全 文 ：中国农学通报 2015,31(25):107-112
Chinese Agricultural Science Bulletin
新疆野扁桃自交不亲和基因SSK1的克隆及生物信息学分析
夏江宏，曾 斌，李伟阳，田 嘉，李 疆，刘梦雯，阿卜都赛麦提·艾则孜
（新疆农业大学林学与园艺学院/新疆农业大学果树学新疆特色果树研究中心，乌鲁木齐 830052）
摘 要：为了获得新疆野扁桃居群中自交不亲和花粉特异性表达的SSK1基因全长，以新疆野扁桃植物叶
片及花粉为试验材料通过 rt-PCR技术以及生物测序等技术，克隆得到了一个新的 SSK1基因全长
cDNA，PetSSK1。PetSSK1全长为602 bp，开放阅读框为534 bp，共编码了177个氨基酸，经生物信息学
分析，PetSSK1蛋白的分子式为C910H1421N233O295S6，相对分子质量为 20538.0，理论推导半衰期为 30 h，等
电点为 4.52，不稳定指数为 41.48，平均疏水指数为-0.567，PetSSK1蛋白属于水溶性不稳定蛋白。首次
从新疆野扁桃植株中克隆得到了SSK1基因全长。通过对该基因的克隆及序列分析，为今后的表达分析
以及有效利用该基因获得自交亲和植株奠定了基础。
关键词：新疆野扁桃；自交不亲和；PetSSK1基因；克隆
中图分类号：S662.9 文献标志码：A 论文编号：casb15030187
Cloning and Bioinformatics Analysis of Self-incompatibility Gene SSK1 of Wild Almond in Xinjiang
Xia Jianghong, Zeng Bin, Li Weiyang, Tian Jia, Li Jiang, Liu Mengwen, Abdusaimaiti·Aizaiz
(Collage of Forestry and Horticulture of Xinjiang Agricultural University/
The Characteristics Fruit Tree Research Center of Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052)
Abstract: The research aims to obtain the full- length SSK1 gene with specific expressions in the self-
incompatible pollens from wild almond clusters of Xinjiang area. In this research, the leaves and pollen of wild
almonds of Xinjiang area were chosen as the materials. Through the rt-PCR and bioinformatics sequencing, the
author got a new full-length SSK1 gene, named as PetSSK1. The results showed that the full-length of PetSSK1
was 602 bp and the open reading frame was 534 bp, encoding 177 amino acids. Through the bioinformatics
analysis, the molecular formula of PetSSK1 protein was C910H1421N233O295S6 and the relative molecular mass of it
was 20538.0, and its estimated half-life was 30 h in theory. Moreover, the result showed that the hydrophobic
index and the grand average of hydropathicity of PetSSK1 protein were 41.48 and - 0.567, respectively,
indicating that PetSSK1 protein belonged to the unstable water-soluble protein. It is the first report that a novel
SSK1 gene has been cloned from wild almonds of Xinjiang area. Through the gene cloning and sequence
analysis, expression analysis laid the foundation for the future and the effective use of the gene to obtain self-
compatible plants.
