全 文 ：第 51 卷 第 11 期
Vol． 51 No． 11
山 东 大 学 学 报 (医 学 版)
JOUＲNAL OF SHANDONG UNIVEＲSITY(HEALTH SCIENCES)
2013 年 11 月
Nov． 2013
收稿日期:2013-06-28
基金项目:国家自然科学基金(30730109) ;国家杰出青年科学基金(30925038)。
通讯作者:娄红祥，E-mail:louhongxiang@ sdu． edu． cn
文章编号:1671 － 7554(2013)11 － 0056 － 05 DOI:10． 6040 / j． issn． 1671-7554． 2013． 11． 012
片叶苔素 D 大鼠体内代谢产物的结构鉴定
凌霄1，2，郭东晓2，娄红祥1
(1．山东大学药学院天然药物化学研究所，济南 250012;2．山东省食品药品检验所，济南 250101)
摘要:目的 研究片叶苔素 D 在大鼠体内的代谢，并对片叶苔素 D 在大鼠体内代谢产物进行分离与结构鉴定。
方法 大鼠按 40 mg /kg 剂量口服片叶苔素 D 后收集胆汁，采用高效液相色谱仪分离、纯化代谢产物，利用 HPLC-
MS /MS 分析代谢产物，利用 NMＲ鉴定结构。结果 大鼠口服片叶苔素 D 后，在胆汁中检测到 2 个Ⅱ相代谢产
物，均为片叶苔素 D 与葡萄糖醛酸的结合产物( 片叶苔素 D-1’-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸) ，且两个代谢产物互为旋
阻异构体，室温下可互相转化。结论 片叶苔素 D 在大鼠体内产生与葡萄糖醛酸结合的Ⅱ相代谢产物，且 2 个代
谢产物互为旋阻异构体。
关键词:片叶苔素 D;代谢产物; 大鼠
中图分类号:Ｒ574 文献标志码:A
Structural determination of riccardin Ds metabolites in rats
LING Xiao1，2，GUO Dong-xiao2，LOU Hong-xiang1
(1． Department of Natural Product Chemistry，School of Pharmaceutical Sciences，
Shandong University，Jinan 250012，China;
2． Institute for Food and Drug Control of Shandong Province，Jinan 250101，China)
Abstract:Objective To investigate the metabolism pathway and identify the metabolites of riccardin D in vivo after
oral administration in rats． Methods Using HPLC，the metabolites were purified from rats bile samples after oral
administration of riccardin D 40 mg /kg in rats． The structures of the metabolites were identified by HPLC-MS /MS and
confirmed by NMＲ． Ｒesults The riccardin Ds metabolites were the conjugates with glucuronate and were identified as
a mixture of two atropisomers． Conclusion The riccardin Ds main metabolism pathway in vivo is phase Ⅱ metabo-
lism and the metabolites are the conjugate with glucuronate．
Key words:Ｒiccardin D;Metabolite;Ｒats
片叶苔素 D 是从中国苔类植物毛地钱 Dumort-
iera hirsute(命名人:林奈)中分离得到的双联苄类
化合物［1］。生物活性研究显示，片叶苔素 D 在体内
外均有良好的抗真菌、抗肿瘤活性。体内外研究结
果显示，片叶苔素 D 可能是一种新型的拓扑异构酶
Ⅱ抑制剂，且毒性小于已上市的拓扑异构酶Ⅱ抑制
剂 etoposide［2-3］，具有良好的开发前景。
本课题组对片叶苔素 D 开展了系统研究［4-15］，
药动学方面，通过用葡萄糖醛酸酶处理静注片叶苔
素 D 后的大鼠血浆样品，并比较葡萄糖醛酸酶处理
前后血浆的质谱图，观察到酶水解后的血浆样品中
两个未知峰的消失，故推测片叶苔素 D 在体内主要
代谢产物为Ⅱ相代谢产物，即片叶苔素 D 与葡萄糖
醛酸的结合产物。排泄研究发现，胆汁排泄以片叶
苔素 D 与葡萄糖醛酸的结合产物为主，而原型药较
少，因此本研究首先对胆汁进行富集、液-液萃取，再
