全 文 ：黄兆峰，周欣欣，黄红娟，等． 田旋花 EPSPS基因启动子的克隆、序列分析及转化［J］． 杂草科学，2014，32(3):25 － 29．
田旋花 EPSPS基因启动子的克隆、序列分析及转化
黄兆峰1，周欣欣2，黄红娟1，魏守辉1，陈景超1，杨 龙1，陈金奕1，张朝贤1
(1．中国农业科学院植物保护研究所 /中国农业科学院杂草鼠害生物学与治理重点实验室，北京 100193;
2．农业部农药检定所，北京 100193)
摘要:根据已克隆的田旋花(Convolvulus arvensis L．)EPSPS基因 mＲNA序列设计引物，通过染色体步移技术
获得了 1 142 bp的 EPSPS － P启动子片段 (GenBank 登录号:KC107822)。对启动子序列分析显示，该片段富含
A/T碱基、TATA － box、CAAT － box及其他作用元件如 GATA － motif、TC － rich repeats、sp1 等。将该启动子与 GUS
报告基因连接以构建植物表达载体，利用农杆菌介导法获得转基因拟南芥;PCＲ和 GUS组织化学染色分析证明，
EPSPS － P已转化到拟南芥中。
关键词:田旋花;草甘膦;启动子;染色体步移技术
中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1003 － 935X(2014)03 － 0025 － 05
Cloning，Sequence Analysis and Transformation of EPSPS Gene
Promoter from Convolvulus arvensis L．
HUANG Zhao-feng1，ZHOU Xin-xin2，HUANG Hong-juan1，WEI Shou-hui1，CHEN Jing-chao1，
YANG Long1，CHEN Jin-yi1，ZHANG Chao-xian1
(1． Institute of Plant Protection /Key Laboratory of Weed and Ｒodent Biology and Management，Chinese Academy of Agricultural
Sciences，Beijing 100193，China;2． Institute for the Control of Agrochemicals，Ministry of Agriculture，Beijing 100125，China)
Abstract:Primers were designed according to the cloned EPSPS gene mＲNA of Convolvulus arvensis L． A 1 142 bp pro-
moter sequence named EPSPS － P (Genbank accession number:KC107822)was obtained by genome walking technolo-
gy． Sequence analysis of the promoter indicate that the fragment is rich in A /T base，TATA － box，CAAT － box and other
acting elements such as GATA － motifs，TC － rich repeats，and sp1． Connecting this promoter with GUS report gene al-
lowed construction of a plant expression vector． Agrobacterium tumefaciens － mediated transformation was used to trans-
form Arabidopsis thaliana． Analysis of PCＲ results and GUS histochemical dyeing proved that EPSPS － P was introduced
into A． thaliana．
Key words:Convolvulus arvensis L．;glyphosate;promoter;chromosome walking technology
收稿日期:2014 － 04 － 28
基金项目:公益性行业(农业)科研专项(编号:201303022)。
作者简介:黄兆峰(1983—)，男，山东即墨人，博士研究生，研究方向
为杂草抗药性。E － mail:huangzhaofeng666@ 163． com。
通信作者:张朝贤，博士，研究员。E － mail:cxzhang@ wssc． org． cn。
草甘膦是一种广谱灭生性、内吸传导型除草剂，
是国内外防除一年生及多年生杂草的主要药
剂［1 － 6］。草甘膦的作用机制是抑制植物体内 5 －烯
醇式丙酮酸 － 3 －磷酸合成酶(5 － enolpyruvylshiki-
mate － 3 － phosphate synthase，EPSPS)的活性，导致
莽草酸大量积累，并抑制芳香族氨基酸的生物合成，
进而扰乱正常的氮代谢［7］。以往研究表明:植物体
内 EPSPS 基因的过量表达可以有效提高其对草甘
膦的耐药性［8 － 11］。
田旋花(Convolvulus arvensis L．)属旋花科，是一
种多年生恶性杂草，其繁殖和再生能力极强，是华北
地区小麦、玉米、大豆等旱作物田的重要杂草［12］。
已被世界粮农组织列为世界上 18 种危害最严重的
杂草之一［13］。DeGennaro 等研究发现，无草甘膦用
