全 文 ：分子植物育种，2008年，第6卷，第1期，第95-99页
MolecularPlantBreeding,2008,Vol.6,No.1,95-99
研究报告
ResearchReport
岷江百合根尖染色体的C-分带和FISH分析
刘光欣 胡凤荣 席梦利 吴祝华 池坚 施季森 *
国家教育部和江苏省共建林木遗传和生物技术重点实验室,南京林业大学,南京,210037
*通讯作者,jshi@njfu.edu.cn
摘 要 利用GiemsaC-分带和荧光原位杂交(FISH)的方法对岷江百合(L.regale)根尖染色体进行了研究。
结果表明岷江百合的带型公式为：2n=24=4I+8CI+ 2I+ 6I++2I+T+ 2I+T+，每条染色体都显示出了可以明显区别
的特征带，带纹强弱差异明显。以45SrDNA为探针对岷江百合根尖染色体进行了荧光原位杂交，杂交点数
为5对，分别位于A、B、H和K4对同源染色体的着丝点区域和一对G染色体的长臂上。通过GiemsaC-带
和FISH的方法可以将岷江百合的每条染色体区分开来。
关键词 岷江百合,染色体,C-带分析,荧光原位杂交
GiemsaC-bandingandFISHAnalysisofMinjiangLilyChromosomeby
MeansofRootTips
LiuGuangxin HuFengrong XiMengliWuZhuhua ChiJian ShiJisen*
TheKeyLaboratoryofForestGenetics&Biotechnology,MinistryofEducationandJiangsuGovernment,NanjingForestryUniversity,Nanjing,210037
*Corespondingauthor,jshi@njfu.edu.cn
Abstract GiemsaC-bandingandFISHanalysisoftheMinjianglilychromosomes(Liliumregale)fromroottips
werecariedoutinthisresearch.TheresultsshowedthattheC-bandingkaryotypewouldbe2n=24=4I+8CI+ 2I+
6I++2I+T+ 2I+T+.ThespecificC-bandingpointsoneachchromosomecouldbedistinguishedandthediferencesof
C-bandingintensityalsocouldberecognized.45SrDNAwasusedasprobeforFISHanalysis(fluorescenceinsitu
hybridization),and5couplesofhybridizationsignalsweredisplayedonthechromosomecentrimereofchromo-
someA,B,H,KandthelongarmofGchromosome.InthisresearchwehasaconclusionthatMinjianglilychro-
mosomescanbeeasilydistinguishedandidentifiedbyGiemsaC-bandingandFISHapproaches.
Keywords Minjianglily(LiliumregaleWilson),Chromosome,GiemsaC-banding,FISH
岷江百合(LiliumregaleWilson)原产于四川，又
名王百合。生于海拔800~2500米的河旁和山坡岩石
边，为百合属百合组的鳞茎球根花卉，是多年生草
本，花大喇叭型，花色为纯白色，花朵平展不垂头，园
艺观赏价值高(汪发缵和唐进,1980)。岷江百合对于
病毒病害具有较强的抗性，是优良的育种亲本，正是
由于岷江百合的引入，才使得欧洲百合在困于病毒
蔓延，濒临灭绝惨景下，又重放光彩。在国内百合育
种中，岷江百合也是一直为育种者所重视的杂交亲
本，20世纪80年代，上海园林科研所曾用岷江百合
(L.regale)与玫红百合(L.amoenum)进行种间杂交，培
基金项目：本研究由上海市重点攻关项目(沪农科攻字2006,第4-1号)、江苏省自然科学基金项目(164010028)和国家林业局
“948”项目(2007-4-06)资助
育出花浅玫瑰红色具有鲜红斑点的杂交种；王百合
与兰州百合(L.davidivaruicolor)种间杂交，培育出
生长旺盛，花橙红色的杂交种。与此同时，中国科学
院北京植物园亦开展了王百合×兰州百合、王百合×
山丹和铁炮百合×山丹的种间杂交。由于杂交组合较
少，工作开展的持续性不够，所以至今国内还缺少自
育的商业品种(张延龙和牛立新,2002)。
百合属于大型染色体，是研究遗传与进化的好
材料。在现代分子育种过程中，追踪不同种间染色体
的行为，建立染色体变化与重要观赏性状之间的关
联，是育种学家一直所努力的。此前对岷江百合染色
