全 文 ：新 疆 农 业 大 学 学 报　２０１２，３５（５）：３６５～３６７
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
文章编号：１００７－８６１４（２０１２）０５－０３６５－０３
野扁桃ＡｌｓＣＢＦ基因植物表达载体的构建
李　宁１，李　疆２，刘立强２，罗淑萍１，王化超１
（１．新疆农业大学 农学院，乌鲁木齐　８３００５２；２．新疆农业大学 林学与园艺学院，乌鲁木齐　８３００５２）
摘　要：　以ＡｌｓＣＢＦ基因ｃＤＮＡ和植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１进行双酶切，将抗寒基因ＡｌｓＣＢＦ与表达载体正
向选择系统结合，构建抗寒基因植物表达载体ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ 。对阳性克隆通过菌落ＰＣＲ、酶切鉴定和测序分
析，成功将目的基因序列正确连接到ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１，构建其植物表达载体，并转入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中。
关键词：　野扁桃；ＡｌｓＣＢＦ 基因；载体构建；植物表达载体
中图分类号：Ｓ６６２．９　　　　　　文献标识码：Ａ　
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　Ｐｌａｎｔ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ＡｌｓＣＢＦ
Ｇｅｎｅ　ｆｒｏｍＡｍｙｇｄａｌｕｓ　ｌｅｄｅｂｏｕｒｉａｎａ　Ｓｃｈｌｅｃｈｔ
ＬＩ　Ｎｉｎｇ１，ＬＩ　Ｊｉａｎｇ２，ＬＩＵ　Ｌｉ－ｑｉａｎｇ２，ＬＵＯ　Ｓｈｕ－ｐｉｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｈｕａ－ｃｈａｏ１
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈｉｎａ；２．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　ａｎｄ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｕｒｕｍｑｉ　８３００５２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：　Ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔｏ　ｃｕｔ　ｄｏｕｂｌｅ　ｅｎｚｙｍｅ　ｗｉｔｈ　ＡｌｓＣＢＦｇｅｎｅ　ｃＤＮＡ　ａｎｄ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｖｅｃｔｏｒｓ　ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１，ｔｏ　ｃｏｍｂｉｎｅ　ｃｏｌｄ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ　ＡｌｓＣＢＦｗｉｔｈ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｔｏ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｃｏｌｄ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｇｅｎｅ．Ｉｎ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ，ｔｈｒｏｕｇｈ　ｔｈｅ　ｃｏｌｏｎｉｅｓ　ＰＣＲ，ｅｎｚｙｍａｔｉｃ　ｄｉ－
ｇｅｓｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ａｎａｌｙｓｉｓ，ｔｈｅ　ｐｕｒｐｏｓｅ　ｇｅｎｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ｗｉｌ　ｂｅ　ｐｒｏｐｅｒｌｙ　ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐＣＡＭ－
ＢＩＡ１３０１ｔｏ　ｂｕｉｌｄ　ｔｈｅ　ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｔｏ　ｂｅ　ｍｏｖｅｄ　ｏｎ　ｉｎｔｏ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ
ＬＢＡ４４０４．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：　Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｌｅｄｅｂｏｕｒｉａｎａＳｃｈｌｅｃｈｔ；ＡｌｓＣＢＦｇｅｎｅ；ｖｅｃｔｏｒ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ；ｐｌａｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｃｔｏｒｓ
　　ＣＢＦ（ＣＲＴ／ＤＲＥ　Ｂｉｎｄｉｎｇ　Ｆａｃｔｏｒ）转录因子是
最初在拟南芥中发现的一类受低温诱导且反式作用
因子，它可以与ＣＲＴ／ＤＲＥ顺式作用元件特异性结
合，激活启动子中具有这一调控元件的冷诱导和脱
水诱导基因的表达，从而提高植物的抗逆性［１］。近
年来，利用转基因技术改良植物性状已取得较多成
果［２－４］。已有研究表明，ＣＢＦ 家族基因在植物抗
寒、抗旱及抗盐碱方面起着重要作用［５，６］。目前在
水稻、玉米、番茄、黑麦等作物中也已相继有ＣＢＦ研
究的报道［７－９］。
野扁桃（Ａｍｙｇｄａｌｕｓ　ｌｅｄｅｂｏｕｒｉａｎａ　Ｓｃｈｌｅｃｈｔ）属
蔷薇科李亚科桃属扁桃亚属植物，具有较强的抗寒、
抗旱性［１０］。栽培扁桃由于休眠期内其耐寒性与桃
接近，花期内可能遇到霜冻，使得坚果产量不稳定。
低温成为制约其生长的限制因子之一，开展抗冻基
因导入栽培扁桃的研究具有重要意义。根据项目组
已克隆的新疆野扁桃基因ＡｌｓＣＢＦ 全长序列，设计
一对加酶切位点的特异引物，ＰＣＲ扩增后将获得的
目的基因插入ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１载体中，采用冻融法
将其导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，为进一步的遗传转
化和该基因功能鉴定及通过农杆菌介导法将
ＡｌｓＣＢＦ 基因导入扁桃奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材 料
大肠杆菌ＤＨ５α菌株、根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４菌
收稿日期：２０１１－０４－２８
基金项目：国家自然科学基金项目（３１０６０２５５；３１２６０１８６）；新疆维吾尔自治区十二五重大科技专项项目（２０１１３０１０２－１）；新
疆维吾尔自治区果树学重点学科基金资助
通讯作者：罗淑萍，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｕｏｓｈｕｐｉｎｇ２００８＠１６３．ｃｏｍ
新　疆　农　业　大　学　学　报 ２０１２年　
株、表达载体ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１由本研究室保存。感
受态细胞、ｐＭＤ１９－Ｔ　Ｖｅｃｔｏｒ购自 ＴａＫａＲａ公司。
反转录试剂盒、限制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶均购
自ＴａＫａＲａ公司，Ｔｒｉｚｏｌ总ＲＮＡ提取试剂盒、Ｔａｑ
ＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰｓ、ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ、ＰＣＲ产物纯化
试剂盒购自ＴＩＡＮＧＥＮ公司。
１．２　方 法
１．２．１　ＰＣＲ引物设计与合成
根据项目组克隆的野扁桃ＡｌｓＣＢＦ 基因序列，
应用Ｐｒｉｍｅｒ　Ｐｒｅｍｉｅｒ５．０软件分析设计一对特异引
物。ＢＴＱ－Ｆ：ＧＣＴＣＴＡＧＡＡＴＧＧＡＣＡＴＧＴＴＣＴ－
ＴＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＴ；ＢＴＱ－Ｒ：ＣＧＧＧＡＴＣＣＴＣＡ－
ＧＡＴＡＧＡＧＡＡＡＣＴＣＣＡＣＡＧＧ。划线部分为上、
下游引物引入的ＢａｍＨ Ⅰ和ＸｂａⅠ酶切位点。引
物合成委托上海生工生物技术有限公司完成。
１．２．２　野扁桃总ＲＮＡ的提取
采用Ｔｒｉｚｏｌ法提取野扁桃总ＲＮＡ。
１．２．３　ＡｌｓＣＢＦ 基因的扩增
取５μｇ总ＲＮＡ做模板，加入５０μｍｏｌ／Ｌ　Ｏｌｉｇｏ
（ｄＴ）引物 １μＬ，加 １０ ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘｔｕｒｅ
２μＬ，灭菌无ＲＮａｓｅ水５μＬ，７０℃变性５ｍｉｎ，放冰
上５ｍｉｎ。然后依次加入５×ｃＤＮＡ　Ｂｕｆｆｅｒ　４μＬ，
１５Ｕ／μＬ反转录酶 Ｍ－ＭＬＶ　１μＬ，４０Ｕ／μＬ　ＲＮａｓｅ
Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ　１μＬ，ＲＮａｓｅ　Ｈ２Ｏ加至２０μＬ，反应程序：
４２℃，５０ｍｉｎ；７０ ℃保温１５ｍｉｎ；反应结束后，
－２０℃保存备用。
以合成的ｃＤＮＡ 第一条链为模板，ＢＴＱ－Ｆ和
ＢＴＱ－Ｒ为引物，进行ＰＣＲ扩增。ＰＣＲ扩增反应体
系：ｃＤＮＡ　１μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶０．３μＬ，ｄＮＴＰ
０．５μＬ，上下游引物各１μＬ，１０×Ｂｕｆｆｅｒ　２．５μＬ、加
ｄｄＨ２Ｏ至２５μＬ。ＰＣＲ扩增反应程序：９４℃预变性
５ｍｉｎ；９４℃变性３０ｓ，６６℃复性３０ｓ，７２℃延伸６０
ｓ，３５个循环；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。
１．２．４　植物表达载体的构建
用ＢａｍＨ Ⅰ和ＸｂａⅠ双酶切ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１
