全 文 ：果树学报 2016，33（8）：905-916
Journal of Fruit Science
DOI:10.13925/j.cnki.gsxb.20150520
2个野扁桃自交不亲和S-RNase
基因全长的克隆与序列分析
关 鹏 2，曾 斌 1*，李 疆 1，罗淑萍 2，王建友 3，李伟阳 1，田 嘉 1，李 鹏 1
（1新疆农业大学林学与园艺学院·新疆农业大学果树学新疆特色果树研究中心，乌鲁木齐 830052；
2新疆农业大学农学院，乌鲁木齐 830052；3中国林业科学院新疆分院，乌鲁木齐 830000）
摘 要：【目的】克隆新疆野扁桃（Amygdalus ledebouriana Schlecht.）自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因 S-
RNase全长序列，为自交不亲和性的分子调控奠定基础。【方法】以新疆野扁桃花柱为试材，利用RT-PCR和RACE技术
克隆 S-RNase基因全长，采用BLAST和ORF Finder对核酸序列进行分析，利用CDD、ProtParam、Tmpred、SignalP、Tar⁃
getP、SOPMA、DANMAN、MEGA6和ProtFun对推导的氨基酸序列进行分析。【结果】克隆到PtS16-RNase基因和PtS17-
RNase基因，2者均属于RNase T2基因家族，与其他多种植物的 S-RNase基因的序列相似度为 83%~98%，序列均具有
S-RNas蛋白典型结构。PtS16-RNase基因ORF长 690 bp，编码 229个氨基酸，PtS17-RNase基因ORF长 678 bp，编码
225个氨基酸。预测2个S-RNase蛋白均为亲水性、不稳定的分泌蛋白，二级结构均以α-螺旋、延伸链和无规卷曲为
主，在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一致性，可能的主要功能为水解酶和激素。【结论】获得2个新疆野扁桃
自交不亲和性花柱特异性决定因子编码基因S-RNase全长序列。
关键词：野扁桃；自交不亲和性；S-RNase基因；生物信息学；RACE
中图分类号：S662.9 文献标志码：A 文章编号：1009-9980（2016）08-0905-12
收稿日期：2015-12-09 接受日期：2016-03-20
基金项目：国家自然科学基金(31260465)；国家林业公益性行业科研专项(201304701-1，201304701-5)；新疆维吾尔自治区科技计划项目
（201130102-1-5）；新疆维吾尔自治区果树学重点学科(201007)
作者简介：关鹏，男，在读硕士研究生。Tel：13619910249，E-mail：peng19840205@163.com
*通信作者Author for correspondence. Tel：18963861700，E-mail：zbxnd@163.com
Cloning and sequence analysis of 2 full-length S-RNase genes in Amygda⁃
lus ledebouriana Schlecht.
GUAN Peng2, ZENG Bin1*, LI Jiang1, LUO Shuping2, WANG Jianyou3, LI Weiyang1, TIAN Jia1, LI Peng1
（1College of Forestry and Horticulture · Research Center for Xinjiang Characteristic Fruit Tree, Xinjiang Agricultural University, Urumqi
830052, Xinjiang, China; 2College of Agronomy, Xinjiang Agricultural University, Urumqi 830052, Xinjiang, China; 3Xinjiang Branch of Chi⁃
na Academy of Forestry Sciences, Urumqi 830000, Xinjiang, China)
Abstract:【Objective】Two full-length sequences of S-RNase genes encoding pistil determinant factors of
self-incompatibility were cloned, and bioinformatics analyses of the sequences and their decuced amino
acid sequences were processed in order to facilitate molecular regulation of self-incompatibility in wild al⁃
mond (Amygdalus ledebouriana Schlecht.).【Methods】The full- length sequences of S-RNase genes were
cloned by RT-PCR and RACE techniques from the pistils of the wild almond . Regions of local similarity
between sequences of the cloned S-RNase genes and those accessioned in GenBank were analysed by the
Basic Local Alignment Search Tool (BLAST).Open reading frames of sequences of the cloned S-RNase
genes were analysed by the ORF Finder (Open Reading Frame Finder). Conserved domains of the deduced
amino acid sequences were searched by the Conserved Domain Database (CDD). Physical and chemical pa⁃
rameters of the deduced amino acide sequences were computed by ProtParam. Membrane-spanning re⁃
gions and their orientation of the deduced amino acid sequences were predicted by TMpred. The presence
果 树 学 报 第33卷
and location of signal peptide cleavage sites of the deduced amino acid sequences were predicted by Sig⁃
nalP 4.1 Server. The subcellular location of the deduced amino acid sequences were predicted by TargetP