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
体也主要是对核型的研究，通过核型分析来揭示百
合变异式样及变异规律。前人的研究表明在常规染
色体水平上，虽然看到了岷江百合不同居群间染色
体明显发生了结构变异，但却难以准确定位具体的
哪几条染色体发生了断裂、缺失、倒位和易位(王红
霞和杨保胜,2003)。
本研究对岷江百合的染色体进行了GiemsaC-
带和FISH分析，旨在为岷江百合杂交育种和杂种后
代提供有效的鉴定方法和手段。
1材料与方法
1.1材料
本研究所用的岷江百合(Liliumregale)采集于四
川岷江流域。45SrDNA克隆于水稻，由南京农业大
学王秀娥教授馈赠。
1.2根尖细胞有丝分裂中期染色体制片
染色体C-分带参照Gil等(1991)的方法进行，
略有改动。剪取岷江百合长度约1.5~3cm的幼嫩根
尖，置于盛冰水的10mL离心管中，放入冰水混合物
中预处理。预处理时间选择24h、36h和48h，三个
梯度。卡诺氏固定液(95%乙醇:冰醋酸=3:1)固定。在
压片之前先将固定好的根尖于45%醋酸中解离，解
离时间根据根尖的粗细分为0.5h，1h和2h三个梯
度，45%醋酸压片，在相差镜下镜检。取染色体分散
良好的制片，放入-70℃冰箱冰冻2h后揭片，无水
酒精脱水6h以上，气干，备用。
1.3染色体GiemsaC-分带
将上述处理好的制片在预热至60℃的0.2mol/L
HCl中处理2.5min，蒸馏水冲洗，转入沸水溶解后冷
却至室温(20~25℃)的过饱和(7%)的Ba(OH)2溶液中
处理7min。将制片流水冲洗干净，再放入预热至
60℃的2×SSC溶液60min，然后将制片直接移入磷
酸缓冲液(pH6.8)稀释的FishersGiemsa染液中染色
至适度，取出制片用蒸馏水冲洗，气干。63×镜下观察
并照相。C-分带分析参照李懋学和陈瑞阳(1985)的
方法进行，将 C-带，根据其分布位置，分为 5种类
型，即着丝点带(centromericband)、中间带(intercalary
band)、末端带(telomereband)、次缢痕带(secondary
constrictionband)和随体带(sateliteband)，并分别记
做C、I、T、N和S，若带位于长臂上则在字母的右侧
下标为“+”，若在短臂上有带，则在右侧上标为“+”，
若长短臂上都有带，则不需要注明。利用GiemsaC-
分带的方法对收集到的百合材料进行了分析，对各
条染色体进行了鉴定，并将每个材料的染色体按
A-L进行描述(Stewart,1947)。
1.4染色体荧光原位杂交 (fluorescenceinsituhy-
bridization,FISH)
1.4.1原位杂交染色体制片预处理
染色体制片的方法与GiemsaC-带相同，酶解
方法参照 (Lim,2000;LimandvanTuyl,2002)的方
法，略有改动。将揭片脱水气干后的制片于RNA酶Ⅰ
溶液中(100μg/μL)，37℃酶解 1h；转入胃蛋白酶溶
液(4%)中，37℃酶解10min；4%的多聚甲醛溶液中，
室温处理10min；70%、95%、100%乙醇中梯度脱水，
各3min，气干，备用。
1.4.2探针标记—缺刻平移法
(1)反应液配制：将离心管置于冰上，依次加入：
反应bufer(10×NT)
Reactionbufer(10×NT)
二硫苏糖醇
DTT
dNTPmix
TemplateDNA
DNApolymeraseI
DnaseI(1:1000)
荧光绿
Fluoresceint-12-dUTP
ddH2O
Totalvolumn
5μL
5μL
5μL
1μg
2μL(4U/μL)
1μL
2μL
xμL
50μL
(2)反应液混匀，15℃温育2h。
(3)加入EDTA(pH8.0)5μL，-20℃冰箱保存备用。
1.4.3杂交
(1)配制杂交液(2张制片)
dFA
20×SSC
50%dextrasulfate
SalmonspermDNA
DNAProbe
Totalvolumn
15μL
3μL
3μL
1μL
8μL
30μL
50%
2×SSC
5%
10mg/mL
0.16μg
Finalyconcentrationordosage
将杂交液混匀，100℃沸水中变性10min后，立
即置冰浴中10min以上。
(2)制片变性
将酶解好的制片，于 70%甲酰胺中 78℃变性
96
1min10s，立即转入-20℃的70%、95%、100%酒精
中梯度脱水各5min，气干。
(3)杂交
每张制片滴加15μL杂交液，盖上18mm×18mm
盖玻片，37℃杂交过夜。
1.4.4杂交后洗涤
洗片程序如下：
岷江百合根尖染色体的C-分带和FISH分析
GiemsaC-bandingandFISHAnalysisofMinjiangLilyChromosomebyMeansofRootTips
2×SSC
50%FA
2×SSC
1×PBS