载体和所扩增的ＡｌｓＣＢＦ 基因，回收目的片段，用
Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 连 接，得 到 重 组 质 粒
ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ 。转化大肠杆菌ＤＨ５α，在含卡
那霉素（５０μｇ／ｍＬ）的ＬＢ培养基上筛选重组克隆，
提取重组质粒ＤＮＡ，双酶切鉴定正确后测序验证。
１．２．５　农杆菌的转化及ＰＣＲ鉴定
采 用 冻 融 法 将 植 物 表 达 载 体
ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４，在含
有卡那霉素、利福平的ＹＥＢ固体培养基上，２８℃培
养４８ｈ后，挑取阳性克隆，提取质粒后用特异引物
进行ＰＣＲ检测。
２　结果与分析
２．１　目的基因ＡｌｓＣＢＦ 扩增
以野扁桃总ＲＮＡ反转录合成的ｃＤＮＡ第一条
链为模板，用引物ＢＴＱ－Ｆ和ＢＴＱ－Ｒ进行目的基因
的ＰＣＲ扩增，产物经１．０％琼脂糖凝胶电泳，获得
大小约７１３ｂｐ的条带（图１），与预期大小一致。
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～３．目的基因ＰＣＲ产物
图１　ＡｌｓＣＢＦ基因ＰＣＲ扩增
Ｆｉｇ．１　ＰＣＲ　ａｍｐｒｉｆｉｅｄ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ＡｌｓＣＢＦｇｅｎｅ
Ｍ１．ＢＭ１５０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ｍ２．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；１～
２．重组质粒ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１；３～４．双酶切重组质粒
图２　重组质粒ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ酶切鉴定结果
Ｆｉｇ．２　 Ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ
ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ
２．２　野扁桃ＡｌｓＣＢＦ基因植物表达载体的构建与
鉴定
对植物表达载体 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１ 和扩增的
ＰＣＲ产物进行ＢａｍＨ Ⅰ和ＸｂａⅠ双酶切，电泳回
收目的片段，Ｔ４ＤＮＡ连接酶连接，转化大肠杆菌获
得重组质粒。用ＢａｍＨⅠ 和ＸｂａⅠ双酶切重组质
粒，得到一个大小为７１３ｂｐ的条带（图２），结果表明
所得条带与目的基因ＡｌｓＣＢＦ 片段大小相符。对酶
切检测正确的单克隆进行测序，结果显示重组质粒
插入片段与目的基因ＡｌｓＣＢＦ 的序列完全一致。
２．３　表达载体转化农杆菌菌株ＬＢＡ４４０４
采用冻融转化法将表达载体导入农杆菌菌株
ＬＢＡ４４０４，涂 布 在 含 有 ５０ ｍｇ／Ｌ 卡 那 霉 素 和
５０ｍｇ／Ｌ利福平的固体培养基上２８℃培养２～３ｄ
后，进行菌落ＰＣＲ检测，结果表明（图３），所得目的
６６３
　第５期 李　宁，等：野扁桃ＡｌｓＣＢＦ基因植物表达载体的构建
条带与预期大小一致，说明已成功构建ＡｌｓＣＢＦ 基
因的植物表达载体，并导入根癌农杆 菌 菌 株
ＬＢＡ４４０４。
Ｍ．ＤＬ２０００ＤＮＡ　Ｍａｒｋｅｒ；Ａ．阴性对照；１～９．农杆菌中
ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ质粒的ＰＣＲ鉴定
图３　农杆菌ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ转化子的ＰＣＲ鉴定
Ｆｉｇ．３　ＰＣＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｎｔｓ　ｂｙ　ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ
３　小 结
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１是一种常用的植物表达载体，
含有ＣａＭＶ３５Ｓ启动子和Ｎｏｓｔ终止子［１１］。ｐＣＡＭ－
ＢＩＡ１３０１多克隆位点含有限制性内切酶ＢａｍＨ Ⅰ
和Ｘｂａ Ⅰ位点，ＡｌｓＣＢＦ 基因不含限制性内切酶
ＢａｍＨ Ⅰ和ＸｂａⅠ的位点，因此，采用了ＸｂａⅠ和
ＢａｍＨ Ⅰ在同一通用酶切缓冲液中进行分步各１２ｈ
酶切的方案，既可以保证酶切的效率，又减少了回收
的次数，确保了目的片段和载体的有效重组。酶切
后成功地与ｐＣＡＭＢＩＡ１３０１连接。
将重组质粒 ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ 转入农杆菌
ＬＢＡ４４０４中，为下一步农杆菌侵染做好充分的准
备。本研究重组质粒ｐＣＡ１３０１－ＡｌｓＣＢＦ 的成功构
建为进一步通过转基因技术综合改良植物抗寒性奠
定了基础。
参考文献：