Key words: Xinjiang wild almond; self-incompatibilty; PetSSK1; cloning
0 引言
野扁桃(Prunus tenella)也称野巴旦杏，是蔷薇科
李亚科桃属扁桃亚属植物，属新生代第三纪遗留物种，
是世界上古老的野生果树之一，在世界上的分布已经
基金项目：国家自然科学基金“新疆野扁桃自交不亲和性的分子机制研究”(31260465)；林业公益性行业科研专项，新疆特色林果提质增效关键技术
研究与示范之专题“新疆特色林果优良品种选育与推广”(201304701-1)；新疆维吾尔自治区果树学重点学科(201007)。
第一作者简介：夏江宏，男，1990年出生，重庆垫江人，硕士，研究方向：果树学。通信地址：830052新疆乌鲁木齐市农大东路311号新疆农业大学林
学与园艺学院，E-mail：939414098@qq.com。
通讯作者：曾斌，男，1970年出生，湖北松滋人，副教授，硕士生导师，博士，主要从事果树种质资源及生物技术的教学与科研工作。通信地址：830052
新疆乌鲁木齐市农大东路311号新疆农业大学林学与园艺学院，E-mail：zbxnd@163.com。
收稿日期：2015-03-23，修回日期：2015-05-18。
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相当稀少，现今只有哈萨克斯坦和中国新疆地区有少
量分布 [1]，主要分布在塔城和阿勒泰，而随着过度放
牧，自然环境的恶化等因素，对野扁桃的生存造成了很
大威胁。野扁桃具有抗寒、耐旱、耐虫、耐病和耐盐碱
等优良性状[2]。
植物自交不亲和性(self-incompatibility，SI)是指在
花期相遇的情况下，同一植株或基因型相同的植株的
花柱特异性识别自己花粉，并抑制花粉管生长的一种
遗传机制[3]。到目前为止，自交不亲和是开花植物最
主要的一种控制受精的机制，是花粉细胞和花柱细胞
相互作用之间的一种生理反应，这 2种独特细胞间的
接触是受空间和时间的授粉行为控制的，这远不同于
其他细胞间的信号转导[4]。因此，SI不仅为研究植物
生殖细胞间信号识别和转导、细胞间相互作用和基因
时空表达提供了一种理想模型，而且在作物遗传改良
和杂种优势利用上具有重要价值[5]。大量研究表明[6-9]，
植物自交不亲和主要分为配子体自交不亲和
(gametophyitic SI, GSI) 和 孢 子 体 自 交 不 亲 和
(sprophytic SI, SSI)，目前研究配子体自交不亲和主要
集中在花粉自交不亲和决定因子 SFB基因的研究、花
柱自交不亲和决定因子 S-RNase的研究[10]，许多研究
表明[11-13]GSI除了花粉决定因子SFB和花柱决定因子
S-RNase外，还有其他的与自交不亲和这一性状相关
的影响因子，而SSK1 (SLF-interacting SKP1-like1)一个
位于S位点外的一类新的SKP1-like1基因就是其中之
一[14-15]。本研究根据同源克隆法[16]，从新疆野扁桃中克
隆得到了 SSK1基因，与其他科属植物 SSK1基因同源
性高达 82%以上，并将其命名为PetSSK1。对该基因
及编码氨基酸序列进行了初步的生物信息学分析，以
期对该基因的进一步研究提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料及地点
2013年 5月在新疆塔城地区采取野扁桃花粉，存
于-70℃冰箱备用。
试验于2013年9月—2014年9月在新疆农业大学
特色果树研究中心进行。
1.2 总RNA的提取及cDNA合成
将野扁桃花粉在液氮中研磨至粉状用RNAprep
Pure Plant Kit（Tiangen公司）提取其总RNA，用 1%的
琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。反转录反应参
照 TransScriptTM First- Strand cDNA Synthesis
SuperMix（Transgen公司）合成第一链 cDNA并保存
在-20℃冰箱。
1.3 RT-PCR及产物测序
以 cDNA 为 模 板 ，用 上 游 引 物 SSK1F
(AATCCCTCTCATAATCTCCAC)和下游引物 SSK1R
(GCTCAGTCCTCATCAACTCC)进行 PCR扩增，反应
体系为 50 μL：ddH2O 37 μL，DNA 1 μL，10 × Buffer
5 μL，引物 (10 μmol/L)各 1 μL，dNTP (0.2 mmol/L)
4 μL，Taq DNA聚合酶（2.5 U/µL）1 μL。PCR反应程
序为 94℃，5 min预变性；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃
1 min反应 35个循环；72℃延伸 10 min，4℃保存。将
PCR产物回收、连接、转化、测序。
1.4 生物信息学分析
利用 NCBI上的在线 Blast软件 (http://blast.ncbi.
nlm.nih.gov/Blast.cgi)和 ORF Finder软件 (http://www.
ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi)分别对 PetSSK1基因序
列进行在线比对及开放阅读框的预测 [17]；利用
DNAMAN软件进行多重序列比对；利用MEGA4的
临近算法构建 PetSSK1基因编码氨基酸序列的系统
进化树[18]；利用在线工具Expasy ProtParam(http://web.
expasy.org/protparam/)预测 PetSSK1氨基酸序列的理
化性质；利用 TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.
dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)对蛋白的跨膜结构域进
行分析；利用 ProtScale软件分析蛋白的亲水性/疏水
性[19]。
2 结果与分析
2.1 野扁桃SSK1基因的克隆
以野扁桃cDNA为模版，通过RT-PCR扩增野扁桃
PetSSK1基因。该基因大小为602 bp，含534 bp最大开
放阅读框（图 1~2），G+C含量为 58.1%，A+T含量是
41.9%，共编码了 177个氨基酸。将该基因在NCBI上
进 行 Blast 比 对 ，发 现 和 Prunus avium 的 SSK1
(JQ322646)基因的相似度高达 98%，说明该基因可能
是SFB-interacting SKP1-like1基因家族中的一员。
图1 SSK1基因的克隆
bp
M
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夏江宏等：新疆野扁桃自交不亲和基因 SSK1的克隆及生物信息学分析
2.2 PetSSK1蛋白的理化性质预测及分析
用 ProtParam预测野扁桃 PetSSK1基因编码氨基
酸序列。该基因编码了 177个氨基酸，推测该蛋白的
分子式为C910H1421N233O295S6，相对分子质量为 20538.0，
等电点为4.52，理论推导的半衰期为30 h，负电荷和正
电荷的氨基酸残基总数分别为 43和 22，脂肪指数
83.11，不稳定参数为41.48，疏水指数为-0.567，是水溶
性不稳定蛋白。
2.3 PetSSK1基因编码蛋白信号肽和跨膜结构预测
由于蛋白质的合成和功能场所常常被一层到多层
的质膜分隔开，这样就涉及到了蛋白质的转运问题，而
蛋白质定位的信息存在于该蛋白质自身结构中，在起
始密码子之后，有一段编码疏水氨基酸序列的RNA片
段，这个氨基酸序列就是信号肽序列[20]。利用在线软
件Signal P对PetSSK1基因编码氨基酸序列进行信号
肽预测，结果（图3）显示PetSSK1蛋白无信号肽。同时
使用Expasy中的TMHMM软件对该蛋白进行跨膜区
域分析（图 4），发现PetSSK1蛋白不含跨膜结构，与该
蛋白质的信号肽预测结果一致。
2.4 蛋白质亲疏水性分析和二级结构分析
疏水作用是蛋白质折叠的主要驱动力，蛋白质的
亲/疏水作用分析对蛋白质二级结构和三级结构的预
测有重要意义。通过用Expasy的在线软件Protscale，
利用Kyte和Doolittle算法，预测PetSSK1蛋白的亲/疏
图2 PetSSK 1的核酸序列结构模型图及氨基酸序列
图3 PetSSK 1信号肽序列预测结果
图4 蛋白质跨膜结构的预测结果
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水性预测 [21]。结果显示（图 5），PetSSK1蛋白大约在
70~98位氨基酸处有一个明显的亲水性区域，表明该
蛋白为亲水性蛋白，和Protparam预测的结果一致。
通过PredictProtein预测PetSSK1蛋白的二级结构
（图 6），α螺旋所占比例为 55.37%，β折叠为 6.21%，无
规则卷曲为38.42%，以α螺旋为主要成分。
2.5 PetSSK1蛋白与其他SKP1蛋白的比对
PetSSK1蛋白与其他植物的 SKP1蛋白相似率较
高（图 7），并与 Prunus avium的 SSK1(JQ322646)基因
的相似度高达 98%。根据 NCBI 的在线软件 [22]
Conserved Domains预测该蛋白具有SKP1蛋白的结构
域（图8），所以可以确定该基因为野扁桃的SSK1候选
基因。
2.6 PetSSK1蛋白系统进化树的构建
通过构建进化树发现（图9），PetSSK1与甜樱桃的