1.1 Server. The secondary structure of the deduced amino acid sequences were predicted by SOPMA. Se⁃
quence alignment between the deduced amino acid sequences and ten homologous proteins of other plant
species (Prunus webbii, Prunus armeniaca, Prunus avium, Prunus cerasus, Prunus dulcis, Prunus mume,
Prunus persica, Prunus salicina, Antirrhinum hispanicum, Petunia integrifolia subsp. inflata) was per⁃
formed by DNAMAN. Phylogenetic analysis between the deduced amino acid sequences and ten proteins
of other plant species were processed by MEGA6. The main functions of the deduced amino acid sequenc⁃
es were predicted by ProtFun 2.2 Server.【Results】Two full-length sequences of S-RNase (PtS16-RNase
and PtS17-RNase) genes from wild almond, were successfully cloned. Both the PtS16-RNase gene and the
PtS17-RNase gene belonged to RNase T2 gene family. The similarity of the nucleotide sequences between
the two cloned S-RNase genes and those of S-RNase genes of many other plant species of Prunus was
83%-98%. The deduced amino acid sequences of PtS16-RNase gene and PtS17-RNase gene had a typi⁃
cal structure of S-RNase protein. Open Reading Frame(ORF) of Pt16-RNase gene was 690 bp in length,
encoding a protein of 229 amino acids; Open Reading Frame(ORF) of PtS17-RNase gene was 678 bp in
length, encoding a protein of 225 amino acids. Both the PtS16-RNase protein and the PtS17-RNase pro⁃
tein had five conserved domains (C1-C5) and one hypervariable region (HV). Means, such as site-directed
mutagenesis, could be used to modify the corresponding gene region of catalytic histidine in conserved do⁃
mains to make S- RNase protein lose its ribonuclease activity, therefore couldn’t degrade self- RNA.
Means, such as site-directed mutagenesis, could also be used to modify the corresponding gene region of
hypervariable region to make S-RNase protein unable to specifically bind with pollen self-incompatibility
determinant factors, therefore couldn’t initiate self- incompatibility response. Moreover, RNAi could be
used to silence the target gene. It was predicted that both the PtS16-RNase protein and the PtS17-RNase
protein were hydrophilic instable secretory protein. The 1-28 amino acid residues of the PtS16-RNase pro⁃
tein and the 1-26 amino acid residues of the PtS17-RNase protein were predicted to be signal peptide.
Means, such as site-directed mutagenesis, could be used to modify corresponding gene region of signal
peptide, so that S-RNase protein couldn’t arrive its action site to arrest the growth of self-pollen tube. It
was predicted that secondary structures of both the PtS16-RNase protein and the PtS17-RNase protein
mainly presented as α-helix, extended strand and random coil. According to the prediction, evolutionary
relationships of the PtS16-RNase protein and the PtS17-RNase protein were close to some other S-RNase
proteins of Prunus, and homology of cross-species was higher than that of intra-species, which might sug⁃
gest that S-RNase differentiation had completed before species differentiation in Rosaceae. It was predict⁃