通过 HPLC 进行分离、纯化，从大鼠胆汁中获得两个
葡萄糖醛酸结合产物，并通过波谱手段，结合片叶苔
凌霄，等．片叶苔素 D 大鼠体内代谢产物的结构鉴定 57
素 D 的核磁共振谱及结构特性，对其结构进行了鉴
定及推断。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 药品 片叶苔素 D 由本实验室合成，纯度
99． 5%。
1． 1． 2 主要试剂 乙腈(色谱纯)购自美国 Fisher
Chemieals公司;乙酸、乙酸乙酯(均为色谱纯) ，购
自天津北方医药试剂有限公司;磷酸二氢钠(分析
纯) ，购自天津康科德试剂有限公司。
1． 1． 3 仪器 Agilent1260 液相色谱仪，Agi-
lent1200-6320 液质联用仪(美国 Agilent 公司) ;梅
特勒 －托利多(Mittler)CP2550 电子天平［梅特勒 －
托利多仪器(上海)有限公司］;Heraeus 离心机(德
国贺立氏公司) ;IKA 旋涡混合器(德国 IKA VIB-
ＲAX VXＲ公司) ;Caliper 氮吹仪(美国 Caliper生命
科学公司) ;PK514BP 超声清洗器(德国 BANDEL
公司) ;Milli-Q 超纯水机(美国 Millipore公司)。
1． 1． 4 实验动物 健康成年 Wistar 大鼠，清洁级，
雌雄兼用，体质量 185 ～ 250 g，购于山东大学实验动
物中心，许可证号 SYXK2003-0004。
1． 2 方法
1． 2． 1 片叶苔素 D 溶液配制 称取片叶苔素 D
100 mg，置 25 mL 离心管中，加入 DMSO 2． 0 mL，超
声使溶解，再加入 30%乙醇溶液 18． 0 mL，涡旋，混
匀灌胃，给药剂量为 40 mg /kg。
1． 2． 2 胆汁收集 大鼠给药前禁食 12 h，自由饮
水。实施胆管插管手术后恢复 2 h，同时收集空白胆
汁;以 40 mg /kg 剂量的片叶苔素 D 经灌胃给药，收
集给药后 0 ～ 24 h的胆汁样品，－ 20 ℃冷冻保存，待
分离用。
1． 2． 3 胆汁样品处理 采用液 －液萃取法处理胆
汁样品。取冷冻保存的样品，放至室温，涡旋混匀，
每次取胆汁样品 1． 0 mL，加 pH 5． 0 的 0． 05 mol /L
磷酸二氢钠缓冲液 1． 0 mL、pH 1． 5 的 0． 05 mol /L
磷酸二氢钠缓冲液 1． 5 mL 酸化。加乙酸乙酯
30 mL，涡旋 1 min，3 000 r /min 离心 15 min，离心半
径13． 5 cm，取上清，0． 22 μm 滤膜过滤，取滤液，
30 ℃氮气吹干，加流动相复溶。
1． 2． 4 代谢物制备 色谱条件:C18色谱柱(Intersil
ODS-3，250 mm × 4． 6 mm，5． 0 μm) ;流动相:乙腈-
0． 01%乙酸溶液(40∶60) ;检测波长:280 nm;在线脱
气，流速 1． 0 mL /min;柱温 35 ℃;进样量 50． 0 μL，
分别收集保留时间约为 7． 5 min 与 8． 5 min 的流出
液并合并，减压蒸干，得代谢产物 1(约 3 mg)、2(约
2． 5 mg)。
1． 2． 5 质谱条件 电喷雾离子源(ESI) ，负离子检
测方式;m/z 范围 50 ～ 1 000;离子源喷射电压5 KV，
雾化电压 40 Pa，干燥气(N2)流速 12 L /min，干燥气
温度 350 ℃，毛细管电压 15 V。检测方式:全扫描一
级及二级质谱。
2 结 果
经 HPLC 分析和纯化制备，从胆汁中得到 2 个
代谢产物 1 和 2，液相色谱及质谱图分别见图 1 及
图 2。经 LC-MS 联用分析，这两个成分一级质谱
( ［M-H］－)相近(m/z:599． 0 ± 0． 1) ，二级质谱也相
近(m/z:423． 0 ± 0． 1)。一级质谱母离子与二级全
扫描质谱分析中碎片离子结果相差 176，为代谢产
物脱去一分子葡萄糖醛酸基的结果，说明片叶苔素
D 在大鼠体内以Ⅱ相代谢产物为主，即 1 和 2 均为
片叶苔素 D 与葡萄糖醛酸结合物，以异构体形式
存在。
利用液相分离纯化代谢产物，得到的单体化合
物 1 及 2(在流动相溶液中)室温放置 0． 5 h 后能相
互转化，二者转化的最终比例约为 1∶1(图 3)。
图 1 代谢产物高效液相色谱图
A:胆汁中代谢产物色谱图;B:空白胆汁色谱图。
Fig． 1 HPLC Chromatography of metabolites
A:HPLC chromatography of metabolites isolated from bile;B:Chromatography of blank bile sample．
58 山 东 大 学 学 报 (医 学 版) 51 卷 11 期
图 2 代谢产物质谱图
A:代谢产物 1 母离子质谱图;B:代谢产物 1 子离子质谱图;C:代谢产物 2 母离子质谱图;D:代谢产物 2 子
离子质谱图。
