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技术与方法
TECHNIQUE AND METHODS
东亚砂藓(Rhacomitrum canescens)RNA提取方法的比较和改进
吕凤香 ,沙伟＊ ,闫苗苗 ,李兵兵(齐齐哈尔大学生命科学与工程学院 , 黑龙江 齐齐哈尔 161006)
摘要:方法:以东亚砂藓为材料 ,用 CTAB 法 、热硼酸盐法和改良的SDS 酸酚法提取东亚砂藓总 RNA , 并采用 3种方法进行沉
淀 ,从提取 RNA的纯度 、完整性 、产量 、耗时和 RT-PCR效果等分析确定适用于东亚砂藓总 RNA 提取的方法。结果:研究表明:
CTAB 法提取的 RNA 28S rRNA 明显缺失 ,泳道模糊不清 , 杂质多 ,热硼酸法和改良的 SDS 酸酚法提取 RNA 28S rRNA , 18S rRNA 条
带清晰 , OD260 OD280都在 1.7 以上 ,纯度高 , 但热硼酸法提取出的 RNA 有 DNA污染 , RNA 的含量(15.68～ 35.2μg.g-1)低于 SDS 酸
酚法提取 RNA 的含量(46.5 ～ 51.9μg.g-1)3 种沉淀方法比较认为无水乙醇配合 LiCl沉淀 RNA节省时间 , 反转录和 RT-PCR效果
好。结论:改良的 SDS 酸酚法适合东亚砂藓 RNA的提取。
关键词:东亚砂藓 RNA;提取方法;RT-PCR
中图分类号:Q522　　文献标识码:A　　文章编号:1004-311X(2007)01-0037-03
Comparison and Improvement of Extraction Method of
RNA from Rhacomitrum canescens
LV Feng-xiang ,SHA Wei＊ ,YAN Miao-miao ,LI Bing-bing
(Department of Biology , College of Life Science and Engineering , Qiqihaer Universi ty , Qiqihaer 161006 , China)
Abstract:Method:In this paper , the CTAB method , the hot borate method and the improved SDS sour phenol method were employed to extract the
total RNA from Rhacomitrunm canescen .The best method for isolating RNA from Rhacomitrunm canescens is decided by comparing the purity , the
integrity the output of RNA , and the result of PCR.Results:The results demoustrate that the RNA isolated by CTAB show obscure bands with more
impurity and the 28S rRNA obviously absence.The RNA isolated by the hot borate method and the improved SDS sour phenol method produced two
clear bands of 28S rRNA and 18S rRNA , and the ratios of OD260 OD280 were above 1.7 , but the RNA extracted by the hot borate method was cont-
aminated by DNA , and its concentration is 15.68-35.2μg.g-1 which is lower than that of RNA (46.5-51.9μg.g-1)extrated by improved
SDS sour phenol method.The comparision of the three methods showed that cooperation of LiCl and ethanol to deposit RNA can save time , and of-
fer good material for RT-PCR.Conclusion:The improved SDS sour phenol method is suitable for extracting RNA from Rhacomitrunm canescen.
