍能发挥抗真菌作用 [ 1] ,提示 PLE
可能升高真菌细胞内 FLC浓度 ,从而逆转白念珠菌
对 FLC的耐药。因此 ,本文旨在观察不同剂量的
PLE对白念耐药菌株中 FLC浓度的影响。针对白
念耐药菌株中 FLC浓度较低的特点 ,我们对以前已
建立的高效液相色谱与质谱联用检测 FLC浓度的
方法进行了改进 [ 2] ,从而能够较准确地测定真菌细
胞内 FLC的浓度 ,以期对 PLE逆转 FLC耐药的机制
做初步探讨 。
1　材料
1.1　药品与试剂　FLC对照品(纯度 99.8%)由山
东省生物药物研究院提供 ,内标酮康唑对照品购自
中国药品生物制品检定所 , PLE由山东大学药学院
天然药化实验室提供。甲醇 、乙腈 、醋酸铵为色谱
醇 ,美国 FisherScientific公司生产 ,其余试剂均为分
析醇 ,水为纯净水 。
1.2　仪器　HP1100高效液相色谱仪(德国 Agilent
公司), API4000质谱仪(美国 AB公司),配有电喷
雾离子源。
1.3　实验菌株　1株白色念珠菌耐药菌 QL-28由
山东省齐鲁制药厂真菌研究中心提供 , MIC=128
μg·mL-1。
2　方法与结果
2.1　色谱条件　色谱柱:Phenomenex-C18柱(250
mm×4.6 mm, 5 μm);流动相为醋酸铵 -乙腈(3∶
7),流速 0.8mL· min-1;柱温 30℃;进样体积为 10
μL;样品采集时间为 4.5min。
2.2　质谱条件
离子源为电喷雾离子源 ,离子喷射电压为 5.5
kV;FLC与内标酮康唑的 DP电压分别为 120, 120
V;气帘气体(N2)压力为 68.9 kPa;离子源气体 1
(N2)压力为 378.95 kPa,离子源气体 2(N2)压力为
344.5 kPa,温度为 550℃。
正离子方式检测 , 扫描方式为多反应监测
(MRM);FLC与内标酮康唑的碰撞诱导解离电压分
别为 30, 45 eV。用于定量分析的离子对分别为 m/z
307.4※220.3 (FLC)和 m/z531.2 ※489.3 (内标
酮康唑)。
2.3　样品制备　白念耐药株 QL-28在 SDA培养
基上 2次培养 ,以保证菌株的纯度和生长力。调整
菌悬液的浓度是 108cfu·mL-1。加入菌悬液 2 mL、
FLC甲醇溶液(7.5 μg· mL-1)1 mL、不同浓度的
PLE溶液(PLE溶解于二甲基亚砜中制得)适量 ,最
后加 RPMI-1640液体培养基至 30mL,则菌悬液的
终浓度是 0.6×107 cfu· mL-1 , FLC的最终浓度是
0.25 μg· mL-1。 PLE的浓度分别是 8, 32, 128 μg
·mL-1 ,相对应的分别是 0.5, 2, 8MIC(PLE对白念
菌株的 MIC值为 16μg·mL-1)。在 35℃菌悬液振
荡培养 24 h, 3000 r· min-1离心 10 min得菌体沉
淀。将真菌细胞进行冷冻干燥。称取冻干的白色念
珠菌细胞 4 mg, 加入 PBS缓冲液 (pH=7.4)0.2
mL, 15%氢氧化钠甲醇溶液 0.4 mL(15 g氢氧化钠
溶于 10mL三蒸水中 ,加甲醇至 100 mL),加入酮康
唑甲醇溶液(终浓度是 200 ng· mL-1),在 80 ℃进
行皂化 60 min。皂化后 , 10000 r· min-1离心 10
min。取上清液转移至 EP管中 ,用甲醇冲悬剩余的
沉淀 ,加入冲悬后的溶液 0.4 mL,再加入甲醇 -盐
酸溶液(1∶1)0.2 mL, 10000 r· min-1离心 10 min。
取 1 mL上清液转移至另外的 EP管中 ,真空干燥 ,
检测前用 0.2mL甲醇溶解。所有实验重复 3次。
2.4　质谱分析　采用正离子方式检测 ,于一级全扫
描质谱图中获得 FLC准分子离子峰 [ M十 H] +m/z
307(图 1-A),选择该准分子离子峰进行碰撞诱导
电离 ,获得 FLC的主要碎片峰为 m/z238.3, 220.3
(图 1-A′)。内标酮康唑准分子离子峰 [ M十 H] +
m/z531(图 1-B),同法获得酮康唑的主要碎片峰
为 m/z489.3(图 1-B′)。选定碎片峰 m/z220.3,