ed that main functions of the PtS16-RNase protein and the PtS17-RNase protein were hydrolase and hor⁃
mone. The former was consistent with the research results that style self-incompatibility gene products are
ribonucleases. The latter was consistent with the research results that S-RNase still had some other func⁃
tions except ribonucleases, which could be a new research angle after proved. Ribonucleases of the T2 fam⁃
ily played a vital role in both plant and human. A broad range of biological roles for these ribonucleases
had been suggested, including scavenging of nucleic acids, degradation of self-RNA, serving as extra- or
intracellular cytotoxins, and modulating host immune responses. Recently, RNaseT2 family members have
been implicated in human pathologies such as cancer and parasitic diseases. Interestingly, certain func⁃
tions of RNaseT2 family members are independent of their nuclease activity, suggesting that these proteins
have additional functions.【Conclusion】Two full- length sequences of S- RNase gene were successfully
906
，等：基因全长的克隆与序列分析第8期
显花植物是陆地上分布最广泛的一种植物，其
中一半以上具有自交不亲和性[1]。自交不亲和性是
显花植物防止近亲繁殖、保持遗传多样性的一种重
要机制，是植物发育生物学和分子生物学的研究热
点之一[2]。
自交不亲和反应是高度复杂的细胞内相互作
用，自交不亲和性机制是多因子互作网络，研究者们
已经提出了多种关于自交不亲和性机制的模型，如
膜受体模型、抑制子模型、蛋白质降解模型、区室化
模型和协同非我识别模型等[2-4]，但这些模型尚需进
一步验证和完善，自交不亲和性分子机理的全面揭
开还有一段距离。
相关研究表明，蔷薇科植物具有基于 S-RNase
的配子体型自交不亲和性，自交不亲和性反应的特
异性是由位于S-位点（S代表Sterility）的花粉S基因
和花柱 S基因控制，花粉 S基因为 SLF（S-locus F-
box）/SFB（S-haplotype-specific F-box）[5-9]，花柱 S基
因为 S-RNase[10-11]，SLF/SFB蛋白与 S-RNase蛋白的
相互作用可能位于自交不亲和反应多因子互作网络
的关键节点。
S-RNase基因首先在烟草中得到鉴定[12]，随后其
编码蛋白的RNase活性以及作为花柱自交不亲和性
特异性决定因子的重要作用得到验证 [10-11，13-14]，其
RNase活性是花柱拒绝自体花粉所必需的[15]，目前认
为 S-RNase降解自体花粉管RNA导致自体花粉管
生长受阻，进而导致自交不亲和性。
野扁桃（Amygdalus ledebouriana Schlecht.）又名
野巴旦杏，属于蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，是
一种野生珍稀濒危植物资源，我国仅在新疆有分布，
野扁桃丰富了我国的物种基因宝库，具有重要科学
研究价值[16-18]。
生物信息学是后基因组时代产生的交叉学科，
一方面，它是一个管理、检索和分析海量生物医学数
据的信息技术和计算技术，另一方面，它是一种和传
统生物学互补的研究方法，是基于数据的一种提出
新假说、发现新规律、发现新功能元件的研究方法，
在序列分析方面，生物信息学的基本应用包括：对核
酸和蛋白质进行序列比对，对蛋白质基本性质、结
构、功能进行预测等[19-22]。
自交不亲和性是导致野扁桃坐果率低的重要原
因之一，分子水平的研究，如鉴定S-基因型，筛选分
子调控位点等，可为授粉树的科学配置以及坐果率
的提高提供理论依据。此外，传统育种技术具有周
期长、效率低、可控性差等局限，通过分子生物学手
段可以使育种及遗传改良更高效、更精确、更可
控[23]。我们以新疆野扁桃的花柱为试验材料，利用
RT-PCR和RACE技术克隆到了 2个 S-RNase全长
基因，并对这 2个基因及其编码蛋白进行生物信息
学分析，以期为野扁桃自交不亲和性的分子调控和
遗传改良奠定基础。
1 材料和方法
1.1 植物材料
试材为野扁桃气球期花柱（花期大致可分为露
红期、小蕾期、气球期和盛花期，气球期时的花柱发
育基本成熟，同时由于花瓣的包裹，花柱基本不会受
到如昆虫、授粉等外界因素的影响），2015年 4月下
旬采自裕民县巴尔鲁克山西部。
1.2 方法
1.2.1 S-RNase全长基因的获取 RNA提取：用
RNAprep Pure Plant Kit（TIANGE公司，北京）提取植
株A和植株B（2者品种相同，S基因型不同，所获基
因可用于后续试验，用来验证 SFB蛋白与 S-RNase
蛋白之间是否存在不具有基因型特异性的相互作
用）的花柱总RNA。
保守中间片段获取：用 RevertAid First Strand
cDNA Synthesis Kit（Fermentas公司，立陶宛）合成
cDNA。根据 S-RNase同源基因保守区域设计简并
引物 S-RNase-F和 S-RNase-R，分别以植株A和植
株B的花柱 cDNA为模板进行 PCR扩增，获得目的
片段后克隆并测序。
5’-RACE：选用 5’RACE System for Rapid Am⁃
关 鹏，等：2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析
cloned from pistils of two different Amygdalus ledebouriana Schlecht. plants. The molecular regulation of
self-incompatibility in Amygdalus ledebouriana Schlecht. could be performed based on characteristics of
sequences of the cloned genes and their decuced amino acid sequences.
