全 文 ：·生物技术· 北方园艺２０１６（１２）：９６～１００
第一作者简介：夏江宏（１９９０－），男，重庆垫江人，硕士研究生，研究
方向为果树学。Ｅ－ｍａｉｌ：９３９４１４０９８＠ｑｑ．ｃｏｍ．
责任作者：曾斌（１９７０－），男，湖北松滋人，博士，副教授，硕士生导
师，现主要从事果树种质资源及生物技术的教学与科研等工作。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｂｘｎｄ＠１６３．ｃｏｍ．
基金项目：国家自然科学基金资助项目（３１２６０４６５）；国家林业公益
性行业科研专项资助项目（２０１３０４７０１－１）；新疆维吾尔自治区科技
计划资助项目（２０１１３０１０２－１－５）；新疆维吾尔自治区果树学重点学
科资助项目（２０１００７）。
收稿日期：２０１５－１２－１６
ＤＯＩ：１０．１１９３７／ｂｆｙｙ．２０１６１２０２４
新疆野扁桃自交不亲和相关基因
ＰｅｔＳＳＫ１转“梦幻”矮牵牛的研究
夏 江 宏１，曾 斌１，王 建 友２，李 伟 阳１，田 嘉１，李 疆１
（１．新疆农业大学 林学与园艺学院，新疆农业大学果树学新疆特色果树研究中心，新疆 乌鲁木齐８３００５２；
２．新疆林业科学院推广站，新疆 乌鲁木齐８３００６３）
摘 要：以新疆野扁桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｅｎｅｌａ）花粉为试材，构建其自交不亲和性相关基因ＰｅｔＳＳＫ１的
植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１，采用根癌农杆菌介导法，将该基因导入矮牵牛，并研究了不
同种类及浓度抗生素对矮牵牛再生的影响。结果表明：该试验成功获得了转化新疆野扁桃自交不亲
和相关基因ＰｅｔＳＳＫ１的矮牵牛植株，并筛选出矮牵牛的卡那霉素（Ｋａｎ）和头孢霉素（Ｃｅｆ）的敏感浓度
分别为２５、３００ｍｇ·Ｌ－１，并进一步通过ＰＣＲ分子检测确认其为转基因阳性植株。
关键词：野扁桃；ＰｅｔＳＳＫ１；植物表达载体；根癌农杆菌介导；矮牵牛
中图分类号：Ｓ ６８１．６０３．６ 文献标识码：Ａ 文章编号：１００１－０００９（２０１６）１１－００９６－０５
野扁桃（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｅｎｅｌｌａ）属蔷薇科李亚科桃属扁桃
亚属植物，也称野巴旦杏，属新生代第３纪遗留物种，
是世界上古老的野生果树之一，现今只有哈萨克斯坦
和中国新疆塔城和阿勒泰地区有少量分布［１］。而随着
过度放牧，自然环境的恶化等因素对野扁桃的生存造
成了很大威胁［２］。通过对张一婧等［３］发现的一种新基
因ＳＫＰ１－ｌｉｋｅ进行同源克隆，获得一个新的基因
ＰｅｔＳＳＫ１，该试验拟验证野扁桃ＰｅｔＳＳＫ１基因是否与野
扁桃的自交不亲和相关。
矮牵牛（Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ Ｖｉｌｍ）属配子体自交不亲
和多年生草本植物，又名碧冬茄，常作一二年生栽培。
株高２０～４５ｃｍ，茎匍地生长，被有粘质柔毛，叶质柔软，
Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｐｌａｎｔ Ｓｙｒｉｎｇａｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ
ＣＨＥＮＧ Ｍｉｎｇ１，ＬＩ Ｈｏｕｈｕａ２，ＨＥ Ｚｉｓｅｎ１，ＪＩＡＮＧ Ｚａｉｍｉｎ３，ＣＡＩ Ｊｉｎｇ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００；２．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ａｎｄ
Ａｒｔｓ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００；３．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ ７１２１００）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｂｕｄｓ ａｎｄ ｓｅｅｄｓ ｏｆ ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ ｐｌａｎｔ Ｓｙｒｉｎｇａｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ
ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｓｕｃｒｏｓｅ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅ ｏｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｓｅｅｄｓ，ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ
ｏｆ ｂａｓａｌ ｍｅｄｉａ ａｎｄ ｈｏｒｍｏｎｅｓ ｏｎ ｓｈｏｏｔｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｂｙ ｐｌａｎｔ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｔｈｏｄ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ，ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏｖｉｄｅ
ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ，ｇｅｒｍｐｌａｓｍ ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｌｏｉｔａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｙｒｉｎｇａｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ
ｔｈａｔ ｔｈｅ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ｓｈｏｏｔｓ．Ｔｈｅ ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ ｄｉｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ７５％ｅｔｈａｎｏｌ ｆｏｒ ３０ｓｅｃｏｎｄｓ，０．１％ ｍｅｒｃｕｒｉｃ
ｃｈｌｏｒｉｄｅ ｆｏｒ ７ｍｉｎｕｔｅｓ，ｔｈｅ ｂｅｓｔ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｍｅｄｉｕｍ ｗａｓ ＭＳ＋５．０ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ＋０．０１ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ；ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｉｔｉａｌ，
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｒｏｏｔｉｎｇ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｅｅｄ ｗａｓ ＭＳ＋２０ｇ·Ｌ－１ ｓｕｃｒｏｓｅ＋３．０ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ＋０．１０ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ，ＭＳ＋
７．０ｍｇ·Ｌ－１ ６－ＢＡ＋０．０５ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ ａｎｄ ＷＰＭ＋２．０ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｓｙｒｉｎｇａｐｉｎｎａｔｉｆｏｌｉａ；ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ；ｂｕｄ；ｓｅｅｄ
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北方园艺２０１６（１２）：９６～１００ ·生物技术·
卵形，近无柄，全缘，互生，上部叶对生；花单生，呈漏斗
状，重瓣花球形，花白、紫或各种红色，并镶有它色边，花
期４月至降霜；蒴果，种子细小。主要分布于南美洲，因
颜色艳丽、花期长，适应性强，而颇受人们喜爱。又因其
生长周期短、易成活，且易于农杆菌的导入，而成为研究
植物基因工程的优选材料［４－５］，同时也是最早被应用于
基因工程育种的植物之一。
现构建新疆野扁桃自交不亲和性相关基因ＰｅｔＳＳＫ１
的植物表达载体，通过根癌农杆菌介导法，将其导入矮
牵牛，并检测转基因矮牵牛中是否具有自交亲和植株。
以期为进一步开展自交亲和性分子辅助育种提供参考
依据。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
供试材料：新疆野扁桃的花粉取自新疆维吾尔自治
区裕民县野扁桃自然保护区用于提取ＲＮＡ；ＥＨＡ１０５根