489.3作为 MRM定量碎片离子 ,分别用于定量分析
FLC和酮康唑。
2.5　方法学研究
2.5.1　储备液的配制
FLC储备液:精密称取 FLC对照品 0.1080g,用
甲醇溶解 ,并定容至 100 mL量瓶中 ,待用时稀释成
1, 2, 5, 20, 50, 100 μg·L-1的系列对照品溶液 。
内标储备液:精密称取酮康唑对照品 0.054 g, ,
用甲醇溶解 ,并定容至 100 mL量瓶中 ,待用时稀释
成 2 μg· mL-1的内标溶液。
—565—药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)
图 1　氟康唑(A, A′)和内标酮康唑(B, B′)全扫描质谱图
Fig1　Fulscanmasspectogramsoffluconazole(A, A′)andketoconazole(B, B′)
A, B.一级全扫描质谱图(MSfulscan)　A′, B′.二级全扫描质谱图(MS2 fulscan)
2.5.2　方法专属性 　取空白的白念冻干菌 4 mg,
除不加内标溶液外 ,按 “ 2.3”项下方法操作 ,获得空
白样品的色谱图(图 2-A)。将浓度为 1 μg· L-1
FLC混合 200 μg·L-1内标酮康唑加入空白的冻干
菌中 ,依同法操作 ,获相应的色谱图(图 2 -B)。结
果表明 ,空白的冻干菌中的内源性物质不干扰 FLC
和内标酮康唑的测定。该法获得的色谱图具有较高
的专属性 。
图 2　HPLC-MS色谱图
Fig2　HPLC-MSchromatogramsofthesamples
A.空白样品(blanksample)　B.空白样品加 FLC及酮康唑 (blanksamplespikedwith1μg· L-1FLCand200μg· L-1ketoconazole)　C.白念耐
药株与 PLE以及 FLC联合培养的样品(thesampleofresistantC.albicanscelstreatedwith128μg· mL-1 PLEand0.25μg· mL-1 FLC)
1.氟康唑(fluconazole)　2.内标酮康唑(ketoconazole, internalstandard)
2.5.3　标准曲线和线性范围　取空白的白念冻干
菌 4 mg,加 FLC系列对照品溶液 0.6 mL,按 “ 2.3”
项下方法操作 ,进样 ,记录色谱图。以对照品浓度
(X)为横坐标 ,待测物与内标物的峰面积比值 (Y)
为纵坐标 ,用加权最小二乘法进行回归运算[ 3] ,求
得直线回归方程:
Y=0.11X+0.607　r=0.9956
线性范围为 1 ～ 100 μg· L-1 ,定量下限是 1 μg·
L-1。
2.5.4　准确度试验 　取空白的白念冻干菌 4 mg,
按 “2.5.3”项下方法制备 FLC低 、中 、高 3个浓度
(1, 50, 100μg·L-1),每一浓度进行 6样本分析 ,取
平均值 。同时另取空白的白念冻干菌 4 mg,除不加
系列对照品溶液和内标溶液外 ,按 “ 2.3”项下方法
制备 1 mL上清液 ,向上清液中加入内标溶液和相应
浓度的系列对照品溶液。真空干燥 ,检测前用 0.2
mL甲醇溶解 ,取 10μL进样分析 ,获得相应浓度的
峰面积。以每一浓度的 2种处理方法的峰面积比值
计算回收率 , 3种浓度的回收率分别是 95.9%,
94.1%, 98.3%。见表 1。
表 1　样品的回收率 (n=6, x±s)
Tab1　Recoveryofsamples
加入浓度
(added)/μg· L-1
测定浓度
(found)/μg· L-1
回收率
(recovery)/%
RSD
/%
1.0 0.96±0.06 95.9 ±6.08 6.3
50.0 47.1±3.10 94.1 ±6.20 6.6
100.0 98.3±3.35 98.3 ±3.35 3.4
2.5.5　精密度试验　取空白的白念冻干菌 4 mg,
按 “ 2.5.3”项下方法制备 FLC低 、中 、高 3个浓度
(1, 50, 100μg·L-1)的质量控制(QC)样品 ,每一浓