Key words:Rhacomitrunm canescens;RNA extraction methods;RT-PCR
收稿日期:2006-10-10;修回日期:2006-11-11
基金项目:黑龙江省教育厅海外学人合作项目资助(1151hz022);黑龙
江省硕士研究生创新基金项目资助
作者简介:吕凤香(1981-),女 ,在读硕士 ,专业方向:植物遗传;＊沙
伟(1963-),女 ,博士 , 从事植物学研究 , E-mai l:shw1129@263.net ,
Tel:0452- 2742571。
　　全世界有苔藓 23 000 种 , 中国是世界上苔藓植物多样性
最丰富的国家之一 ,有 2 200 种 ,占全世界9.1%。在漫长的生
物进化历程中 ,苔藓植物形成了一套独特的适应机制 ,能生活
在裸岩上和“冻原”地带 , 被称为先锋物种[ 1] 。藓类植物由于
具有独特的抗逆能力 ,成为研究抗逆机理和相关基因克隆的
模式植物[ 2] 。从苔藓植物中提取 RNA是进行分子生物学方面
研究的前提。进行Northern 杂交分析 、纯化 mRNA以及用于体
外翻译成 cDNA文库 、RT-PCR及差异显示分析等分子生物学
研究都需要高质量的 RNA。苔藓植物的 RNA提取难点在于苔
藓植物次生代谢产物较多 , 如:生物碱 、黄酮 、萜类 、固醇类以
及酚类化合物等[ 1] , 这些物质会造成 RNA的化学降解 、酶解或
者影响 RNA 纯度。关于植物 RNA 提取的报道很多[ 3-9] , 但多
是针对多糖 、多酚或色素含量高的植物。裴东等[ 10] 采用常用
的Trizol法 、改良的植物 RNA 提取法和热硼酸盐法比较认为热
硼酸盐法效果好 , 徐昌杰[ 11]等从操作耗时 、所得 RNA 产量和
质量等方面比较了 5 种 RNA提取方法提取不同组织的 RNA ,
认为改良的 Bugos 法效果较好;史宝胜[12] 、张容[13]等学者也把
某种植物 RNA 提取方法进行比较。苔藓植物 RNA 提取的文
章很少[ 2] 。东亚砂藓能在环境恶劣的条件下生存 , 本身有较
强的抗性 , 对它进行分子生物学的研究 , 寻找抗逆基因 , 对农
作物和经济作物有很大的意义。本文总结前人的经验 , 对提
取方法进行改进 ,能够从东亚砂藓中获得高质量 RNA ,为苔藓
植物 RNA提取方法提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料
东亚砂藓采自五大连池 , 置于室温培养 , 使其自然生长 ,
洗干净立即于-80℃冷藏备用。
1.2　方法
1.2.1　RNA 酶活性灭除:用于 RNA 提取的器皿以 1.1Mpa
(121℃)高压灭菌 40min , 塑料器皿用 DEPC水处理后灭除 RNA
酶。
1.2.2　不同方法提取总 RNA
1.2.2.1　CTAB法:将 0.5g东亚砂藓加入 10%聚乙烯吡咯烷
酮(PVP), 用液氮研磨成细粉末 , 分装于 3 个 1.5ml的离心管 ,
加入 600μl 65℃预热 CTAB 提取缓冲液(2%CTAB , 0.1mol L
Tris , pH=9.5 , 20mmol L EDTA , 1.4mol L NaCl), 40μl β -巯基乙
醇 , 漩涡震荡 2min。 65℃水浴 15min , 其间震荡 2 ～ 3 次。加入
200μl Tris-饱和酚 , 4℃、12 000r min 离心 15min ,取上清加入等
体积的氯仿:异戊醇(V V=24∶1), 4℃、12 000r min 离心 15min ,
抽提至没有明显蛋白层(3 ～ 4 次), 上清液分别采用 3 种方法
沉淀 RNA:
①1 4 体积的 LiCl , -20℃,沉淀过夜。
②1 4 体积的 LiCl和 1 2 倍体积的无水乙醇 , -70℃, 1h。
③2.5 倍体积的无水乙醇-70℃, 0.5h。
沉淀后 4℃, 12 000r min 离心 15min , 弃上清 , 用 75%的乙
醇洗沉淀两次 , 每次 12 000r min 离心 5min。放于室温 30min ,
第 17卷第 1 期:37
2007 年 2 月 　　　　　　　　　　　　　　　　
生　物　技　术
BIOTECHNOLOGY
　　　　　　　　　　　　　　　　　Vol.17 , No.1:37
Feb.2007
DOI :10.16519/j.cnki.1004-311x.2007.01.012
加入 30μl DEPC 水溶解 RNA ,用 1.2%的琼脂糖电泳检测完整
性和Genespec检验 RNA 的纯度和含量。
1.2.2.2　热硼酸盐法:将 0.5g 东亚砂藓加入 10%聚乙烯吡咯
烷酮(PVP),用液氮研磨成细粉末 , 分装于 3 个 1.5ml的离心
管 ,加入 600μl Tris-硼酸缓冲液(0.2mol L Tris 硼酸 , 10mmol L