癌农杆菌株（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）、ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３
植物双元表达载体购自上海生工生物公司；矮牵牛品种
“梦幻”购自大连保尔世纪园艺有限公司。
供试试剂：ＥＤＴＡ－Ｎａ２、琼脂粉、胰蛋白胨、牛肉浸
粉、葡萄糖等药品均为分析纯，购自北京鼎国昌盛生物
公司；卡那霉素（Ｋａｎ）、头孢霉素（Ｃｅｆ）、利福平（Ｒｉｆ）、
ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、Ｔｒａｎｓ Ｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ－
Ｓｔｒａｎｄｃ ＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｕｐｅｒ Ｍｉｘ购自北京全式金生物
公司；大肠杆菌感受态细胞（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）ＤＨ５α、琼脂
糖凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒购自北京鼎国昌盛
生物公司；ｐＭＤ１９－Ｔ载体购自中国大连 ＴａＲａＫａ公司；
ＰｓｔⅠ、ＢａｍＨⅠ等限制性内切酶购自ＮＥＢ公司；琼脂糖凝
胶回收试剂盒、ＲＮＡ提取试剂盒均购自天根生化科技
有限公司。
供试仪器：电泳仪（ＤＹＹ－７Ｃ）、霉菌培养箱（ＭＪＸ－
１６０Ｂ－Ｚ）、超净工作台（ＳＷ－ＣＪ－ＺＦ）、ＰＣＲ仪、高速低温离
心机、立式压力蒸汽灭菌器（（ＬＤＺＸ－５ＯＫＢ Ｓ）、电了天平
（ＡＬ２０４－１Ｃ）、电热鼓风干燥箱（ＤＨＧ－９１４０Ａ）、全温摇床
（ＨＺＱ－Ｂ）、分光光度计、水浴锅。
１．２ 试验方法
２０１３—２０１４年在新疆农业大学林学与园艺学院
特色果树研究中心进行基因的克隆及分子鉴定，２０１５
年在新疆维吾尔自治区乌鲁木齐县农牧局技术管理站
进行矮牵牛再生体系的建立以及转基因等相关试验。
１．２．１ 总ＲＮＡ的提取及ｃＤＮＡ合成 将野扁桃花粉
在液氮中研磨至粉状用ＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（Ｔｉａｎｇｅｎ
公司）提取其总ＲＮＡ，用１％的琼脂糖凝胶电泳检测ＲＮＡ
的完整性。反转录反应参照ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ
ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ＳｕｐｅｒＭｉｘ（Ｔｒａｎｓｇｅｎ公司）合成第１链
ｃＤＮＡ并－２０℃保存。
１．２．２ ＰｅｔＳＳＫ１基因的克隆 以ｃＤＮＡ为模板，用上
游引物ＳＳＫ１Ｆ（ＡＡＴＣＣＣＴＣＴＣＡＴＡＡＴＣＴＣＣＡＣ ）和下
游引物ＳＳＫ１Ｒ（ＧＣＴＣＡＧＴＣＣＴＣＡＴＣＡＡＣＴＣＣ）进
行ＰＣＲ扩增，反应体系为５０μＬ：ｄｄＨ２Ｏ ３７μＬ，ＤＮＡ
１μＬ，１０×ｂｕｆｅｒ ５μＬ，引物（１０μｍｏｌ·Ｌ－１）各１μＬ，
ｄＮＴＰ（０．２ｍｍｏｌ·Ｌ－１）４μＬ，Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ）
１μＬ。ＰＣＲ扩增程序为９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性
３０ｓ，５５℃复性３０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ，反应３５个循环；
７２℃终延伸１０ｍｉｎ，４℃保存，ＰＣＲ产物用２％的凝胶进
行电泳检测。
１．２．３ 克隆质粒ｐＭＤ１９－ＰｅｔＳＳＫ１的构建及鉴定 根
据天根生物公司的胶回收试剂盒对１．２．２中的试验产物
进行胶回收。将胶回收产物连接到ｐＭＤ１９－Ｔ载体并进
行转化，待平板中长出单菌落后，在无菌条件下挑取白
色单菌落接种到５ｍＬ含５０ｍｇ·Ｌ－１氨苄青霉素的ＬＢ
液体培养基中，３７℃振荡培养（２２０ｒ·ｍｉｎ－１）过夜。按
Ｇｅｎｖｉｅｗ质粒提取试剂盒说明进行质粒提取，采用
ＥｃｏＲⅠ和ＨｉｎｄⅢ进行双酶切验证，双酶切反应体系为
ＥｃｏＲⅠ０．５μＬ，ＨｉｎｄⅢ０．５μＬ，重组质粒５μＬ，ｂｕｆｅｒ
２μＬ，ｄｄＨ２Ｏ １２μＬ，３７℃反应３ｈ，将酶切正确的质粒进
行测序，命名为ｐＭＤ１９－ＰｅｔＳＳＫ１。
１．２．４ 双元表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１的构建
及鉴定 将阳性ｐＭＤ１９－ＰｅｔＳＳＫ１质粒和ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３