度进行 6样本分析 ,并与标准曲线同时进行 ,以标准
曲线计算 QC样品的浓度 ,将 QC样品的结果进行方
法分析 ,测定其日间精密度和日内精密度 ,结果见表
2。
—566— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)
表 2　样品的精密度 (n=6, x±s)
Tab2　Resultofprecisionofsamples
加入浓度
(added)
/μg· L-1
测得浓度(found)/μg· L-1 RSD/%
日间
(inter-day)
日内
(intra-day)
日间
(inter-day)
日内
(intra-day)
1.0 1.02±0.07 1.01±0.05 6.4 4.8
50.0 51.22±1.61 51.33±2.00 3.2 3.9
100.0 101.82±3.75 96.33±4.19 3.7 4.4
2.5.6　稳定性考察　本试验考察 FLC样品经历 3
次冷冻解冻循环的稳定性 、样品 -20 ℃冷冻保存 1
个月的稳定性和处理后的样品在室温放置 24 h的稳
定性 。取空白的白念冻干菌 4 mg按 “2.5.3”项下的
方法制备低 、高 2个浓度(1, 100 μg· L-1)的样品 ,每
一种稳定性考察进行 3样本分析。结果表明 FLC样
品经过 3次冷冻解冻循环后稳定(RSD为 4.1%), -
20℃冷冻保存 1个月后稳定(RSD为 5.9%),处理后
的样品室温放置 24h后稳定(RSD为 2.9%)。
2.6　PLE对白色念珠菌中 FLC浓度的影响　白色
念珠菌耐药株与 FLC0.25 μg· mL-1单独培养 ,或与
0.5, 2, 8MIC浓度 PLE加 FLC0.25μg·mL-1联合培
养。检测白色念珠菌细胞内 FLC的浓度 ,观察 PLE
对菌株中 FLC浓度的影响 。并计算真菌细胞内 FLC
浓度的增长率(IR),增长率(IR, %)=(用药组细胞
内 FLC的浓度 -空白对照组细胞内 FLC的浓度)/空
白对照组细胞内 FLC的浓度 。实验结果见图 2, 2
MIC和 8MICP<0.01。表 3结果显示 PLE能增加白
色念珠菌耐药株中 FLC的浓度 ,且随着 PLE浓度的
增加 ,真菌细胞内 FLC的浓度也上升。
图 3　不同剂量的 PLE对白色念珠菌中 FLC浓度的影响
Fig3　TheimpactofPLEontheconcentrationofFLCinresistantC.albi-
cans
表 3　PLE对 FLC浓度的增长率(n=3, x±s)
Fig3　TheincreasingrateoftheFLC
concentrationondifferentdosesofPLE
C/μg· mL-1 增长率(rateofincrease)/%
8 9.5±3.5
32 63.6±14.0
128 96.2±8.8
3　讨论
耐药真菌细胞内 FLC的浓度很低 ,定量限需达
到 μg·L-1级 ,一般的检测方法很难较准确的测定
其浓度。为了观察 PLE对白念耐药株中 FLC浓度
的影响 ,首先要建立准确性 、专属性 、灵敏度高的定
性定量方法测定真菌细胞内的 FLC浓度。另外 ,由
于本实验中测定的样品为生物样品 ,具有取样量少 、
内源性物质干扰多等 [ 4]多种因素的影响 ,所以必须
根据待测物的结构 、生物介质和预期的浓度范围 ,建
立灵敏度高 、专属性强的生物样品定量分析方法 。
本实验中 ,菌悬液与 FLC单独培养及与 FLC和
PLE联合培养后 ,离心得到真菌细胞 ,经皂化 、提取
等过程得到真菌细胞内聚集的 FLC。FLC的分析及
定量采用高效液相与质谱联用的方法 ,经方法学研
究证实所建立的检测方法灵敏 、可靠。 FLC的定量
是通过测定 m/z307的分子离子及 m/z220的碎片
离子信号 ,内标酮康唑的定量是测定 m/z531的分
子离子及 m/z489的碎片离子信号来进行的 。 FLC
的最低检测限是 1.0 μg· L-1 ,标准曲线的线性范
围是 1.0 ～ 100μg· L-1 ,其相关系数为 0.9956。精
密度和回收率的 RSD均小于 10%,符号生物样品的