Fig． 2 MS chromatography of metabolites isolated from bile
A:Parent ion of metabolite 1;B:Product ion of metabolite 1;C:Parent ion of metabolite 2;D:Product ion of
metabolite 2．
图 3 胆汁中代谢产物色谱图
A:制备前代谢产物色谱图;B:纯化后 1 号峰室温放置 1 h 后色谱图;C:纯化后 1 号峰室温放置过夜后色谱
图;D:纯化后 2 号峰室温放置 0． 5 h后色谱图;E:纯化后 2 号峰室温放置 4 h后色谱图。
Fig． 3 HPLC chromatography of metabolites in bile
A:Metabolite solution isolated from bile before seperation by HPLC;B:Peak 1 solution stored for 1 h after being
seperated by HPLC;C:Peak 1 solution stored over night after being seperated by HPLC;D:Peak 2 solution stored
for 30 min after being seperated by HPLC;E:Peak 2 solution stored for 4 h after being seperated by HPLC．
凌霄，等．片叶苔素 D 大鼠体内代谢产物的结构鉴定 59
代谢产物 1 和 2(比例约为 1 ∶ 1)的1H-NMＲ
(600 MHz，DMSO-d6) :7． 11 (1H，m，H-11) ，
7． 03 (1H，m，H-2) ，6． 96，6． 79 (2H，m，H-2，
6) ，6． 84 (1H，m，H-10) ，6． 76 (3H，m，H-3，3，
5) ，6． 69 (2H，m，H-11，12) ，6． 30 /6． 24 (1H，s，
H-14) ，6． 16 /6． 09 (1H，m，H-10) ，5． 35 (1H，
m，H-5) ，5． 11 (1H，d，J = 7． 2 Hz，H-1″) ，3． 38
(1H，m，H-4″) ，3． 31 (3H，m，H-2″，3″，5″) ，
2． 81，2． 44 (8H，m，H-7，7，8，8) ;13C NMＲ
(150 MHz，DMSO-d6) :172． 0 (C-6″) ，155． 4 /155． 3
(C-13) ，154． 8 /154． 7 (C-13) ，152． 9 (C-1) ，
149． 2 /149． 1 (C-6) ，144． 2 /144． 1 (C-1) ，144． 1
(C-9) ，140． 7 (C-9) ，140． 6 (C-4) ，135． 8 /135． 7
(C-4) ，133． 4 /133． 2 (C-11) ，130． 3 (C-6) ，130． 0
(C-2) ，128． 2 (C-11) ，126． 1 (C-14) ，122． 4 (C-3，
5) ，122． 0 (C-3) ，121． 4 /121． 4 (C-12) ，120． 8 /
120． 7 (C-10) ，119． 6 /119． 3 (C-10) ，117． 1 (C-5) ，
116． 2 (C-2) ，116． 0 (C-14) ，112． 8 (C-12) ，
100． 0 (C-1″) ，76． 5 (C-5″) ，75． 8 (C-3″) ，73． 4
(C-2″) ，71． 9 (C-4″) ，37． 5 (C-7) ，37． 4 (C-8) ，
36． 7 (C-7) ，35． 0 /34． 8 (C-8)。
对以上核磁数据进行分析，与片叶苔素 D 的
NMＲ谱图［16］比对，确定该化合物为片叶苔素 D 的
葡萄糖醛酸化产物。在化合物 1 和 2 的 HMBC 相
关图谱中，糖的端基氢 δH 5． 11 (1H，d，J = 7． 2 Hz，
H-1″)与 C-1 (δC 144． 2 /144． 1)远程相关，故确定
化合物 1 和 2 均为片叶苔素 D-1’-O-β-D-吡喃葡萄
糖醛酸，不是因葡萄糖醛酸结合位点不同产生的异
构体。
根据上述结果，推测代谢产物的结构为:
图 4 片叶苔素 D 代谢产物 1 和 2 的结构及其关键 HMBC
相关(H→C)
Fig． 4 The chemical structures of 1 and 2 and their key HM-
BC correlations (H→C)
根据文献［16］，大环双联苄环具有高度扭曲的
结构，虽然没有手性碳，但具有轴手性或面手性。利
用 HPLC-CD 技术结合量子化学理论计算，证实片
叶苔素 D 由于 C-C 键的扭转而具有光学活性，并含
有两个旋阻异构体 M-riccardin D 及 P-riccardin
D［17-18］，但由于未实现两个异构体的基线分离，因此
未确定它们间的比率。根据以上分析，推断单体化