载体分别用ＰｓｔＩ和ＢａｍＨ Ｉ进行双酶切，利用琼脂糖凝
胶回收试剂盒回收目的片段，利用 Ｔ４ＤＮＡ连接酶
１６℃连接３０ｍｉｎ，以连接体系转化Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＨ５α，将转化
产物涂布于含有５０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素（Ｋａｎ）的ＬＢ固体
培养基中，３７ ℃ 过夜培 养，挑 取 单 菌 落 在 含 有
５０ｍｇ·Ｌ－１卡那霉素（Ｋａｎ）的ＬＢ液体培养基中培养过
夜，提取质粒，利用双酶切鉴定，将阳性的双元表达载体
测序，命名为ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１。
１．３ 农杆菌介导遗传转化体系的建立
１．３．１ 根癌农杆菌的活化与培养 采用冻融法［６－８］将
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１重组质粒加入到ＥＨＡ１０５根癌
农杆菌感受态细胞中，混匀后，冰浴３０ｍｉｎ，迅速放入液
氮５ｍｉｎ，取出后３７℃水浴２ｍｉｎ，加１ｍＬ不含抗生素
的ＹＥＢ液体培养基，２８℃，１５０ｒ·ｍｉｎ－１激活１ｈ，取出
后涂在含５０ｍｇ·Ｌ－１ Ｋａｎ、５０ｍｇ·Ｌ－１ Ｒｉｆ的ＹＥＢ平
板上，在霉菌培养箱中２８℃，培养２ｄ。然后挑取单菌
落在上述ＹＥＢ液体培养基中２８℃，２５０ｒ·ｍｉｎ－１过夜培
养，然后取其中１ｍＬ接种于５０ｍＬ上述ＹＥＢ液体培养
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·生物技术· 北方园艺２０１６（１２）：９６～１００
基中进行扩繁，至菌液ＯＤ６００为０．８时，５ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离
心１０ｍｉｎ，用ＹＥＢ液体培养基重悬至ＯＤ６００为０．６时
备用。
１．３．２ 转化外植体的获得 称取０．０１７ ３ｇ矮牵牛种子
约１００粒，将矮牵牛种子置于１．５ｍＬ离心管中，用无菌
水浸泡过夜，在无菌条件下，以７５％酒精灭菌３０ｓ，再用
次氯酸钠处理１０ｍｉｎ，最后用无菌水冲洗５～６次，每次
１ｍｉｎ，然后接种于１／２ＭＳ＋ＩＢＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１培养基
（ＭＳ１）［９－１０］，置于光照培养室内，每天光照１０ｈ（温度
２５℃，光照强度５ ０００ｌｘ）。选取４０ｄ的无菌矮牵牛
叶片，用解剖刀除去主脉和叶片的边缘部分，剪成
０．２５ｃｍ２大小作为外植体，接种至培养基 ＭＳ＋６－ＢＡ
１．０ｍｇ·Ｌ－１＋ＮＡＡ ０．２ｍｇ·Ｌ－１中（ＭＳ２）。
１．３．３ 抗生素敏感试验 参考孙瑶等［１０］、李颖等［１１］的
方法在最佳芽诱导分化培养基中加入不同配比的卡那
霉素（Ｋａｎ）以及头孢（Ｃｅｆ），接种外植体，观察培养过程
中出现愈伤的时间以及出愈率，确定最佳抗生素浓度。
出愈率（％）＝愈伤数／外植体数×１００。
１．３．４ 矮牵牛的遗传转化 通过常规方法［１２］获得侵染
用农杆菌菌液（ＯＤ６００＝０．６），使用改良叶盘法侵染预培
养后的试管苗矮牵牛幼叶，预培养时间２ｄ。侵染方法：
将预培养的外植体置入ＯＤ６００为０．６的农杆菌菌液中轻
摇１０ｍｉｎ，共培养２ｄ，然后再将外植体转接到筛选培养
基中筛选，将获得的诱导芽进行继代然后生根以及
定植。
１．４ 抗性苗的ＰＣＲ扩增检测
采用改良ＣＴＡＢ法提取［１３－１５］转化成功的矮牵牛阳
性植株和未经遗传转化的再生型植株的ｇＤＮＡ，以此为
模板，以１．２．１中的引物进行ＰＣＲ扩增。扩增程序为
９４℃预变性５ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃１ｍｉｎ，３５
个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。ＰＣＲ产物用２％琼
脂糖凝胶进行电泳检测。
２ 结果与分析
２．１ ＰｅｔＳＳＫ１基因的克隆及双元表达载体ｐＣＡＭ－
ＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１的双酶切鉴定
由图１可知，目的基因片段大小为６０２ｂｐ，测序结
果与野扁桃ＰｅｔＳＳＫ１基因一致，符合后续试验要求。对
转化得到的双元表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１进
行双酶切鉴定（图２），并通过测序证实该质粒含有目的
基因，符合后续试验要求。
２．２ 不同浓度Ｋａｎ对矮牵牛愈伤诱导率的影响
