全 文 ：第３５卷第３期
２　０　１　２年５月
河 北 农 业 大 学 学 报
ＪＯＵＲＮＡＬ　ＯＦ　ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬ　ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ　ＯＦ　ＨＥＢＥＩ
Ｖｏｌ．３５Ｎｏ．３
Ｍａｙ．２　０　１　２
　 　
文章编号：１０００－１５７３（２０１２）０３－００４１－０６
紫大麦草中ＤＲＥＢ类转录因子基因Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ　２
的克隆、原核表达及序列分析
肖　雄１，　 王睿辉１，　刘桂茹１，　温树敏１，２，　谷俊涛１，２
（１．河北农业大学 农学院，河北省作物种质资源实验室，河北 保定０７１００１
２．河北农业大学 生命科学院，河北 保定０７１００１）
摘要：ＤＲＥＢ类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白，本研究利用同源克隆方法和ＲＡＣＥ技术
从紫大麦草（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）中分离到１个ＤＲＥＢ类转录因子基因，命名为 Ｈｖｉ９１７　ＤＲＥＢ２。序列分析表
明Ｈｖｉ９１７　ＤＲＥＢ２基因含有１个７９２ｂｐ的开放阅读框，编码２６４个氨基酸残基，含有１个保守的 ＡＰ２结构域，
属于ＡＰ２大家族。该基因编码的氨基酸序列与Ｇｅｎｅｂａｎｋ中短芒大麦草 ＡＰ２蛋白 ＨｂＤＲＥＢ２、ＤＲＥＢ１（登录号
分别为：ＡＡＵ２９４１２．１和ＡＥＲ４２６２０．１）具有９９％的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体，经
ＩＰＴＧ诱导表达了１个分子量为３４．５ｋＤ的蛋白。
关　键　词：紫大麦草；ＤＲＥＢ２；基因克隆；转录因子；原核表达
中图分类号：Ｑ７８５ 文献标志码：Ａ
Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ
ｏｆ　ＤＲＥＢ－ｌｉｋｅ　ｇｅｎｅ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２ｉｎ　Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ
ＸＩＡＯ　Ｘｉｏｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｒｕｉ－ｈｕｉ　１，ＬＩＵ　Ｇｕｉ－ｒｕ１，ＷＥＮＳｈｕ－ｍｉｎ１，２，ＧＵ　Ｊｕｎ－ｔａｏ１，２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｉｎ　Ｈｅｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，
Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｌｉｆｅ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｏｆ　Ｈｅｂｅｉ，Ｂａｏｄｉｎｇ　０７１００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＤＲＥＢ－ｌｉｋｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ｉｓ　ａ　ｋｉｎｄ　ｏｆ　ｉｍｐｏｒｔａｎｔ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｏｒ　ｐｌａｎｔ　ｔｏ　ｒｅｓｐｏｎｄ　ａｂｉ－
ｏｔｉｃ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ．Ｕｓｉｎｇ　ａ　ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＲＡＣＥ　ａｎｄ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ　ＤＲＥＢ－ｌｉｋｅ　ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ
Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ，ｎａｍｅｄ　ａｓ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２，ｗａｓ　ｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈａｔ
ｉｔ　ｃｏｎｔａｉｎｓ　ａｎ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ｏｆ　７９２ｂｐ　ｅｎｃｏｄｉｎｇ　ａｐｕｔａｔｉｖｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗｉｔｈ　２６４ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ，
ａｎｄ　ａ　ｈｉｇｈｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ＡＰ２－ｓｕｐｅｒ　ｆａｍｉｌｙ　ｄｏｍａｉｎ．Ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｗｉｔｈ　ＨｂＤＲＥＢ２（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ．
ＡＡＵ２９４１２．１）ａｎｄ　ＤＲＥＢ１（ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｏ　ＡＥＲ４２６２０．１）ｆｒｏｍ　Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｂｒｅｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ，ｓｅ－
ｑｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２　ｓｈｏｗｅｄ　９９％ｉｄｅｎｔｉｔｙ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｃｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒ
ｆｕｓｅｄ　ｗｉｔｈ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ａｎｄ　ａ　３４．５ｋＤ　ＤＲＥＢ－ｌｉｋｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｗａｓ　ｅｘ－
ｐｒｅｓｓｅｄ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｅａｒｃｈ　ｐｒｅｐａｒｅｄ　ｔｈｅ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｒｅｓｅａｒｃｈｉｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ
ＤＲＥＢ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ａｎｄ　ＤＲＥ　ｃｉｓ－ｅｌｅｍｅｎｔ，ａｌｓｏ　ｐｒｏｖｉｄｅｄ　ａ　ｃａｎｄｉｄａｔｅ　ｇｅｎｅ　ｆｏｒ　ｗｈｅａｔ　ｍｏ－
ｌｅｃｕｌａｒ　ｂｒｅｅｄｉｎｇ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍ；ＤＲＥＢ２；ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ；ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　　　　　　　　　　
收稿日期：２０１２－０３－１２
基金项目：国家转基因生物新品种培育重大专项（２００９ＺＸ０８００２－０１２）；国家自然科学基金（３０６００３８９）资助．
作者简介：肖　雄（１９８６－），男，在读硕士生，遗传学专业，Ｅ－ｍａｉｌ：５８２５２０４１４＠ｑｑ．ｃｏｍ．
通讯作者：王睿辉（１９７３－），男，博士，副教授，作物遗传育种专业．Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｒｈ＠ｈｅｂａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ．