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ｓｐｏｎｓｅ　ｅｌｅｍｅｎｔ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ　Ｉ　ｇｅｎｅ　ｃｏｎｆｅｒｓ　ｅｌｅｖａｔｅｄ
ｔｏｌｅｒａｎｃｅ　ｔｏ　ｃｈｉｌｉｎｇ　ａｎｄ　ｏｘｉｄａｔｉｖｅ　ｓｔｒｅｓｓｅｓ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ
ｔｏｍａｔｏ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００２，１２９：１０８６－１０９４．
［６］　Ｌｉｕ　Ｑ，Ｋａｓｕｇａ　Ｍ，Ｓａｋｕｍａ　Ｙ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｗｏ　ｔｒａｎｓｅｒｉｐｔｉｏｎ
ｆａｃｔｏｒｓ，ＤＲＥＢ１ａｎｄ　ＤＲＥＢ２，ｗｉｔｈ　ａｎ　ＥＲＥＢＰ／ＡＰ２
ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｄｏ－ｍａｉｎ　ｓｅｐａｒａｔｅ　ｔｗｏ　ｃｅｌｕｌａｒ　ｓｉｇｎａｌ
ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ　ｐａｓｓ　ｗａｙｓ　ｉｎ　ｄｒｏｕｇｈｔ　ａｎｄ　ｌｏｗ　ｔｅｍｐｅｒａ－
ｔｕｒｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ　ｇｅｎｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔ－ｔｉｖｅｌｙ，ｉｎ　Ａｒａ－
ｂｉｄｏｐｓｉｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌ，１９９８，１０：１３９１－１４０６．
［７］　Ｎａｒｕｓａｋａ　Ｙ，Ｎａｋａｓｈｉｍａ　Ｋ，Ｓｈｉｎｗａｒｉ　Ｚ　Ｋ，ｅｔ　ａｌ．Ｉｎｔｅｒ－
ａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｗｏ　ｃｉｓ－ａｃｔｉｎｇ　ｅｌｅｍｅｎｔｓ，ＡＢＲＥ　ａｎｄ
ＤＲＥ，ｉｎ　ＡＢＡ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｒｄ２９Ａｇｅｎｅ　ｉｎ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ　ｔｏ　ｄｅｈｙｄｒａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｈｉｇｈｓａｌｉｎｉｔｙ
ｓｔｒｅｓｓｅｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ，２００３，３４（２）：１３７－１４８．
［８］　Ｇｉｌｍｏｕｒ　Ｓ　Ｊ，Ｓｅｂｏｌｔ　Ａ　Ｍ，Ｓａｌａｚａｒ　Ｍ　Ｐ，ｅｔ　ａｌ．Ｏｖｅｒｅｘ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＣＢＦ３ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉ－
ｖａｔｏｒ　ｍｉｍｉｃｓ　ｍｕｌｔｉｐ　ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｃｈａｎｇｅｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ　ｃｏｌｄ　ａｃｃｌｉｍａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２０００，１２４：
１８５４－ｌ８６５．
［９］　崔百明．合成启动子及ＣＢＦ异位表达对转基因烟草生
长发育的影响［Ｄ］．广州：华南农业大学，２００６．
［１０］　李疆，曾斌，罗淑萍，等．我国野扁桃资源的保护及引
种繁育［Ｊ］．新疆农业科学，２００６，４３（１）：６１－６２．
［１１］　ＺＨＡＮＧ　Ｊｕｎ－ｌｉａｎ，ＷＡＮＧ　Ｄｉ，ＺＨＡＮＧ　Ｊｉｎ－ｗｅｎ，ｅｔ
ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ＰＢＩ１２１ Ｖｅｃｔｏｒ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
Ｖｅｃｔｏｒ　Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ　Ｎａ＋／Ｈ＋ Ａｎｔｉｐｏｒｔｅｒ　ｏｆ　Ａｒａｂｉ－
ｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ［Ｊ］．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｐｌａｎｔ　Ｂｒｅｅｄｉｎｇ，２００６，４
（６）：８１１－８１８．
［１２］　蒋太交，吉鑫松，黄艳红，等．辣根过氧化物酶同功酶
＆基因克隆及其在大肠杆菌中的表达［Ｊ］．中国生物
化学与分子生物学报，１９９９，１５（３）：３９２－３９７．
［１３］　胡春华，魏岳荣，易干军，等．根癌农杆菌介导的香蕉
高效遗传转化系统的建立［Ｊ］．分子植物育种，２０１０，８
（１）：１７２－１７８．
７６３