Key words: Amygdalus ledebouriana Schlecht.; Self- incompatibility; S- RNase gene; Bioinformatics;
RACE
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果 树 学 报 第33卷
plification of cDNA Ends，Version 2.0（Invitrogen 公
司，上海）。根据 2个保守中间片段的测序结果，利
用 Primer Premier 6.0分别设计 5GSP-1、5GSP-2、
5GSP-3和 5GSP-1#、5GSP-2#、5GSP-3#。使用 SU⁃
PERSCRIPTTM II RT和 5GSP-1及 5GSP-1#分别以
植株A和植株B的花柱总RNA为模板合成 cDNA，
RNase Mix 降解 RNA 模板，GLASSMAX Spin Car⁃
tridge去除降解的 RNA模板、纯化 cDNA，TdT和
dCTP加多聚C尾，利用AAP（abridged anchor primer）
和 5GSP-2及 5GSP-2#分别以植株A和植株B的花
柱 cDNA为模板进行第1轮PCR扩增，以第1轮PCR
稀释产物为模板，利用AUAP（abridged universal am⁃
plification primer）和5GSP-3及5GSP-3#分别进行第
2轮PCR扩增，将所获基因片段克隆并测序。
3’-RACE：选用SMARTer™ RACE cDNA Ampli⁃
fication Kit（Clontech公司，北京）。根据 2个保守中
间片段的测序结果，利用 Primer Premier 6.0分别设
计 3GSP-1、3GSP-2和 3GSP-1#、3GSP-2#。使用逆
转录酶 SMARTScribe ™ Reverse Transcriptase 和 3’
RACE CDS Primer A分别以植株A和植株B的花柱
总RNA为模板合成 cDNA，利用Universal Primer Mix
（UPM Long和 UPM Short的混合物）和 3GSP-1及
3GSP-1#分别以植株A和植株B的花柱 cDNA为模
板进行第 1轮 PCR扩增，以第 1轮 PCR稀释产物为
模板，利用 Universal Primer Mix（UPM Long和 UPM
Short的混合物）和3GSP-2及3GSP-2#分别进行第2
轮PCR扩增，将所获基因片段克隆并测序。
序列拼接：利用DNAMAN（版本：8.0.8.789）进
行序列拼接，得到全长基因PtS16-RNase和PtS17-
RNase。
全长引物扩增：根据拼接得到的全长，利用
Primer Premier 6.0设计全长引物FL-F和FL-R以及
FL-F#和FL-R#，分别以植株A花柱 cDNA和植株B
花柱 cDNA为模板进行 PCR扩增，将所获全长基因
克隆并测序。
试验所用引物见表1。
表 1 克隆 PtS16-RNase和 PtS17-RNase基因所用引物
Table 1 Primers used for PtS16-RNase and PtS17-RNase genes cloning
基因名称
Gene name
PtS16-RNase
PtS17-RNase
引物名称
Primer name
S-RNase-F
S-RNase-R
5GSP-1
AAP
5GSP-2
AUAP
5GSP-3
3’-CDS Primer A
UPM Long
UPM Short
3GSP-1
3GSP-2
FL-F
FL-R
S-RNase-F
S-RNase-R
5GSP-1#
AAP
5GSP-2#
AUAP
5GSP-3#
3’-CDS Primer A
UPM Long
UPM Short
3GSP-1#
3GSP-2#
FL-F#
FL-R#
引物序列
Primer sequence
TTTGTGCAACARTGGCCACCG
AACAMARTACYACTTCRTGTAA
CATTTACTGGGCATCG
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG
AGGCCATGAATGGTGAAA
GGCCACGCGTCGACTAGTAC
TTTTGTAATGGCCTGGGT
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VNCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CTAATACGACTCACTATAGGGC
GCGACAACAAAATGGAAGTATTCGGACA
TCGTTGCAAACGTGATCCAGCAACT
ATGGGGATGTTGAAATCGTCATTC
TTATGGAAACAAGATGTCAACTT
TTTGTGCAACARTGGCCACCG
AACAMARTACYACTTCRTGTAA
TTACTGGGCTTCCTTG
GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG
TAGGCCATGGATGGTGAA
GGCCACGCGTCGACTAGTAC
GGTGTTGGTGGGACGGTT
AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30VNCTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT
CTAATACGACTCACTATAGGGC
CGCTTCAATCGTACCAAATGCAAAACA
TCACCCATTAAAGGAGCAACTGGAAGA
ATGGCGATGTTGAAACCGTCACTT
TTATTGAAAGGAGATGGCTCGTT
备注
Note
简并引物Degenerate primer
简并引物Degenerate primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
全长引物Full-length primer
全长引物Full-length primer
简并引物Degenerate primer
简并引物Degenerate primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
5’-RACE引物5’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
3’-RACE引物3’-RACE primer
全长引物Full-length primer
全长引物Full-length primer
Note：R=A，G; M=A，C; Y=C，T; N = A，C，G，or T; V = A，G，or C.