EDTA , pH 7.6),加入 200μl Tris 酚和 40μl β -巯基乙醇 , 65℃浸
提 15min。加入 20μl 20mg ml的蛋白酶 K , 37℃水浴 1.5h , 取出
加入100μl KAC , 150μl无水乙醇 , 8 000r min 离心 20min。 小心
取出上清加入等体积的氯仿:异戊醇(V V=24:1), 4℃、12
000r min离心 15min , 抽提至没有明显蛋白层 , 上清液分别采用
3 种方法沉淀 RNA:
①1 4 体积的 LiCl , -20℃, 沉淀过夜。
②1 4 体积的 LiCl和 1 2倍体积的无水乙醇 , -70℃, 1h。
③2.5 倍体积的无水乙醇-70℃, 0.5h。
沉淀后在 4℃、12 000r min 离心 15min , 弃上清 , 用 75%的
乙醇洗沉淀 2 次 , 每次12 000 rmin离心 5min。于室温放置
30min ,加入 30μl DEPC 水溶解 RNA , 用 1.2%的琼脂糖电泳检
测完整性和Genespec检验 RNA 的纯度和含量。
1.2.2.3　改良的 SDS 酸酚法:将 0.5g 东亚砂藓加入 10%聚乙
烯吡咯烷酮(PVP), 用液氮研磨成细粉末 ,分装于 3 个 1.5ml的
离心管里 ,加入 600μl SDS 提取缓冲液(65℃预热), 加入 200μl
Tris 酚和 40μl β-巯基乙醇 , 漩涡震荡 2min , 在 65℃水浴锅中
浸提15min , 其间剧烈震荡3 ～ 4次 , 每次30s。从水浴锅取出迅
速置于冰浴中冷却 , 加入 100μl KAC , 150μl无水乙醇 , 200μl氯
仿 ,混匀并震荡 , 4℃、12 000g 离心 15min ,取上清加入等体积的
氯仿:异戊醇(V V=24∶1)于 4℃, 12 000r min 离心 15min , 抽提
1 次。上清加入 1 3 体积 NaAC(10mol L pH 5.2), 冰浴 30min ,
4℃、12 000r min 离心 15min ,取上清液分别采用 3 种方法沉淀
RNA:
①1 4 体积的 LiCl , -20℃, 沉淀过夜。
②1 4 体积的 LiCl和 1 2倍体积的无水乙醇 , -70℃, 1h。
③2.5 倍体积的无水乙醇-70℃, 0.5h。
沉淀后在 4℃、12 000g离心 15min , 弃上清 , 用 75%的乙醇
洗沉淀 2次 , 每次 12 000r min 离心 5min。于室温放置 30min ,
加入 30μl DEPC 水溶解 RNA ,用 1.2%的琼脂糖电泳检测完整
性和Genespec检验 RNA 的纯度和含量。
2　结果
2.1　RNA质量分析
样品经 1∶49 稀释后用 Genespec检测 ,结果如表 1所示 , 改
良的SDS 酸酚法和热硼酸法都能提出纯度较高的 RNA , OD260
OD280比值都在 1.7 以上 , CTAB 法提取的 RNA用方法②沉淀 ,
RNA OD260 OD280值为 1.72;①③方法沉淀的 RNA OD260 OD280都
很低 , , 说明该方法不能很好地去除蛋白质和多糖等杂质 , 因
此认为 CTAB法不适合东亚砂藓 RNA的提取 。热硼酸盐法提
取东亚砂藓采用①②③沉淀 RNA , OD260 OD280比值都很高 , 说
明 RNA纯度较高 , 但是 RNA含量较低 , 而且耗时长 , 认为 SDS
法优于热硼酸盐法;3 种沉淀方法中方法②用 1h 就能很好地
沉淀 RNA , 该方法也很实用。
表 1　3种提取的 RNA方法比较
Table 1　Comparison of three method of RNA extraction
样品 CTAB法 热硼酸盐法 改良的 SDS 酸酚法
东亚
砂藓
沉淀
方法
RNA提取量
(μg.g -1)
OD260
OD280
RNA 提取量
(μg.g-1)
OD260
OD280
RNA 提取量
(μg.g-1)
OD260
OD280
① 30.5 1.603 25.68 1.93 51.1 5.986
② 23.2 1.72 15.68 2.184 46.2 5.05
③ 47.3 1.362 35.2 1.874 51.1 9.774
2.2　RNA的完整性分析
取 4μl RNA 样品 ,用 1.2%琼脂糖电泳 , 120V 电压 , 30min;
UVP-紫外凝胶成像系照相分析。
2.2.1　CTAB法提取东亚砂藓 RNA电泳图分析
图 1　CTAB法提取东亚砂藓 RNA 电泳图
1 、2 、3泳道分别 3种沉淀方法结果。
Fig.1　Electrophoresis profile of totle RNA isolated by CTABmethod in Rha-
comitrunm canescens
Lane 1, 2 , 3 is the result of three method respectively.