４２　 河 北 农 业 大 学 学 报　　　　 第３５卷　 　
　　干旱、盐碱、低温等非生物因素对植物的生长发
育有着极为重要的影响，是造成农作物减产的重要
因素。转录因子是一类可以特异性地与ＤＮＡ分子
结合从而激活或者抑制下游功能基因转录的蛋白。
研究表明，转录因子基因可以调控一系列与逆境相
关的功能基因的表达。因此，与单纯的使用下游基
因来改良植物的抗逆性相比，利用转录因子来增强
植物抗逆性，能够获得较为理想的效果［１－２］。ＤＲＥＢ
类转录因子是植物所特有的一类在非生物逆境胁迫
应答中起重要作用的蛋白分子。此类转录因子含有
一个由５８个氨基酸组成的 ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ保守结构
域，该结构域能与耐逆基因启动子中的ＤＲＥ／ＣＲＴ
顺式原件特异结合，启动基因表达，因而ＤＲＥＢ转
录因子被认为可能与植物对干旱、高盐和低温应答
的基因调控有重要关系［３］。已有研究表明，ＤＲＥＢ
类转录因子基因在转入拟南芥、水稻等模式植物后，
转基因植株对干旱、高盐和低温的耐受性得到显著
提高［４］。因此，以响应非生物胁迫的转录因子作为
研究目标，分离植物逆境胁迫下的 ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类
转录因子基因并研究其功能，为利用转基因途径提
高作物抗性具有重要意义。
本研究以１份采集于陕西省定边县的紫大麦草
（Ｈｏｒｄｅｕｍ　ｖｉｏｌａｃｅｕｍＢｏｉｓｓ．ｅｔ　Ｈｕｅｔ）为材料，利用
同源克隆和 ＲＡＣＥ技术［５］从中克隆到１个ＤＲＥＢ
类转录因子基因，并对该基因进行了初步的生物信
息学和原核表达分析。
１　材料与方法
１．１　材料及试剂
紫大麦草（Ｈ．ｖｉｏｌａｃｅｕｍ）来自中国国家种质库
（材料编号Ｚ２１０４），２００２年采集于陕西省定边县的
一处盐碱化草场，由中国农业科学院杨欣明副研究
员提供。原核表达载体ｐＥＴ－２８ａ、ＴＯＰ１０大肠杆菌
感受态菌株、ＰＧＭ－Ｔ载体购自北京天根生化科技
有限公司，ＲＮＡ提取试剂盒（ＲＮＡ　Ａｓｉｏ　ＴＭ　ｐｌｕｓ
ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ）、反转录试剂盒（Ｐｒｉｍｅ　Ｓｃｒｉｐｔ　ＴＭ　１ｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ）购自宝生物工程（大
连）有 限 公 司，Ｔｒａｎｓ　Ｔａｑ－Ｔ　ＤＮＡ　Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ，
ｐＥａｓｙ－Ｔ１Ｓｉｍｐｌｅ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｋｉｔ购自全式金公司。引
物合成由上海生工公司完成，基因测序由华大基因
和上海生工完成。
１．２　植物材料的准备
将紫大麦草种子用蒸馏水洗净，置于铺有滤纸
的玻璃培养皿中，放于２５°Ｃ恒温培养箱中浸种催
芽。待种子第１片叶长至１ｃｍ左右时，将幼苗移入
盛有珍珠岩的花盆，置光照培养箱２５℃下１６ｈ／８ｈ
光／暗交替培养。待幼苗长至３叶１心时，用２５０
ｍｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ溶液处理处理４ｈ提取ＲＮＡ。
１．３　总ＲＮＡ的提取及反转录
用ＲＮＡ　Ａｓｉｏ　ＴＭ　ｐｌｕｓ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ提取叶片总
ＲＮＡ，方法按制造商的产品说明进行。用 １ｓｔ
Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　Ｋｉｔ进行反转录。反转录
生成的１ｓｔ　Ｓｔｒａｎｄ　ｃＤＮＡ 即可用于下一步的ＰＣＲ
扩增。反转录反应步骤参照试剂盒说明书进行。其
中对于生成用于扩增基因３’端的ｃＤＮＡ 时，用
Ｔ７ｄＴ１８引物代替试剂盒中的 Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１５合成
１ｓｔ　ｃＤＮＡ。
１．４　引物设计
根据已报道的大麦属及其近缘植物的 ＤＲＥＢ