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，等：基因全长的克隆与序列分析第8期
1.2.2 S-RNase基因及其编码蛋白的生物信息学分
析 将获得的 S-RNase基因在NCBI上进行BLAST
（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比对，用 ORF
Finder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）寻
找开放阅读框，用 CDD（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
Structure/cdd/wrpsb.cgi）对编码蛋白进行保守结构域
分 析 ；通 过 ProtParam（http://web.expasy.org/prot⁃
param/）分析2个S-RNase基因编码蛋白的氨基酸组
成，相对分子质量，等电点等理化性质；利用TMpred
（http://www.ch.embnet.org/ software/TMPRED_form.ht⁃
ml）分析 S-RNase蛋白跨膜区；采用 SignalP（http://
www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）对 S-RNase蛋白进
行信号肽预测；通过 TargetP（http://www.cbs.dtu.dk/
services/TargetP/）分析 S-RNase蛋白的亚细胞定位；
利 用 SOPMA （https://npsa- prabi.ibcp.fr/cgi- bin/
npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html）预测
S-RNase蛋白的二级结构；通过 DANMAN（版本：
8.0.8.789）对PtS16-RNase蛋白和PtS17-RNase蛋白
与杏、李、扁桃、甜樱桃、金鱼草、矮牵牛等10种植物
的同源蛋白进行氨基酸序列比对，进一步利用
MEGA6[24]的邻接法进行系统进化分析，与 2个野扁
桃S-RNase蛋白进行氨基酸序列比对及系统进化分
析的蛋白质为（括号内为所属植物科属以及 Gen⁃
Bank登录号）PwS6-RNase（Prunus webbii，ABY19370）、
ParS2-RNase（Prunus armeniaca，AAT69245）、PaS1-
RNase（Prunus avium，CAC27784）、PcSa- RNase
（Prunus cerasus，BAB84687）、PdSa- RNase（Prunus
dulcis，BAA95317）、PmSf- RNase（Prunus mume，
BAC56114）、PpS3-RNase（Prunus persica，BAJ41467）、
PsSa- RNase（Prunus salicina，BAA95157）、AhS3-
RNase（Antirrhinum hispanicum，CAC41959）和 PiS1-
RNase（Petunia integrifolia subsp. inflata，AAA33726）；
采用ProtFun（http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/）
对2个S-RNase蛋白进行功能预测。
2 结果与分析
2.1 S-RNase全长基因的克隆
经过在NCBI上的查询，野扁桃S-RNase基因已
经定名至PtS15-RNase，故将本试验中获得的2个S-
RNase基因分别定名为PtS16-RNase（GenBank登录
号：KU167068）和 PtS17-RNase（GenBank登录号：
KU167069）。
PtS16-RNase基因：以野扁桃植株A的花柱 cD⁃
NA为模板，利用简并引物 S-RNase-F和 S-RNase-
R，PCR扩增保守中间片段，得到 1条约 500 bp的特
异条带（图 1-A），经测序和 BLAST比对证明是 S-
RNase基因的的同源片段。根据保守中间片段的测
序结果，利用Primer Premier 6.0设计 5’-RACE引物
5GSP- 1、5GSP- 2、5GSP- 3 以及 3’- RACE 引物
3GSP-1、3GSP-2，进行 5’-RACE和 3’-RACE，分
别得到大约 250 bp（图 1-B）和 260 bp的条带（图
1-C）。将这 2个片段进行克隆并测序，与保守中
间片段进行序列拼接，得到全长为 690 bp 的
PtS16-RNase基因。根据拼接结果，利用 Primer
Premier 6.0设计全长引物 FL-F和 FL-R，以植株A
的花柱 cDNA为模板 PCR扩增全长基因（图 1-D），
将获得的基因克隆并测序，结果显示其序列与拼接
结果一致。
A.保守中间片段；B. 5’-RACE 产物；C. 3’-RACE 产物；D. PtS16-RNase 全长。
A. Conserved intermediate fragments；B. 5’-RACE products；C. 3’-RACE products；D. Full-length PtS16-RNase.
图 1 PtS16-RNase基因克隆 PCR产物电泳