合物 1、2 互为旋阻异构体，且由于糖苷的引入，导致
了轴手性和环刚性的降低，因此两个异构体在室温
下互相转换。
3 讨 论
已有的研究发现，片叶苔素 D 在体内外均呈现
良好生物活性。抗真菌方面，片叶苔素 D 通过下调
菌丝特异基因，从而抑制菌丝生长，影响生物膜形
成，对白色念珠菌产生较好的抗真菌活性，更引人注
意的是片叶苔素 D 对氟康唑耐药菌株表现抗真菌
活性，提示片叶苔素 D 是一个潜在的抗真菌剂［4-6］;
抗肿瘤方面，片叶苔素 D 与已进入临床阶段的抗肿
瘤药 Combrastatin A4 结构相似，均属于联苄类化合
物，提示它可能的抗肿瘤活性。体外研究发现，片叶
苔素 D 通过抑制微管蛋白形成、抑制肿瘤血管生长
等方式对 KB、MCF-7、PC3 等多个肿瘤细胞系产生
抑制作用［7-8］;在体内，片叶苔素 D 对人白血病细胞
HL-60 产生明显抑制作用，但对相应的拓扑异构酶
Ⅱ缺乏的 HL-60 /MX2 细胞无明显抑制作用，说明
片叶苔素 D 可选择性抑制拓扑异构酶Ⅱ活性，与已
上市的抗肿瘤药、拓扑异构酶Ⅱ抑制剂 etoposide 相
比，对拓扑异构酶Ⅱ有更强的抑制作用;通过将人肺
癌细胞 H460 注入小鼠体内的方式，建立肺癌小鼠
模型，连续 3 周以 20 mg /kg 的剂量尾静脉注射片叶
苔素 D，对照组静注相同剂量 etoposide，结果显示，
片叶苔素 D 抑瘤作用与 etoposide相当，且毒性远低
于 etoposide，无明显毒性［2-3］。本课题组对片叶苔素
D 的研究包括片叶苔素 D 及衍生物的合成［9-12］、体
内外活性［2-6］、药动学［13］、纳米制剂［14-15］等方面。
本研究对大鼠胆汁中片叶苔素 D 的代谢产物
进行了分离、纯化及结构研究。通过分析胆汁中未
知峰的一级、二级质谱图，推测片叶苔素 D 的代谢
产物为片叶苔素 D 与葡萄糖醛酸的结合产物，再通
过分析代谢产物的 NMＲ 谱，并与片叶苔素 D 的
NMＲ谱进行比较，同时结合片叶苔素 D 本身具有
旋阻异构的特点，首次证明片叶苔素 D 与葡萄糖醛
酸的结合产物以旋阻异构体的形式存在，且两个异
60 山 东 大 学 学 报 (医 学 版) 51 卷 11 期
构体在室温下流动相溶液中可发生相互转化，直至
两异构体达到动态平衡。
参考文献:
［1］ Lu Z Q，Fan P H，Ji M，et al． Terpenoids and bis-
bibenzyls from Chinese liverworts Conocephalum conicum
and Dumortiera hirsute［J］． J Asian Nat Prod Ｒes，2006，
8(1-2) :187-192．
［2］Xue X，Sun D F，Sun C C，et al． Inhibitory effect of ric-
cardin D on growth of human non-small cell lung cancer
In vitro and in vivo studies［J］． Lung Cancer，2012，76
(3) :300-308．
［3］Liu H P，Gao Z H，Cui S X，et al． Inhibition of intesti-
nal adenoma formation in APC(Min / +)mice by Ｒiccar-
din D，a natural product derived from liverwort plant Du-
mortiera hirsute［J］． PLoS One，2012，7(3) :e33243．
［4］Bringmann G，Muehlbacher J，Ｒeichert M ． Stereochemis-
try of isoplagiochin C，a macrocyclic bisbibenzyl from
liverworts［J］． J Am Chem Soc，2004，126(30) :9283-
9290．
［5］Wang L N，Xie C F，Lou H X． Determination of atropi-
someric configurations of macrocyclic bisbenzyls by
HPLC-CD /UV and quantum chemical calculations［J］． J
Asian Nat Prod Ｒes，2011，13(4) :312-318．
［6］刘娜，娄红祥． 双联苄类化合物结构多样性的研究进展
［J］． 沈阳药科大学学报，2011，28(8) :668-672．
［7］Wu X Z，Cheng A X，Sun L M，et al． Plagiochin E，an
antifungal bis(bibenzyl) ，exerts its antifungal activity
through mitochondrial dysfunction-induced reactive oxy-