基因保守序列，用Ｐｒｉｍｅｒ５软件设计基因保守区引
物Ｘ１、Ｘ２。根据基因保守区测序结果设计３′－
ＲＡＣＥ引物 ３Ｒ１ 和 ３Ｒ２、５′－ＲＡＣＥ 引物 ５Ｒ１ 和
５Ｒ２，３′端锚定引物Ｔ７ｄＴ１８和Ｔ７由河北农业大学
郎明林副研究员提供。根据大麦属植物 （Ｈ．ｂｒｅ－
ｖｉｓｕｂｕｌａｔｕｍ）已发表的 ＤＲＥＢ 基因开放阅读框
（ＯＲＦ）上游序列设计正向引物ＴＹ５Ｍ，根据紫大麦
草ＤＲＥＢ基因的ｃＤＮＡ序列设计用于扩增ＯＲＦ的
引物（ＦＳａｃ和ＲＸｈｏ）（表１）。
表１　试验用引物
Ｔａｂｌｅ１　Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔｓ　ｕｓｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ
引物序列
Ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ
引物长度／ｂｐ
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ｌｅｎｇｔｈ
退火温度／℃
Ａｎｎｅａｌ．
ｔｅｍｐ．
Ｘ１ ｔｔａｃｃｇｔｇｇｔｇｔｇａｇｇｃａ　 １８　 ６０
Ｘ２ ｇｇａａｔｇｃｔｃｔｇｇｇａａｇｔｔｇａ　 ２０　 ６１
Ｔ７ｄＴ１８ ａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｔｔｔ－ｔｄｔ１８　 ４０　 ５９
Ｔ７ ａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｃｔｔｔｔｔ　 ２２　 ５４
３Ｒ１ ｇｔｇｇｃｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｃｃｔａｃ　 ２１　 ６０
３Ｒ２ ｃｇｔｃａａｃｔｔｃｃｃａｇａｇｃａｔｔｃ　 ２１　 ６０
５Ｒ１ ａａｔｇｃｔｃｔｇｇｇａａｇｔｔｇａｃｇ　 ２０　 ５８
５Ｒ２ ａｔｃｔｃａｇｃｃａｃｃｃａｔｔｔｇｃ　 １９　 ５８
ＴＹ５Ｍ ｇａｔｇａｃｃａｇｇａａｇａａｇａａａｇｔｇｃ　 ２３　 ６０
ＦＳａｃ　 ｃ　ｇａｇｃｔｃａｔｇａｃｃａｇｇａａｇａａｇａａａ　 ２５　 ６２
ＲＸｈｏ　ｃｃ　ｇｃｔｃｇａｇｃｔａａｔａｔｇａｇａａａａｇａｃｔａａａｃｃｃｇ　３４　 ６３
第３期 肖　雄等：紫大麦草中ＤＲＥＢ类转录因子基因Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２的克隆、原核表达及序列分析 ４３　　 　
１．５　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２的克隆及其 开放阅读框（ＯＲＦ）的
获得
以ｃＤＮＡ第１链为模板，用Ｘ１／Ｘ２引物对扩增
ＤＲＥＢ基因的保守结构域，参照王呈玉的方法［６］，扩
增用２０μＬ体系，退火温度５８℃。扩增产物用１％
琼脂糖凝胶电泳进行分离，回收目标产物并克隆到
ｐＧＭ－Ｔ载体，阳性克隆送测序。以ｃＤＮＡ为模板，
用３Ｒ１／Ｔ７、３Ｒ２／Ｔ７引物进行巢式扩增，２轮扩增
参数除退火温度设置为５５℃外，方法同上述保守域
的扩增。扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上分离，目标
片段克隆到ＰＧＭ－Ｔ载体，阳性克隆送测序。以反
转录产物为模板，用ＴＹ５Ｍ／５Ｒ１、ＴＹ５Ｍ／５Ｒ２引物
对进行巢式扩增，反应体系、扩增条件同上。扩增产
物在琼脂糖凝胶上分离，目标片段克隆到ＰＧＭ－Ｔ
载体，阳性克隆送测序。用ＤＮＡｓｔａｒ软件对测序结
果进行序列拼接。
１．６　生物信息学分析
利用ＤＮＡＳＴＡＲ软件分析基因的编码氨基酸
序列。用美国国家生物信息中心（ＮＣＢＩ）网站上的
ＢＬＡＳＴｐ软件分析基因的保守功能域，用ＢＩＡＳＴｘ
进行基因的同源性比对。用 ＤＮＡＭＡＮ软件中的
多重序列比对建立系统进化树。应用生物序列分析
中心网站（网址ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／）的ＴＭ－
ＨＭＭ－２．０软件对基因的跨膜域进行预测。
１．７　 原核表达
用引物 ＦＳａｃ／Ｒｘｈｏ扩增ｃＤＮＡ，回收扩增片
段，目的条带与ｐＥａｓｙ－Ｔ１载体连接，转化大肠杆