如图 1 所示凝胶上方有明显 DNA带 , 1 、2 泳道 28S rRNA
条带明显缺失 , 大部分降解 , 18S rRNA 条带清晰 ,但有明显的
背景 , 这与前面测得的OD260 OD280值低相符合 , 说明 RNA纯度
不高 ,有蛋白质和多糖杂污染;3 泳道上端的 DNA 条带最明
显 , ,泳道上条带不清晰连成一片 , 通过上样时该孔有漂样现
象认为该方法不能有效地去除组织中的多糖 ,多糖随着 RNA
一起沉淀下来。说明 CTAB 法不适合东亚砂藓 RNA的提取。
2.2.2　热硼酸盐法提取东亚砂藓 RNA电泳分析
图 2　热硼酸盐法图取东亚砂藓 RNA 的电泳
1 、2 、3泳道分别 3种沉淀方法结果。
Fig.1　Elect rophoresis profi le of totle RNA isolated by hot borate method in
Rhacomitrunm canescens
Lane 1, 2 , 3 is the result of three method respectively.
如图 2 所示 泳道上方有 DNA污染 1、2、3 泳道 28S rRNA、
18S rRNA 条带清晰 , 但 28S rRNA 条带亮度和宽度并不是 18S
rRNA 条带的2 倍 , 28S rRNA 有缺失。有明显的背景 ,而且有杂
带。 ①②③沉淀 RNA方法没有明显的区别 , 没有蛋白质 、多糖
干扰 , 说明蛋白质等杂质在前面提取过程中能有效地去除 , 说
明热硼酸盐法提取东亚砂藓是可行的 , 但耗时较长 、有 DNA 污
染 、产量低的缺点有待改进。
2.2.3　SDS 酸酚法提取东亚砂藓 RNA方法分析
如图 3 所示能够看到泳道 1、2 上 28S 、18S rRNA 条带清
晰 , 28S rRNA亮度和宽度大约是 18S rRNA 的 2 倍 , 条带整齐 ,
无背景 , 3 泳道背景干净 , 但 28S rRNA、18S rRNA 有缺失。说明
该方法提取东亚砂藓 RNA完整性好 ,纯度高;3 种沉淀法方比
较而言①略有背景 , ②更好一些 , 而且②只在 1h 就能完成沉
淀过程 , 节省时间。
2.3　RT-PCR结果
将 SDS 酸酚法提取②沉淀的 RNA 进行 DNase 酶消化 , 用
T13C(购自上海生工)进行反转录 , 并用不同的随机引物进行
扩增。结果如图 4所示 , 得到很好的结果。 cDNA扩增条带分
子量集中在 250bp～ 2 000bp 之间。说明该方法提取的 RNA 能
够满足下一步试验的要求。
4　讨论
不同的 RNA提取方法各有优缺点 , 对不同的物种及组织
38　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　生　物　技　术　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 17 卷第 1期
图 3　改良的 SDS 酸酚法提取东亚砂藓 RNA 的电泳
1 、2 、3泳道分别 3种沉淀方法结果。
Fig.3　Elect rophoresis profile of totle RNA isolated by improved SDS sour phe-
nol method method in Rhacomitrunm canescens
Lane 1 , 2, 3 is the result of three method respectively.