检测要求 。实验结果显示 , PLE与 FLC合用时 , PLE
能明显升高白色念珠菌耐药株细胞内 FLC的浓度 ,
且具有一定的剂量依赖关系 。此结果提示 PLE通
过提高白念耐药菌株内 FLC的浓度 ,从而显著降低
FLC对白念耐药株的 MIC值 ,这可能是两者合用对
耐药株呈现协同作用的重要原因之一。
对临床分离的 FLC耐药菌株的研究发现 ,细胞
内 FLC浓度的降低是其产生耐药性的重要机制之
一。近年来 ,更多的研究表明耐药株细胞内 FLC浓
度的降低主要是由于细胞膜上主动外排泵的活化 ,
使真菌细胞对药物的排出增加所导致 [ 6] 。与多重
耐药的肿瘤细胞上存在 P-糖蛋白的活化相似 ,所
有呈现多重耐药性的菌株中都存在主动外排系统的
活化 。因此本实验结果提示 PLE可能会影响白念
耐药株的主动外排系统的活化或表达 ,为进一步揭
示 PLE逆转 FLC耐药的作用机制奠定了基础。
参考文献
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(本文于 2008年 7月 8日修改回)
中检所 《中国药典 》2010年版工作会议
　　4月 3日 ,中国药品生物制品检定所召开会议要求各部门认真做好 《中国药典 》(2010年版)科研和
编制相关工作 。国家药典委员会副秘书长周福成 、党委书记 、所长李云龙 、常务副所长金少鸿 、副所长王
军志 、党委副书记丁丽霞出席会议 。标准化研究中心常务副主任杨化新主持会议。
做好 《中国药典 》(2010年版)的科研和编制工作对于完善和提高我国药品质量标准具有重要意
义 ,中检所承担了其中较大一部分工作 。高度重视 、按照进度 、保质保量地完成这项任务是中检所 2009
年的重要工作之一 。会上 ,丁丽霞传达了国家局 “《中国药典 》(2010年版)科研任务检查会议”精神 ,细
胞室 、化学药品室 、药用辅料及包材室 、中药室 、放射药品室负责同志介绍了本部门完成这项工作的基本
情况及存在的主要问题 ,杨化新介绍了中检所标准化研究管理体系的有关情况 。
国家药典委员会副秘书长周福成在讲话中指出 ,中检所对 2010年版药典的科研和编制工作十分重
视 ,为推动我国药典工作作出了很大贡献。他说 ,国家药典委员会与中检所通力合作 ,共同做好药典编
制工作是确保人民群众饮食用药安全的需要 ,是促进我国医药产业健康发展的需要。对于如何进一步
做好 2010年版中国药典相关工作 ,周福成强调 ,要树立 “科研为标准服务 ,标准为监管服务 ,监管为安全
服务 ”的理念 ,对药品标准坚定不移地实行就高不就低的原则 。希望中检所能一如既往地支持国家
药典委员会的工作 ,编制高水平的药典 ,为推动药品监管工作又好又快发展做出更大贡献。
中检所所长李云龙在讲话中指出 ,今年中检所工作的一个重点就是要抓好业务建设和业务管理 ,
2010年版药典的科研和编制工作是抓好这两项工作的良好平台。能否高水平地完成这项工作是对中
检所能力和形象的考验。各有关部门要尽职尽责 ,树立高度的责任感 ,带头树立中国药检新形象 。为
此 ,李云龙所长提出了五点要求:
一是领导要高度重视。做好药典科研和编制工作 ,关键在领导。分管所领导 、各业务处领导要高度
重视 ,加强协调 ,主动发现问题 ,及时解决问题。二是各业务处要充分发挥对本体系工作的综合 、协调和
管理职能 ,帮助和督促各业务科室保质保量地完成药典任务。三是相关科室要抓紧落实 。这次的药典
工作时间紧 、任务重 ,相关科室要认真对待 ,克服困难 ,在保证质量的前提下加快进度 ,尽快完成 。四是
标准化研究中心要充分发挥全所药典工作的综合 、协调 、管理和督办职能 ,要积极协调 ,及时帮助各部门
解决工作中的具体问题 ,把这项任务作为今年的重点工作来抓。五是以本次会议为契机 ,各部门要认真
对待后续工作 ,在本次药典工作中展示中检所应有的能力和水平 ,为全国药检系统做出表率。
所长办公室 、党委办公室负责人以及各有关业务处 、业务科室的负责同志参加了会议。
详情请浏览中检所网站:htp://www.nicpbp.org.cn
—568— 药物分析杂志 ChinJPharmAnal2009, 29(4)