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药史的田旋花对草甘膦具有天然的耐药性［14］;刘延
等发现，北京房山麦田田旋花对草甘膦具有较高的
耐药性，并首次克隆了田旋花 EPSPS基因(GenBank
登录号:EU698030)［12］;张猛比较了不同田旋花种
群的耐药性水平，提出草甘膦处理后的 EPSPS 基因
在表达时间和表达量上的差异是其对草甘膦产生耐
药性差异的一个重要因素［13］。
本试验利用染色体步移技术克隆了田旋花
EPSPS基因的启动子序列，并对其结构进行了分析。
用该启动子与 GUS报告基因连接转化农杆菌，花序
侵染法侵染拟南芥，获得转 EPSPS － P 启动子拟南
芥，为进一步了解田旋花 EPSPS 基因的表达调控机
制奠定了基础。
1 材料与方法
1． 1 试验材料
1． 1． 1 植物材料 田旋花种子采自北京市海淀区
上庄镇;拟南芥种子由笔者所在实验室保存。
1． 1． 2 质粒和菌株 大肠杆菌 DH5α 购自全式金
公司;质粒 pBI121、农杆菌 GV3101 由中国农业科学
院畜牧研究所晁跃辉博士惠赠。
1． 1． 3 试验试剂 Genome Walking Kit，T4 连接酶，
限制性内切酶 Hind Ⅲ、XbaⅠ，PMD19 － T 载体，均
购自 TaKaＲa公司。
1． 2 试验方法
1． 2． 1 DNA 提取 取田旋花新鲜叶片，用 CTAB
方法提取总 DNA，作为克隆田旋花 EPSPS基因启动
子的模板。产物浓度和纯度用紫外分光光度计检
测，同时在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测 DNA 的完整
性，以进一步确定 DNA的质量。
1． 2． 2 启动子克隆 根据 NCBI 上已发表的田旋
花 EPSPS 核苷酸序列设计 3 条特异引物:GW － 1:
5 － AGAGAGATTGCTGGGGCTCAAACGC － 3;
GW －2:5 － GAGGTTTAGAGAGATTGCTGGGGCT －
3;GW － 3:5 － CCCACCAAATTCAATTAAGAGGTTT －
3。引物由北京博迈德科技发展有限公司合成。
根据 Genome Walking Kit 的说明，采用 3 轮嵌
套式反应程序。在第 1 轮反应中，分别以 AP1、
AP2、AP3 为上游引物，GW － 1 为下游引物，反应程
序为:95 ℃预变性 1 min;94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、
72 ℃ 2 min，5 个循环;94 ℃ 30 s、25 ℃ 3 min、72 ℃
2 min;94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、94 ℃
30 s、65 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、44 ℃
1 min、72 ℃ 2 min，15 个循环;72 ℃延伸 10 min。
反应完成后，将上述 PCＲ 反应产物稀释 10 倍用作
第 2 轮 PCＲ 扩增的模板，第 2 轮 PCＲ 反应分别以
AP1、AP2、AP3 为上游引物，GW － 2 为下游引物，进
行 PCＲ扩增，反应程序为:94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min、
72 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s、65 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min、
94 ℃ 30 s、44 ℃ 1 min、72 ℃ 2 min，15 个循环;
72 ℃延伸 10 min。第 3 轮 PCＲ 反应分别以 AP1、
AP2、AP3 为上游引物，GW －3 为下游引物，反应程
序与第 2 轮反应一致。所得最终 PCＲ产物经 1%琼
脂糖 凝 胶 电 泳 检 测，通 过 胶 回 收 纯 化 后 与
pMD19 － T 连接，转化大肠杆菌后送北京博迈德科
技发展有限公司测序。
1． 2． 3 序列的生物信息学分析 将测序结果在
NCBI(http:/ /www． ncbi． nlm． nih． gov)网站上进行
BLAST 比对。同时在 PlantCAＲE (http:/ /bioinfor-
matics． psb． ugent． be /webtools /plantcare /html /)上进
行在线预测，分析存在的 TATA － box、CAAT － box
以及其他作用元件。
1． 2． 4 EPSPS － P 启动子和 GUS 基因植物表达载
体的构建 根据已得到的启动子序列设计 2 条特异
性引物:EPS － P － F:5 － AAGCTTAAACCTCTTAAT-
TGAAT －3(含 HindⅢ酶切位点)和 EPS － P － Ｒ:
5 － TCTAGAGGTATTTTAAAAGAGGC － 3(含 Xba
Ⅰ酶切位点)，将 PMD － EPSPS － P、pBI121 分别用
限制性内切酶 HindⅠ、XbaⅠ进行双酶切，回收启动
子片段，然后用 T4 酶连接至酶切后的 pBI121 中。
使 EPSPS － P 替换 pBI121 中的 35S 启动子，得到
EPSPS － P与载体中 GUS报告基因相连的双元表达
载体 pBI － EPSPS － P。采用氯化钙冻融法将 pBI －
EPSPS － P导入农杆菌后，用农杆菌转化拟南芥。