菌，阳性克隆测序。将ＰＣＲ产物、载体ｐＥＴ－２８ａ分
别用ＳａｃⅠ和ＸｈｏⅠ双酶切，回收酶切产物，加入
Ｔ４ＤＮＡ连接酶，１６℃下过夜连接，构建重组质粒
ｐＥＴ－Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２，转化大肠杆菌 ＴＯＰ１０，筛选
阳性克隆。将鉴定正确的重组质粒转化大肠杆菌感
受态ＢＬ２１（ＤＥ３）。３７℃预培养菌液过夜，将含有重组
质粒的菌液１ｍｌ转接到２０ｍｌ　ＬＢ（含１００ｍｇ／Ｌ的
Ａｍｐ＋）液体培养基中，２８℃培养至ＯＤ６００值为０．６
～０．８左右，加入ＩＰＴＧ（终浓度为１ｍｍｏｌ／Ｌ）诱导，
分别在３、６、９、１２ｈ后收集菌液。阴性对照为未加
ＩＰＴＧ前收集的菌液。取１５μｌ处理过的蛋白溶液
进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳，分析蛋白诱导表达结果。
２　结果与分析
２．１　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２基因的克隆
总ＲＮＡ经反转录得到ｃＤＮＡ第１链。以ｃＤ－
ＮＡ为模板，用基因保守区列引物 Ｘ１／Ｘ２进行扩
增，经琼脂糖电泳得到１条长约２００ｂｐ的片段（图
１Ａ），测序显示该片段大小为１８１ｂｐ。继续以ｃＤ－
ＮＡ为模板，用３′－ＲＡＣＥ引物３Ｒ１／Ｔ７、３Ｒ２／Ｔ７引
物组合进行巢式扩增，经２轮ＰＣＲ扩增后得到１条
长约７５０ｂｐ的片段（图１Ｂ）。经测序该片段长７３２
ｂｐ，含有ｐｏｌｙＡ序列，为基因的３′末端。接下来，以
ｃＤＮＡ为模板，用引物组合 ＴＹ５Ｍ／５Ｒ１、ＴＹ５Ｍ／
５Ｒ２进行巢式扩增，经２轮扩增得到长约２５０ｂｐ的
基因５′端，测序后的长度为２３４ｂｐ（图２）。根据对
基因保守序列以及３′－ＲＡＣＥ、５′－ＲＡＣＥ的测序结
果，用ＤＮＡｓｔａｒ软件进行电子拼接，得到１条长度
为１　０６０ｂｐ的序列。
Ｍ：ＤＮＡ分子量ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ－２０００，１Ａ中１为保守区域目的片断（箭
头所示），１Ｂ中１为用３Ｒ１／Ｔ７、３Ｒ２／Ｔ７引物对扩增ｃＤＮＡ结
果（箭头所示）．
图１　基因保守区域（１Ａ）和基因的３′ＲＡＣＥ（１Ｂ）扩增结果
Ｆｉｇ．１　Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ
（１Ａ）ａｎｄ　３′ｒｅｇｉｏｎ．
Ｍ：ＤＮＡ分子量ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ－２０００，１：用ＴＹ５Ｍ／５Ｒ１、ＴＹ５Ｍ／５Ｒ２引
物对扩增ｃＤＮＡ结果（箭头所示）．
图２基因的５′ＲＡＣＥ扩增结果．
Ｆｉｇ．２　Ｎｅｓｔｅｄ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｏｒ　５′ｒｅｇｉｏｎ　ｗｉｔｈ
ＴＹ５Ｍ／５Ｒ１ａｎｄ　ＴＹ５Ｍ／５Ｒ２ｐｒｉｍｅｒ　ｓｅｔｓ．
４４　 河 北 农 业 大 学 学 报　　　　 第３５卷　 　
２．２　生物信息学分析
用ＤＮＡＳＴＡＲ软件对获得的序列进行开放阅
读框（ＯＲＦ）的分析结果表明，该基因的最大 ＯＲＦ
长度为７９５ｂｐ。应用 ＮＣＢＩ网站的 ＯＲＦ　ｆｉｎｄｅｒ软
件分析结果表明，上述７９５ｂｐ序列为目标基因的
ＯＲＦ。进一步用ＮＣＢＩ　ｂｌａｓｔ软件搜索Ｇｅｎｅｂａｎｋ数
据库表明，该基因属于 ＡＰ２家族成员，且与普通小
麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ）、短芒大麦草（Ｈ．ｂｒｅｖｉｓｕｂ－
ｕｌａｔｕｍ）、羊草（Ｌｅｙｍｕｓ　ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、栽培大麦（Ｈ．
ｖｕｌｇａｒｅ）和高羊茅（Ｆｅｓｔｕｃａ　ａｒｕｎｄｉｎａｃｅａ）ＤＲＥＢ类
转录因子具有较高的核苷酸（限于篇幅未列出）和氨
基酸序列一致性（９０％）（图３），其中与短芒大麦草
的ＤＲＥＢ基因序列的一致性程度最高（达到９９％）。
图３　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２基因ＯＲＦ氨基酸序列在ＮＣＢＩ中的ＢＬＡＳＴ结果