在不同Ｋａｎ浓度的ＭＳ２培养基上接种外植体３０ｄ
后，对分化芽进行统计。由表１可知，Ｋａｎ对矮牵牛诱导
芽的生长及分化有明显的抑制作用。随着Ｋａｎ浓度的
注：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１号和２号泳道为目的基因。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１ａｎｄ ２ｗｅｒｅ ＰｅｔＳＳＫ１ｇｅｎｅ．
图１ ＰｅｔＳＳＫ１基因的ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．１ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＰｅｔＳＳＫ１ｇｅｎｅ
注：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１～２，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１用ＰｓｔⅠ
和ＢａｍＨⅠ进行双酶切。
Ｎｏｔｅ：Ｍ，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１－２，ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１ｗａｓ
ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｗｉｔｈ ＰｓｔⅠａｎｄ ＢａｍＨⅠ．
图２ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１的双酶切鉴定
Ｆｉｇ．２ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－ＰｅｔＳＳＫ１ｂｙ
ｄｏｕｂｌｅ ｅｎｚｙｍｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
升高，愈伤组织诱导率逐渐下降。在未添加Ｋａｎ的培养
基中，外植体可以正常诱导出愈伤组织，诱导率高达
９５％以上，且生长情况良好；当Ｋａｎ浓度为２０ｍｇ·Ｌ－１
时，外植体诱导愈伤能力降低，诱导率仅为１２．５％，当
Ｋａｎ浓度为２５ｍｇ·Ｌ－１时，外植体愈伤生长缓慢，且逐
渐发白并死亡，此浓度为矮牵牛愈伤诱导的临界值。
２．３ 不同浓度Ｃｅｆ对侵染后的矮牵牛外植体的影响
在ＭＳ２培养基中加入不同浓度的Ｃｅｆ，培养１５ｄ后
观察反菌率。由表２可以看出，高浓度Ｃｅｆ对根癌农杆菌
的生长有抑制作用。随着Ｃｅｆ浓度的升高，侵染后的外植
体反菌率逐渐降低。当Ｃｅｆ浓度为０ｍｇ·Ｌ－１时，侵染后的
外植体反菌率高达１００％，当Ｃｅｆ浓度增加到２００ｍｇ·Ｌ－１
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北方园艺２０１６（１２）：９６～１００ ·生物技术·
时，反菌率降低；当浓度增加到３００ ｍｇ·Ｌ－１和
４００ｍｇ·Ｌ－１时，侵染后的外植体可以正常生长并分化
出不定芽。所以３００ｍｇ·Ｌ－１的Ｃｅｆ浓度为矮牵牛再生
的最适宜浓度。
表１ 不同Ｋａｎ浓度对矮牵牛愈伤再生的影响
Ｔａｂｌｅ １ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｔｕｎｉａｃａｌｕｓ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｋａｎ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎ／（ｍｇ·Ｌ－１）
外植体数
Ｎｏ．ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
出愈率
Ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ／％
愈伤再生情况
Ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｃａｌｕｓ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
１ ０ ２４ １００．０ 愈伤生长良好，芽分化数多
２ ５ ２４ ９０．０ 愈伤生长良好，芽分化数多
３ １０ ２４ ５５．６ 愈伤正常生长，部分外植体无分化芽
４ １５ ２４ ４１．６ 愈伤生长，部分外植体无分化芽
５ ２０ ２４ １２．５ 少量愈伤生长，外植体局部发白，有少量分化芽
６ ２５ ２４ ０．０ 外植体整体变白，切口局部变厚，无分化芽并逐渐死亡
表２ 不同Ｃｅｆ浓度对矮牵牛再生的影响