Fig. 1 Electrophoretic results of PCR products of PtS16-RNase gene cloning
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp
1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
A B C D
关 鹏，等：2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析 909
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PtS17-RNase基因：以野扁桃植株 B的花柱
cDNA 为模板，利用简并引物 S-RNase-F 和 S-
RNase-R，PCR扩增保守中间片段，得到约 500 bp
的特异条带（图 2-A），经测序和 BLAST比对证明
是 SFB基因的同源片段。根据保守中间片段的测
序结果，利用 Primer Premier 6.0设计 5’-RACE引
物 5GSP-1#、5GSP-2#、5GSP-3#以及 3’-RACE引
物 3GSP- 1#、3GSP- 2#，进行 5’- RACE 和 3’-
RACE，分别得到约 260 bp（图 2-B）和 255 bp的条
带（图 2-C）。将这 2个片段进行克隆并测序，与保
守中间片段进行序列拼接，得到全长为 678 bp的
PtS17-RNase基因。根据拼接结果，利用 Primer
Premier 6.0设计全长引物 FL-F#和 FL-R#，以植株
B的花柱cDNA为模板PCR扩增全长基因（图2-D），
A.保守中间片段；B. 5’-RACE 产物；C. 3’-RACE 产物；D. PtS17-RNase全长。
A.Conserved intermediate fragments；B. 5’-RACE products；C. 3’-RACE products；D. Full-length PtS17-RNase.
图 2 PtS17-RNase基因克隆 PCR产物电泳
Fig. 2 Electrophoretic results of PCR products of PtS17-RNase gene cloning
表 2 PtS16-RNase基因与其他 10种植物 S-RNase基因
的序列一致性
Table 2 Sequence identity of PtS16-RNase with S-RNases
of other ten plant species
基因名称及其GenBank登录号
Gene name and GenBank
accession number
刺李 Prunus spinosa
S1-RNase（EF636467）
杏 Prunus armeniaca
S51-RNase（HQ342881）
野樱桃 Prunus virginiana
S3-RNase（JQ627791）
甜樱桃 Prunus avium
S13-RNase（DQ385842）
碧桃 Prunus persica
S2-RNase（AB252417）
中国李 Prunus salicina
Sa-RNase（AB252411）
樱桃 Prunus pseudocerasus
S3-RNase（EU253960）
梅 Prunus mume
S14-RNase（EU020121）
扁桃 Prunus dulcis
S30-RNase（AY876939）
野杏 Prunus webbii
S1-RNase（DQ993660）
与PtS16-RNase
基因的序列一致性
Sequence identity with
PtS16-RNase/%
98
98
98
89
88
88
87
87
86
85
将获得的基因克隆并测序，结果显示其序列与拼
接结果一致。
2.2 S-RNase基因及其编码蛋白的生物信息学分
析
2.2.1 S-RNase基因的生物信息学分析 1）S-
RNase基因的 BLAST比对。应用 NCBI的 BLASTN
在线程序对PtS16-RNase基因和PtS17-RNase基因
进行比对分析，结果显示 2个 S-RNase基因与多种
植物 S-RNase基因的序列相似性程度为 83%~98%
（表 2，表 3），推测PtS16-RNase基因和PtS17-RNase
基因属于RNase T2基因家族。
2）S-RNase基因的开放阅读框预测。应用NC⁃
BI的ORF Finder在线预测工具对PtS16-RNase基因
和PtS17-RNase基因的开放阅读框进行预测，结果
显示这 2个基因中存在多个读码框，根据识别ORF
时的最长原则，并结合BLASTX的搜索结果，推断出
这 2个基因序列均包含一个完整的 ORF。PtS16-
RNase基因全长 878 bp，ORF长 690 bp，编码一条由
229个氨基酸组成的蛋白序列（图 3）；PtS17-RNase
基因全长 807 bp，ORF长 678 bp，编码一条由 225个
氨基酸组成的蛋白序列（图4）。
A B C D
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp1 000 bp750 bp500 bp250 bp100 bp
2 000 bp
1 000 bp750 bp500 bp
250 bp100 bp
910
，等：基因全长的克隆与序列分析第8期