1． 2． 5 转基因拟南芥 GUS 活性检测［15］ 将转基
因拟南芥叶片用无菌水冲洗干净后放入 GUS 染液
中，抽真空至材料表面产生少许气泡并被染液完全淹
没为止，37 ℃过夜，用脱色液脱色后在体视显微镜下
观察染色结果。GUS染液配方:50 mmol /L磷酸钠缓
冲液(pH值 7． 0)，5 mmol /L铁氰化钾，5 mmol /L 亚
铁氰化钾，0． 1% Triton X － 100，1 mmol /L X － Gluc。
脱色液配方:乙醇 ∶ 乙酸 = 3 ∶ 1。
2 结果与分析
2． 1 EPSPS － P启动子片段的获得
利用染色体步移方法，通过 3 轮 PCＲ 扩增，得
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到了长约 1． 2 kb 的 DNA 片段，将得到的大片段回
收、测序，结果显示，该 DNA 片段长 1 145 bp，排除
与已知的田旋花 EPSPS基因序列重叠部分，实际获
得的启动子片段为 1 142 bp(图 1)，可以看出该序
列富含 A /T，是启动子序列的重要特征之一。
2． 2 启动子的生物信息学分析
通过 PlantCAＲE 对获得的启动子序列进行分
析，结果(图 2)表明，EPSPS － P 启动子序列中含有
典型的启动子基本元件，如 TATA － box 和 CAAT －
box，其中 TATA － box(ＲNA 聚合酶 II 结合位点)位
于起始密码子 ATG 上游 － 40 ～ － 36。TATA － box
近端的 1 个胁迫响应元件 TC － rich repeats 区位于
－ 692 ～ － 683;此外，还有与光效应有关的元件
Sp1、GATA － motif，以及生理节奏控制元件 circadi-
an，该 EPSPS 基因启动子 GenBank 的登录号
为 KC107822。
2． 3 植物表达载体的构建及转基因拟南芥的获得
将含有启动子的 pMD19 － T 质粒和 pBI121 的
载体分别用 HindⅢ、XbaⅠ双酶切，电泳图谱结果见
图 3 － A;回收启动子片段，然后用 T4 连接酶连接至
酶切后的pBI121上，经酶切鉴定(图3 － B)后转化
大肠杆菌 DH5α。菌落经 PCＲ 扩增，初步鉴定基因
已连接于载体上。挑选阳性菌落摇菌并提取质粒，
用 Hind Ⅲ和 XbaⅠ进行双酶切鉴定，得到的目的片
段大小与预测一致。经测序表明，得到的序列完全
正确，植物表达载体 pBl121 － EPSPS － P 构建成
功。用冻融法将构建的植物表达载体 PBl121 － EP-
SPS － P导入根癌农杆菌 GV3101 中，挑取阳性菌落
摇菌，提取质粒 DNA 并进行双酶切鉴定，得到 2 个
条带，且大小与预期一致，说明植物表达载体
pBl121 － EPSPS － P 已成功转入农杆菌中。用花序
浸染法侵染拟南芥花序，收获种子后在含 50 mg /L
卡那霉素的培养基上筛选抗性苗，挑取抗性苗移栽
至花盆中继续培养。
2． 4 转基因拟南芥鉴定与 GUS活性检测
为了检测 EPSPS － P 启动子是否转入拟南芥
中，分别提取转基因拟南芥叶片基因组 DNA，进行
PCＲ验证。琼脂糖凝胶电泳检测结果显示均呈阳
性，而野生型(WT)无特异性条带(图 4)。此外。对
WT和转基因拟南芥叶片进行 GUS 组织化学染色，
由图 5 可以看出，染色后 WT无色，而转基因拟南芥
呈蓝色。表明 EPSPS － P 已成功转化到拟南芥中，
并能启动 GUS报告基因的表达。
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3 讨论与结论
本研究采用染色体步移技术，通过 3 轮嵌套式
PCＲ，克隆到长度为 1 142 bp 的田旋花 EPSPS 基因
启动子片段，用启动子预测软件 PlantCAＲE 对该启
动子片段进行分析发现，该片段除了具有启动子保
守元件 TATA － box 及 CAAT － box 外，还有其他一
些作用元件，如 TC － rich repeats(胁迫响应元件)、
spl(光响应元件)、GATA － motif(光响应元件)、
CCAAT － motif(MYBHvl binding site)等。研究表
明，EPSPS主要分布在叶绿体中［16 － 17］，而叶绿体是
光合作用的主要场所。在对陆地棉的研究中发现，
EPSPS基因在其成熟叶片中表达量最高［18］。通过
对启动子分析发现，田旋花 EPSPS 启动子含有 2 个
光响应原件，这与 EPSPS 的分布和表达特征相
符合。
很多化学诱导剂对植物的影响都是通过直接或
间接地作用于植物的启动子而调控植物基因的表
达，从而影响植物的生长、发育、生殖，以及植物对内
外环境的反应［19］。以往的研究表明，田旋花在喷施
草甘膦后，EPSPS基因在转录水平明显提高［14］。因
此笔者从田旋花 EPSPS基因启动子入手，克隆并通
过农杆菌介导法得到了转 EPSPS － P 拟南芥，为进
一步探究田旋花耐药性机制，以及 EPSPS 基因的表
达调控提供了试验依据。
启动子驱动基因表达需要多个顺式元件，这些
元件的种类、数量及彼此之间的顺序与距离，都可能
影响基因的转录与否或转录水平［20］。目前，缺失分
析法是研究启动子功能的一种重要的方法。通过
5缺失法获得不同长度的启动子片段，分别与 GUS
报告基因融合构建植物表达载体并转入拟南芥，对
田旋花 EPSPS基因启动子的诱导活性进行研究，从
而明确其在草甘膦等处理条件下的调控元件，将是
下一步的重点研究内容。
参考文献:
［1］彭学岗，金 涛，张景远． 除草剂面临的挑战及草甘膦复配的意
义［J］． 杂草科学，2013，31(1):5 － 9．