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　Ｂｌａｓｔ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｆｒｏｍ　ＮＣＢＩ　ｉｎ
ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ（ＯＲＦ）ｏｆ　ｇｅｎｅ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２
　　利用ＤＮＡＳＴＡＲ软件的ＥｄｉｔＳｅｑ功能，将７９５
ｂｐ的ＯＲＦ翻译成氨基酸序列表明，该基因编码蛋
白的分子量为２９．０５８ｋＤ，理论等电点为７．４５７，为
中性氨基酸，其中极性氨基酸６８个，疏水性氨基酸
７３个，酸性氨基酸和碱性氨基酸各３８个。应用
ＢＬＡＳＴｐ分析的结果表明，Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２ 基因包
含１个ＡＰ２保守区，位于第６１～１２１个氨基酸之间。
用Ｂｌａｓｔｘ软件搜索Ｇｅｎｅｂａｎｋ数据库中的同源
序列，结果显示：基因 Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２ 与短芒大麦
草、栽 培 大 麦、羊 草、普 通 小 麦、二 穗 短 柄 草
（Ｂｒａｃｈｙｐｏｄｉｕｍ　ｄｉｓｔａｃｈｙｏｎ）、高羊茅和草地早熟禾
（Ｐｏａ　ｐｒａｔｅｎｓｉｓ）的 ＤＲＥＢ转录因子具有较高的同
源性（＞８０％）。利用ＤＮＡＭＡＮ软件中的多重比
对功 能，建 立 氨 基 酸 序 列 系 统 进 化 树，发 现
Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２ 基 因 与 短 芒 大 麦 草 ＤＲＥＢ１
（ＪＮ１０７５３７）、ＤＲＥＢ２（ＡＹ７２８８０７）的ＤＲＥＢ基因具
有最高的同源性（图４）。
图４　不同植物ＤＲＥＢ基因的系统进化树
Ｆｉｇ．４　Ｔｈｅ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ＤＲＥＢ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｐｌａｎｔｓ
对蛋白跨膜域的预测有助于正确理解蛋白的结
构和功能。利用生物序列分析中心网站（Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ
Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ，网址 ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．
ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ）的 ＴＭＨＭＭ－２．０ 软 件 对 对 基 因
Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２编码蛋白的预测表明，该基因所编
码的蛋白不存在跨膜域，属于非跨膜蛋白（图５）。
第３期 肖　雄等：紫大麦草中ＤＲＥＢ类转录因子基因Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２的克隆、原核表达及序列分析 ４５　　 　
图５　ＴＭＨＭＭ软件对Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２编码氨基酸
的跨膜域预测
Ｆｉｇ．５　Ｔｈｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ　ｔｒａｎｓ－ｍｅｍｂｅｒａｎｃｅ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｔｈ　ＴＭＨＭＭ　ｓｏｆｔｗａｒｅ
２．３　原核表达
利用ＦＳａｃ／ＲＸｈｏ引物对，扩增基因的ＯＲＦ，在
琼脂糖凝胶电泳分离到一条长度为７５０ｂｐ左右的
片段（图６Ａ），经测序该片段长度为７９６ｂｐ。提取
所构建的重组质粒，用引物ＦＳａｃ／ＲＸｈｏ进行扩增，
结果与所克隆基因片段的大小相同（图６Ｂ）。将重
组质粒转入大肠杆菌ＴＯＰ１０中进行ＩＰＴＧ诱导，对