图 3 PtS16-RNase cDNA及预测的开放阅读框
Fig. 3 PtS16-RNase cDNA and predicted ORF
表 3 PtS17-RNase基因与其他 10种植物 S-RNase
基因的序列一致性
Table 3 Sequence identity of PtS17-RNase with S-RNases
of other ten plant species
基因名称及其GenBank登录号
Gene name and GenBank
accession number
甜樱桃 Prunus avium
S13-RNase（DQ385842）
扁桃 Prunus dulcis
S31-RNase（KM225274）
酸樱桃 Prunus cerasus
S13m-RNase（DQ385843）
梅 Prunus mume
S13-RNase（EU020120）
刺李 Prunus spinosa
S15-RNase（EF636468）
杏 Prunus armeniaca
S9-RNase（AY864826）
中国李 Prunus salicina
S8-RNase（DQ512913）
碧桃 Prunus persica
S3-RNase（AB537563）
野杏 Prunus webbii
S1-RNase（DQ993660）
樱桃 Prunus pseudocerasus
S8-RNase（HQ913635）
与PtS17-RNase基因的序列一致性
Sequence identity with PtS17- RNase
/%
99
96
94
90
89
89
87
87
85
83
2.2.2 S-RNase蛋白的生物信息学分析 1）S-
RNase蛋白的理化性质分析。使用 ProtParam在线
程序计算 2个 S-RNase蛋白的理化参数，结果显示
PtS16-RNase蛋白和 PtS17-RNase蛋白的不稳定系
数分别为40.82和41.60（不稳定系数40以上的蛋白
为不稳定蛋白），亲水性总平均系数分别为-0.421
和-0.631（亲水性总平均系数为负值的蛋白为亲水
性蛋白），预测2个S-RNase蛋白均为亲水性不稳定
蛋白。
2）S-RNase蛋白的跨膜区分析。使用 TMpred
分析 2个 S-RNase蛋白质的跨膜区，结果显示
PtS16-RNase蛋白8~25位氨基酸为由内向外的跨膜
区，PtS17-RNase蛋白 8~26位氨基酸为由内向外的
跨膜区。
3）S-RNase蛋白的信号肽预测。通过 SignalP
预测 2个 S-RNase蛋白的信号肽，结果表明 2个 S-
RNase蛋白均有信号肽，PtS16-RNase蛋白的信号肽
为 1~28位氨基酸，PtS17-RNase蛋白的信号肽为 1~
26位氨基酸。
4）S-RNase蛋白的亚细胞定位。2个 S-RNase
蛋白经TargetP预测，均可能为分泌蛋白。
5）S-RNase蛋白的保守结构域分析。使用NC⁃
BI的 CDD（Conserved Domain Database）对 2个 S-
RNase蛋白进行保守结构域分析（图 5，图 6），结果
显，2个S-RNase蛋白均具有RNase T2结构域。
6）S-RNase蛋白的二级结构预测。利用 SOP⁃
MA对2个S-RNase蛋白的二级结构进行预测，结果
显示2个S-RNase蛋白的主要二级结构元件均为α-
螺旋、延伸链（β片层的构件）和无规卷曲。
关 鹏，等：2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析 911
果 树 学 报 第33卷
图 5 PtS16-RNase蛋白的保守结构域
Fig. 5 Conserved domains of PtS16-RNase protein
图 6 PtS17-RNase蛋白的保守结构域
Fig. 6 Conserved domains of PtS17-RNase protein
图 4 PtS17-RNase cDNA及预测的开放阅读框
Fig. 4 PtS17-RNase cDNA and predicted ORF
7）S-RNase蛋白的多序列比对和系统进化分
析。将2个S-RNase蛋白与其他植物的同源蛋白经
DNAMAN进行氨基酸多序列比对（图 7），利用
MEGA6进行系统进化分析（图8）。结果表明2个S-
RNase 蛋白具有 RNase T2蛋白的典型结构，S-
RNase在蔷薇科李属植物中具有较高的系统进化一
致性。
8）S-RNase蛋白的功能预测。经 ProtFun预
测，2个 S-RNase蛋白的主要功能为水解酶和激
素。
912
，等：基因全长的克隆与序列分析第8期
图 7 PtS16-RNase蛋白和 PtS17-RNase蛋白与一些 S-RNase蛋白的氨基酸序列比对
Fig. 7 Amino acid sequence alignment of PtS16-RNase protein and PtS17-RNase protein with some S-RNase proteins
686756676869666570506961
135
134
123
134
135
136
132
132
137
117
137
131
192
191
182
192
192
205
194
187
194
175
188
186
229
225
189
226
226
237
227
221
228
208