［2］巩元勇，郭书巧，束红梅，等． 抗草甘膦杂草的抗性机理研究进展
［J］． 杂草科学，2012，30(3):9 － 13．
［3］Powles S B，Yu Q． Evolution in action:plants resistant to herbicides
［J］． The Annual Ｒeview of Plant Biology，2010，61:317 － 347．
［4］李 君，宋青春，陈秀敏． 农药草甘膦对刺参成参的急性毒性
［J］． 江苏农业科学，2013，41(4):231 － 232．
［5］张朝贤，房 锋，张 猛，等． 草甘膦应用现状及杂草抗性研究与
治理对策［J］． 中国农药，2011(8):22 － 26．
［6］魏松红，张景远，李 斐，等． 应用组织培养法筛选抗草甘膦水稻
—82— 杂草科学 2014 年第 32 卷第 3 期
愈伤组织［J］． 江苏农业科学，2012，40(11):37 － 39．
［7］Herrmann K M，Weaver L M． The shikimate pathway［J］． Annual
Ｒeview of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1999，50:
473 － 503．
［8］Wang H Y，Li Y F，Xie L X，et al． Expression of a bacterial aroA mu-
tant，aroA － M1，encoding 5 － enolpyruvylshikimate － 3 － phosphate
synthase for the production of glyphosate － resistant tobacco plants
［J］． Journal of Plant Ｒesearch，2003，116(6) :455 － 460．
［9］Ye G N，Hajdukiewicz P T J，Broyles D，et al． Plastid － expressed
5 － enolpyruvylshikimate － 3 － phosphate synthase genes provide high
level glyphosate tolerance in tobacco［J］． The Plant Journal，2001，25
(3) :261 － 270．
［10］Gaines T A，Zhang W L，Wang D F，et al． Gene amplification con-
fers glyphosate resistance in Amaranthus palmeri［J］． Proceedings
of the National Academy of Sciences of the United States of Ameri-
ca，2010，107(3) :1029 － 1034．
［11］Powles S B． Gene amplification delivers glyphosate － resistant weed
evolution［J］． PNAS，2010，107(3) :955 － 956．
［12］刘 延，张朝贤，黄红娟，等． 草甘膦对田旋花和打碗花体内莽
草酸含量的影响［J］． 杂草科学，2008(2):10 － 12．
［13］张 猛．田旋花对草甘膦的耐药性机理研究［D］． 北京:中国农
业科学院植物保护研究所，2011．
［14］DeGennaro F P，Weller S C． Differential susceptibility of field bind-
weed (Convolvulus arvensis)biotypes to glyphosate［J］． Weed Sci-
ence，1984，32(4):472 － 476．
［15］Jefferson Ｒ A． The GUS reporter gene system［J］． Nature，1989，
342(6251) :837 － 838．
［16］Gasser C S，Winter J A，Hironaka C M，et al． Structure，expression，
and evolution of the 5 － enolpyruvylshikimate － 3 － phosphate syn-
thase genes of petunia and tomato［J］． The Journal of Biological
Chemistry，1988，263:4280 － 4287．
［17］Della － Cioppa G，Bauer S C，Klein B K，et al． Translocation of the
precursor of 5 － enolpyruvylshikimate － 3 － phosphate synthase into
chloroplasts of higher plants in vitro［J］． Proc Natl Acad Sci USA
1986，83(18) :6873 － 6877．
［18］童旭宏，吴玉香，祝水金． 陆地棉 EPSPS 基因的克隆及其组织
特异性表达分析［J］． 棉花学报，2009，21(4):259 － 264．
［19］尉万聪． 草甘膦诱导高表达基因及启动子的克隆和功能分析
［D］． 北京:中国农业科学院，2005．
［20］吴智丹，王 光，郭 玲，等． 水稻启动子 OsN1p 的克隆与功能
分析［J］． 南京农业大学学报，2012，35(2):10 － 14．
—92—杂草科学 2014 年第 32 卷第 3 期