SSK1基因同源性较高，与金鱼草、矮牵牛等植物的
SKP1同源性较低，而SSK1蛋白又和其他Skp1-like蛋
白区分开来。
3 结论
本研究基于野扁桃全测序数据，通过同源克隆，获
得了野扁桃自交不亲和PetSSK1基因，并用生物信息
学的方法对其表达的氨基酸序列进行了分析和预测。
结果表明PetSSK1基因全长为534 bp，共编码177个氨
基酸，分子质量为 42649.8，其基因序列与 Prunus
图5 PetSSK1蛋白的亲/疏水性预测结果
图6 PetSSK1蛋白的二级结构预测结果
螺旋
折叠
卷曲
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夏江宏等：新疆野扁桃自交不亲和基因 SSK1的克隆及生物信息学分析
avium的SSK1基因的同源性高达98%。PetSSK1蛋白
为亲水性蛋白，无信号肽及跨膜结构域，可能为胞内蛋
白。且该蛋白含SKP1的结构域，并且PetSSK1蛋白与
甜樱桃SSK1蛋白、以及梅SKP1A蛋白在系统进化树
上关系较近（图9）。因此，可确定PetSSK1基因为野扁
桃SSK1基因的候选基因。
4 讨论
在 2006年以前，人们研究植物自交不亲和，主要
着手于 S-RNase和花粉 S核酸位点的研究，而张一婧
等[23]通过对金鱼草SCF复合体组分分析，发现AhSSK1
基因是一种新的 SKP1-like基因，并且能够与AhSLF、
CUL-like相互作用可能形成包括 SSK1、CUL1、SLF和
Rbx1的 SCF复合体。至于 SSK蛋白与 SLF蛋白能否
形成 SCF泛素连接酶并引导底物蛋白 S-核酸酶进入
蛋白酶体降解过程，还需要进一步的证据。到目前为
止只在李、苹果、海棠、矮牵牛、金鱼草等配子体自交不
36PetSSK1
36PaSSK1
49PbSSK1
61PbSSK2
36PmSKP1A
36
Pa
譖pSSK1
49MdSSK2
49MhSKP7
49PbSKP11
31FvsvSKP4
67MdSSK1
67MdSKP11
28TcSKP1A
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Pa×PpSSK1：甜樱桃和中国樱桃杂交品种的SSK1蛋白(Prunus avium×Prunus pseudocerasus ssk1)；PbSSK1：鸭梨SSK1蛋白(Pyrus bretschneideri
cultivar‘YaLi’SSK1)；PbSSK2：鸭梨SSK2蛋白(Pyrus bretschneideri cultivar‘YaLi’SSK2, PbSSK2)；MdSSK1：富士苹果SSK1(Malus×domestica
cultivar‘FuJi’SSK1),PaSSK1：甜樱桃SSK1(Prunus avium SSK1)；PmSKP1A：梅SKP1A蛋白(Prunus mume SKP1-like protein 1A)；MdSKP11：苹果
SKP11蛋白(Malus domestica SKP1-like protein 11)；MdSSK2：苹果SSK2蛋白(Malus domestica SLF-interacting Skp1-like protein 2)；MhSKP7：湖北海
棠SKP7蛋白(Malus hupehensis SKP1-like protein7)；FvsvSKP4：野草莓SKP4蛋白(Fragaria vesca subsp. Vesca SKP1-like protein7)TcSKP1A：
MdSSK2：富士苹果SSK2(Malus×domestica cultivar‘FuJi’SSK2)。
图7 PetSSK1氨基酸序列与其他植物SKP1的比对
图8 PetSSK1蛋白的结构域预测
Pa×PpS K1
Pa×PpS K1
Pa×PpS K1
·· 111
中国农学通报 http://www.casb.org.cn
亲和植物中有少量报道。
本研究首次从新疆野扁桃植物中克隆得到了
SSK1基因，并对其进行初步的功能分析与鉴定，为获
得野扁桃自交不亲和植株，克服新疆野扁桃因不适应
现代生境的变化，带来的生存面积衰减有重要意义。
预计其在野扁桃自交不亲和中具有重要作用，其如何
行使功能有待后续试验进行证明。然而，该基因的表
达方式、表达产物、表达位置有待进一步确定。
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·· 112