223
222
C1 C2
HV C3
C4
C5
PtS16-RNase.seqPtS17-RNase.seqPwS6-RNase.seqParS2-RNase.seqPaS1-RNase.seqPcSa-RNase.seqPdSa-RNase.seqPmSf-RNase.seqPpS3-RNase.seqPsSa-RNase.seqAhS3-RNase.seqPiS1-RNase.seq
PtS16-RNase.seqPtS17-RNase.seqPwS6-RNase.seqParS2-RNase.seqPaS1-RNase.seqPcSa-RNase.seqPdSa-RNase.seqPmSf-RNase.seqPpS3-RNase.seqPsSa-RNase.seqAhS3-RNase.seqPiS1-RNase.seq
PtS16-RNase.seqPtS17-RNase.seqPwS6-RNase.seqParS2-RNase.seqPaS1-RNase.seqPcSa-RNase.seqPdSa-RNase.seqPmSf-RNase.seqPpS3-RNase.seqPsSa-RNase.seqAhS3-RNase.seqPiS1-RNase.seq
PtS16-RNase.seqPtS17-RNase.seqPwS6-RNase.seqParS2-RNase.seqPaS1-RNase.seqPcSa-RNase.seqPdSa-RNase.seqPmSf-RNase.seqPpS3-RNase.seqPsSa-RNase.seqAhS3-RNase.seqPiS1-RNase.seq
关 鹏，等：2个野扁桃自交不亲和S-RNase基因全长的克隆与序列分析 913
果 树 学 报 第33卷
3 讨 论
通过RT-PCR和RACE技术，我们从新疆野扁
桃不同植株的花柱中克隆到 2个 S-RNase全长基
因，并对这 2个基因及其编码蛋白进行了生物信息
学分析。结果表明PtS16-RNase基因编码 229个氨
基酸，PtS17-RNase基因编码 225个氨基酸，2个 S-
RNase基因的编码蛋白都具有RNase T2蛋白的典型
结构，2个蛋白的C1~C5区相似度较高，HV区相似
度较低。
蔷薇科植物S-RNase蛋白的种间同源性往往大
于种内同源性[25]，我们的系统进化分析结果以及郭
振宇等[26]的系统进化分析结果都证明了这一点，这
可能说明蔷薇科植物S-RNase基因分化在物种分化
之前完成。
预测 S-RNase蛋白为分泌型蛋白，该预测与 S-
RNase蛋白在花柱传导细胞中合成后分泌至传导管
胞外基质的研究结果相符 [27]，S-RNase蛋白进入花
粉管细胞质基于S-RNase的自交不亲和反应能够发
生的前提，可以通过定点突变等手段[28-30]对S-RNase
蛋白信号肽对应的基因区域进行干扰，使 S-RNase
蛋白无法到达发挥作用的部位，进而无法抑制自体
花粉管的生长。
预测S-RNase蛋白可能的主要功能包括水解酶
和激素，前者与花柱自交不亲和性决定因子为核糖
核酸酶的研究结果相符 [13]，后者与 S-RNase除了具
有核糖核酸酶活性外，还具有其他功能的研究结果
相符[31]，后者经验证后或许可以作为新的研究切入
点。T2家族核糖核酸酶在植物和人体中都发挥着
重要作用，之前认为其主要功能是清除无用的核酸，
降解自体RNA，调节免疫反应，最近发现T2家族核
糖核酸酶还参与癌症和寄生虫疾病等的病理过程，
而且这些功能都与其核酸酶活性无关，表明T2家族
核糖核酸酶还具有其他功能。
基于 S-RNase的配子体型自交不亲和性机制
是多因子互作网络，S-RNase蛋白位于互作网络的
关键节点。S-RNase蛋白的保守区与蛋白结构的
稳定和催化活性有关，高变区与自交不亲和反应
的特异性有关 [32]。通过定点突变等手段 [28-30]，可以
对保守区内催化性组氨酸的对应基因位点进行分
子改造，使其丧失核糖核酸酶活性，也可以对高变
区的对应基因区域进行干扰，使其无法与相应花
粉自交不亲和性特异性决定因子特异结合，进而
无法引发自交不亲和反应，或者利用RNAi技术将
靶基因沉默等 [33]，对野扁桃自交不亲和性进行分
子调控。
图 8 PtS16-RNase蛋白和 PtS17-RNase蛋白与一些同源蛋白的系统进化分析
Fig. 8 Phylogenetic analysis of PtS16-RNase protein and PtS17-RNase protein with some homologous proteins
35
17
11
48 47
94 37
35100
PmSf-RNase
ParS2-RNase
PtS17-RNase
PpS3-RNase
PaS1-RNase
PtS16-RNase
PwS6-RNase
PsSa-RNase
PcSa-RNase
PdSa-RNase
AhS3-RNase
PiS1-RNase
0.1
914
，等：基因全长的克隆与序列分析第8期
4 结 论
本研究以新疆野扁桃2个不同植株的花柱为试
材，成功克隆了 2个野扁桃自交不亲和性花柱特异
性决定因子编码基因S-RNase全长序列，2个基因均
具有RNase T2区，属于RNase T2基因家族。可根据
所获基因及其编码蛋白的特点，对野扁桃自交不亲
和性进行分子调控。
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