gen species accumulation in Candida albicans［J］． Bio-
chim Biophys Acta，2009，1790(8) :770-777．
［8］Cheng A，Sun L，Wu X，et al． The inhibitory effect of a
macrocyclic bisbibenzyl riccardin D on the biofilms of
Candida albicans［J］． Biol Pharm Bull，2009，32(8) :
1417-1421．
［9］Li Y，Ma Y，Zhang L，et al． In vivo inhibitory effect on
the biofilm formation of Candida albicans by liverwort
derived riccardin D［J］． PLoS One，2012，7 (4) :
e35543．
［10］Xue X，Qu X J，Gao Z H，et al． Ｒiccardin D，a novel
macrocyclic bisbibenzyl， induces apoptosis of human
leukemia cells by targeting DNA topoisomerase II［J］．
Invest New Drugs，2012，30(1) :212-222．
［11］Sun C C，Zhang Y S，Xue X，et al． Inhibition of angio-
genesis involves in anticancer activity of riccardin D，a
macrocyclic bisbibenzyl，in human lung carcinoma［J］．
Eur J Pharmacol，2011，667(1-3) :136-143．
［12］Wang Y，Wang L，Hu Z，et al． A novel derivative of
riccardin D induces cell death through lysosomal rupture
in vitro and inhibits tumor growth in vivo［J］． Cancer
Lett，2013，329(2) :207-216．
［13］Yue B，Zhao C Ｒ，Xu H M，et al． Ｒiccardin D-26，a
synthesized macrocyclic bisbibenzyl compound，inhibits
human oral squamous carcinoma cells KB and KB /VCＲ:
In vitro and in vivo studies［J］． Biochim Biophys Acta，
2013，1830(1) :2194-2203．
［14］Yue B，Zhang Y S，Xu H M，et al． Ｒiccardin D-26，a
synthesized macrocyclic bisbibenzyl compound，inhibits
human hepatocellular carcinoma growth through induc-
tion of apoptosis in p53-dependent way［J］． Cancer
Lett，2013，328(1) :104-113．
［15］Jiang J，Sun B，Wang Y Y，et al． Synthesis of macro-
cyclic bisbibenzyl derivatives and their anticancer effects
as anti-tubulin agents［J］． Bioorg Med Chem，2012，20
(7) :2382-2391．
［16］Ling X，Xing J，Zhang J Z，et al． The absorption，dis-
tribution，metabolism and excretion of riccardin D in rats
［J］． Drug Ｒes，2013，63(3) :159-164．
［17］Liu G，Zhang D，Jiao Y，et al． In vitro and in vivo e-
valuation of riccardin D nanosuspensions with different
particle size［J］． Colloids Surf B Biointerfaces，2013，
102:620-626．
［18］Liu G，Zhang D，Jiao Y，et al． Comparison of different
methods for preparation of a stable riccardin D formula-
tion via nano-technology［J］． Int J Pharm，2012，422
(1-2) :516-522．
( 编辑:相峰)