Ｔａｂｌｅ ２ Ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｆ ｏｎ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｔｕｎｉａ ｈｙｂｒｉｄａ
处理
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
Ｃｅｆ浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｆ／（ｍｇ·Ｌ－１）
外植体数
Ｎｏ．ｏｆ ｃｏｔｙｌｅｄｏｎ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ
反菌率
Ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｒａｔｅ／％
外植体生长情况
Ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｌａｎｔ ｇｒｏｗｔｈ
１ ０ ２４ １００．０ 全部反菌
２ １００ ２４ ５０．０ 有愈伤无不定芽
３ ２００ ２４ ２０．８ 有愈伤无不定芽
４ ３００ ２４ ０．０ 愈伤生长良好，并且有４个外植体分化出不定芽
５ ４００ ２４ ０．０ 愈伤生长良好，有１个外植体分化出不定芽
２．４ 矮牵牛转化苗的ＰＣＲ检测
由图３可知，转化成功的阳性植株能扩增出与目的
基因大小接近的条带，介于５００～７５０ｂｐ，而未转化的植
株则不能扩增出条带。将ＰＣＲ扩增产物回收、测序，得
到结果与目的基因一致。
注：Ｍ１，Ｔｒａｎｓ １５ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１、２为阴性对照；３、４为阳性对照；５～１２为矮牵牛抗性苗。
Ｎｏｔｅ：Ｍ１，Ｔｒａｎｓ １５ｋｂ ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ，Ｍ２，ＤＬ ２ ０００ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ；１，２，ｎｏｎ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ；３，４，ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ；５－１２，ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ．
图３ 转基因苗的ＰＣＲ检测
Ｆｉｇ．３ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔｓ
３ 讨论与结论
自交不亲和性是指具有完全花并可以形成正常雌、
雄配子，但自花授粉不能正常繁育后代的一种自交不育
性［１６］。主要分为两大类：孢子体自交不亲和性［１７］，花粉
亲和与否的表现型由产生花粉的二倍体亲本（即孢子
体）Ｓ基因型决定，如甘蓝、白菜型油菜、甜菜、白菜和甘
薯等十字花科植物；配子体自交不亲和性［１８］，花粉亲和
与否的表现型由单倍体花粉（即配子体）自身的Ｓ基因
型决定，分布最为广泛的是一种称为Ｓ核酸酶类的自交
不亲和性，主要存在于茄科、蔷薇科、车前科等植物中。
２０世纪末，ＣＬＡＲＫＥ实验室在花烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
ａｌａｔａ）的花柱中分离到一种与特定单倍型共分离的糖蛋
白［１９］。通过测序和随后的ｃＤＮＡ克隆首次得到了茄科
植物中参与自交不亲和反应的花柱Ｓ－基因［１９］－Ｓ－Ｒｎａｓｅ。
２１世纪初，ＬＡＩ等［２０］利用已构建的金鱼草细菌人工染
色体（ＢＡＣ）文库筛选得到了１个含有Ｓ２－Ｒｎａｓｅ的
６３．７ｋｂ的ＢＡＣ克隆，并在其中距Ｓ２－Ｒｎａｓｅ ９ｋｂ的位置
发现了１个新的编码带有Ｆ－ｂｏｘ结构域的蛋白基因，命
名为ＡｈＳＬＦ－Ｓ２（Ａｎｔｉｒｒｈｉｎｕｍ ｈｉｓｐａｎｉｃｕｍ Ｓ－ｌｏｃｕｓ Ｆ－ｂｏｘ
Ｓ２）。此为科学家首次克隆的自交不亲和花粉Ｓ决定因
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·生物技术· 北方园艺２０１６（１２）：９６～１００
子［２０］。２００６年ＨＵＡＮＧ等［２１］以酵母双杂交的方法从
ｃＤＮＡ文库中筛到了ＡｈＳＳＫｌ。ＳＳＫ１（ＳＬＦ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ
ＳＫＰ１－ｌｉｋｅ１）是位于Ｓ－位点外的一类新的植物自交不亲和
相关基因。其后人们从苹果、梨、甜樱桃等植物中成功
克隆出了相应的ＳＳＫ１基因。
该试验从新疆野扁桃克隆得到的自交不亲和相
关基因ＰｅｔＳＳＫ１具有完整的开放阅读框，与Ｐｒｕｎｕｓ