图 4　RT-PCR结果
M为 DNA Marker;泳道 1～ 6位随机引物。
Fig.4　RT-PCR amplifi cation of RNA
M is DNA Marker;1～ 6 Lane are arbitrary primer.
应特定的选择或改良相应的方法。 CTAB 法最初用于木本植
物 DNA 提取 , 适合于含多酚和多糖物质多的材料[ 14] 。曹秋
芬[ 15]等利用CTAB法从苹果属植物中提取了总 RNA , 在提取
方法上作了改进 ,用 β-巯基乙醇代替了 PVP , 并用 TE 溶解完
RNA后进行离心去杂质。 CTAB 在一定浓度下与核酸结合并
通过离心形成 CTAB-核酸复合物沉淀 , 高盐溶液(2mol L 的
NaCl)溶解 CTAB-核酸复合物 ,用 LiCl选择性的沉淀 RNA , 由
图 1看到 28S rRNA 几乎全部缺失 , 有 DNA污染 , 泳道模糊一
片 ,多糖 、蛋白质等杂质没有除去 , 东亚砂藓含次生代谢产物
多而且复杂 , 该方法不能有效抑制这些代谢产物导致 RNA 降
解 ,笔者认为该方法不太适合东亚砂藓 RNA的提取。国内外
也有许多学者[ 5 ,10]用热硼酸盐法成功提取植物组织中的 RNA ,
热硼酸缓冲液中硼酸可以和酚类物质形成复合物 ,抑制了酚
类物质的氧化及其与 RNA 的结合 ,消减了缓冲液的褐色 ,蛋白
酶K有效的抑制了蛋白对RNA提取的干扰。欧阳浩淼[ 2]等曾
用热硼酸盐法提取仙鹤藓 RNA , 得到了背景干净 、带型好 、量
大的 RNA。用该方法提取 RNA 如图 2 和表 1 看到完整性较
好 ,纯度也高 , 但热硼酸法耗时长 、成本高 、RNA 产量低 , 有
DNA 污染 , 还有待于改进。 改良的 SDS 酸酚法 , 是在王玉
成[16]等方法上进行改进的 , 笔者认为苔藓植物本身次生代谢
产物多 , 成分复杂 ,用 SDS 替代 CTAB 能更好的将蛋白质变性 ,
同时对 RNase也有抑制作用;王玉成等整个提取过程都在冰
浴上操作 , 笔者在冰浴上操作没能得到 RNA ,在 65℃水浴浸提
得到 RNA如图 3 所示 ,这可能与苔藓植物结构组成有关 ,浸提
后蛋白质变性 , Tris-酚 、氯仿有效地抑制 RNase活性 , 低浓度
的无水乙醇和 KAC 使植物多糖形成沉淀[ 3 ,17 ,18] , 一起离心除
去。这样第一次离心上清液澄清 , 只需抽提一次就无蛋白层 ,
减少了 RNA的损失 , 提高了 RNA 产量。 3 种沉淀方法比较而
言①方法得到的 RNA纯度高 , 完整性好 , 但产率偏低 , 耗时较
长 , 多糖理化性质与 RNA 相似 ,会随 RNA 一起沉淀下来[19] , 有
试验证明 Li+影响反转录[ 17 ,18] , 可能影响下一步实验的进行;
②加入的无水乙醇加快了 LiCl沉淀 RNA 的进程 ,在 1h 就能得
到高质量的 RNA , 能够顺利进行下一步试验;③方法用无水乙
醇沉淀 RNA ,虽然测得的得率较高 ,但纯度明显下降 ,这是因为
无水乙醇不能选择性地沉淀 RNA , 蛋白质等会随着一起沉淀。
综上所述 , 改良的SDS 酸酚法更适合东亚砂藓总 RNA 提
取 , 采用无水乙醇和 LiCl配合沉淀 RNA节省时间 ,产率高。
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摘要:目的:利用改良酶法发展了一种从微量(几百微升)发酵液中快速安全的提取放线菌基因组 DNA的方法。方法:利用
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