诱导产物进行 ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 电泳。结果表明：在
ＩＰＴＧ诱导前，阴性对照（图７，泳道１）和阳性对照
（图７，泳道２）中均没有目的蛋白表达。加入ＩＰＴＧ
后的３、６、９、１２ｈ，阳性对照中依旧没有目的蛋白的
表达，而在带有重组质粒的细菌中（图７，第４、６、８、
１０泳道）有一条分子量约为３３ｋＤ大小的特异蛋白
条带出现，即Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２基因表达的２９．０５８ｋＤ蛋
白与ｐＥＴ２８ａ本底表达的５．４３ｋＤ蛋白之和，且在
３、６ｈ时表达量最大，在９ｈ时略有降低，而在１２ｈ
时表达量较少。
Ｍ：ＤＮＡ分子标量ＤＬ－２０００；１：ＯＲＦ扩增片段（Ａ），ＦＳ／ＲＸ引物
对扩增重组质粒结果（Ｂ）
图６　对基因Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２开放阅读框ＯＲＦ（Ａ）和重组
质粒ｐＥＴ－Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２的扩增结果（Ｂ）
Ｆｉｇ．６　ＰＣＲ　ｐｒｏｄｕｃｔ　ｆｏｒ　ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ　ａｎｄ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ　ｐＥＴ－Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２　ｏｆ　ｇｅｎｅ　Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２
Ｍ：蛋白质低分子量ｍａｒｋｅｒ，１：阴性对照（含ｐＥＴ－２８ａ质粒的菌株
在ＩＰＴＧ 诱导前）；２：阳性对照（含 ｐＥＴ－Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２菌株在
ＩＰＴＧ诱导前；３、５、７、９：含 ｐＥＴ２８ａ菌株在ＩＰＴＧ 诱导３、６、９、１２ｈ
时；４、６、８、１０：含ｐＥＴ－Ｈｖｉ９１７ＤＲＥＢ２重组子菌株在ＩＰＴＧ诱导３、
６、９、１２ｈ时的表达情况．
图７　重组质粒在大肠杆菌中的表达
Ｆｉｇ．７　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ　ｆｏｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ　ｉｎ　Ｅ．ｃｏｌｉ　ｉｎｄｕｃｅｄ
ｕｓｉｎｇ　ＩＰＴＧ　ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｔｉｍｅ
３　讨论
植物感受外界干旱、高盐、激素、病害及体内细
胞发育等信号，通过一系列信号传递激发转录因子
与基因启动子区域的顺势作用元件结合后，激活
ＲＮＡ聚合酶转录复合物，从而启动基因的转录表
达，最后通过基因产物的作用对外界信号在生理生
化等方面做出适合的调节反应［７］。ＡＰ２／ＥＲＥＢＰ类
转录因子是植物所特有的响应逆境胁迫的一类转录
因子。近年来研究发现，响应干旱胁迫的ＤＲＥＢ类
转录因子在拟南芥、烟草、水稻［８］、小麦［９］、玉米［１０］、
大豆、高羊茅［１１］均有报道。但是，针对紫大麦草有
关ＤＲＥＢ转录因子的研究还未见报道。本研究以
采自我国西北地区盐碱化草场上的一份紫大麦草作
为材料，利用同源克隆的方法从中分离到一个
ＤＲＥＢ类转录因子基因，从核苷酸和推测的氨基酸
序列看该基因与大麦属植物（短芒大麦、栽培大麦）、
羊草具有较高的同源性程度（超过９０％），其中以与
短芒大麦的同源性程度最高。由于所用紫大麦草材
料为盐碱化土壤中生长的材料，加之所克隆基因亦
为盐胁迫下表达的产物，该基因可能在作物的耐盐性
改良中有一定作用，但其具体功能还有待深入研究。
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（编辑：梁　虹
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（上接第４０页）
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（编辑：宗淑萍）