ａｖｉｕｍ的ＳＳＫ１（ＪＱ３２２６４６）基因高度同源，相似度高达
９８％。为了验证ＰｅｔＳＳＫ１基因的功能，该试验已经成功
构建ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３双元表达载体，并通过根癌农杆菌
介导矮牵牛，成功进行了遗传转化。而该基因在转化植
株中是否行使功能，仍需后续试验进一步验证。
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ＰｅｔＳＳＫ１ Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎｇ Ｉｎｔｏ Ｐｅｔｕｎｉａ‘Ｄｒｅａｍ’
ＸＩＡ Ｊｉａｎｇｈｏｎｇ１，ＺＥＮＧ Ｂｉｎ１，ＷＡＮＧ Ｊｉａｎｙｏｕ２，ＬＩ Ｗｅｉｙａｎｇ１，ＴＩＡＮ Ｊｉａ１，ＬＩ Ｊｉａｎｇ１
（１．Ｃｏｌａｇｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ／Ｔｈｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ Ｆｒｕｉｔ Ｔｒｅｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ
８３００５２；２．Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｓｔａｔｉｏｎ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕｒｕｍｑｉ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ ８３００６３）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｐｏｌｅｎ ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｗｉｌｄ ａｌｍｏｎｄ（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｅｎｅｌａ）ａｓ ｍａｔｅｒｉａｌ，ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３－
ＰｅｔＳＳＫ１ｗｉｔｈ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ＰｅｔＳＳＫ１ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｔｈｅｎ ｉｔ ｗａｓ ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ ｉｎｔｏ Ｐｅｔｕｎｉａ ｍｅｄｉａｔｅｄ
ｂｙ Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ，ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｋｉｎｄｓ ａｎｄ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ ｏｎ Ｐｅｔｕｎｉａｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ Ｐｅｔｕｎｉａｔａｋｉｎｇ ｓｅｌｆ－ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅ ＰｅｔＳＳＫ１ｏｆ Ｘｉｎｊｉａｎｇ ｗｉｌｄ
ａｌｍｏｎｄ ｗａｓ ｇｏｔｔｅｎ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｋａｎ ａｎｄ Ｃｅｆ ｗｅｒｅ ２５ｍｇ·Ｌ－１ ａｎｄ ３００ｍｇ·Ｌ－１，
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ａｎｄ ｔｈｅ Ｐｅｔｕｎｉａ ｗｅｒｅ ｆｕｒｔｈｅｒ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ａｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｗｉｌｄ ａｌｍｏｎｄ（Ｐｒｕｎｕｓ ｔｅｎｅｌａ）；ＰｅｔＳＳＫ１；ｐｌａｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ；Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ；Ｐｅｔｕｎｉａｈｙｂｒｉｄａ
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