42℃
42℃
42℃
RT
5min
10min
5min
5min
Twotimes
Onetime
Twotimes
Onetime
将制片沥干。
1.4.5套染
利用碘化丙锭(propidiumiodide,PI)(PI母液浓
度10mg/μL)对杂交洗涤后的制片套染，步骤如下：
在999μL1×PBS中加入1.2μLPI母液 (PI母液浓
度10mg/μL)混匀，配成终浓度为100μg/mL的染
液，每片加500μL，染色2min，1×PBS冲洗4~5次，
滴10μLVECTAshield胶，盖上20mm×20mm盖片
后，在OlympusBX60型荧光显微镜下用450~490nm
激发光波长观察。用SPOTCCD(SPOTCooledCol-
orDigitalCamera)摄取图象。
2结果与分析
岷江百合染色体GiemsaC-分带结果如图1所
图1岷江百合(L.regale)C-分带结果
Figure1C-bandingobservationsofMinjianglily(L.regale)
示。根据岷江百合(L.regale)各染色体的C-分带主
要特征，带型公式可描述为：2n=24=4I+8CI+ 2I+ 6I++
2I+T+ 2I+T+。其单套染色体的条带总数目为24条。借
助于带型分析、染色体长度及臂比，将岷江百合染色
体带型分析如图2，转换成模式图3。由图2、3可以
看出，岷江百合每条染色体上都显示出显著的特征
带，且带纹的深浅差异明显。其中染色体B、E、G、H、
K和L都显示出极强的带纹，其它染色体带纹稍弱，
但带型也很丰富，其中J染色体有三条较弱的中间
带和一条末端带，这与李懋学等(1984)的结果有一定
差异，染色体间带纹差异明显。
图2岷江百合(L.regale)的C-带带型分析图
Figure2C-bandinganalysisofMinjianglily(L.regale)
图3岷江百合(L.regale)C-分带模式图
Figure3C-bandingpaternofMinjianglily(L.regale)
另外，以45SrDNA为探针，对岷江百合进行荧
光原位杂交，结果如图4、5所示，杂交点数为10，分
图4岷江百合(L.regale)FISH结果
Figure4FISHresultofMinjianglily(L.regale)
97
分子植物育种
MolecularPlantBreeding
别位于一对A、B、H和K染色体的着丝点区域以及
一对G染色体长臂的近末端。10个杂交点强弱的差
异并不明显。
图5岷江百合(L.regale)45SrDNA荧光原位杂交
Figure5FISHof45SrDNA-bearingchromosomesofMinjiang
lily(L.regale)
3讨论
GiemsaC-带主要显示染色体上由重复 DNA
序列组成的异染色质，组成型异染色质主要分布在
染色体末端和着丝点附近。由于C-分带带型在同一
物种内具有相对稳定性，而在种间具有丰富的多态
性，因而可以作为物种鉴别的一种工具。目前，对于
百合资源染色体组的研究主要集中于核型分析。
Lim(2000)对麝香百合(L.longiflorum)和红花百合(L.
rubelu)进行了GiemsaC-分带分析，但是仅仅得到
了11条很浅的带纹。核型分析主要是借助于染色体
的长度，着丝点及次缢痕的位置来区分染色体。多种
百合染色体的核型分析表明，许多百合的染色体在
长度以及臂比方面差异并不大 (虞泓等,2000;杨利
平等,1996)，这给利用核型区分染色体带来了很大
难度。通常情况下，仅利用核型分析无法对百合杂种
后代染色体的来源以及缺失易位等结构变异进行鉴
定(王红霞和杨保胜,2003)。
本试验利用GiemsaC-分带方法对岷江百合根
尖染色体进行处理，单套染色体显示出了24条带
纹，且每条染色体都显示出特征带，带纹强弱差异明
显。李懋学等(1984)对含B和不含B染色体的岷江
百合进行了GiemsaC-分带分析，得到25条带纹，
这与本研究的结果基本相同，但J染色体上显示的
带纹差异较大。李懋学等(1984)的结果中J染色体上
没有带纹显示，而本实验中，J染色体显示出明显的
四条带纹(图2、3)。推测是由于种源不同或者是C-
分带流程的差异所造成的。
荧光原位杂交(FISH)是分子遗传学与细胞遗传
学相结合的一门技术，已广泛应用于细胞遗传学、肿
瘤生物学、基因定位、基因作图、基因扩增、产前诊断
及哺乳动物染色体进化研究等领域 (王忠华等,
2001)。
荧光原位杂交技术直接从DNA水平上检测染
色体的构成和变化情况，可以准确地显现异源染色
体或其片段存在于染色体(组)中的部位(韩方普等,
1998;Friebeetal.,1991;1996;Jiangetal.,1993;刘光
欣等,2006)，对染色体或染色体片段的遗传变化分
析起着重要的作用。
在高等真核生物中，核糖体是合成蛋白质的场
所。一个完整的核糖体由60S、40S大小亚基组成，构
成核糖体亚基的主要成分是核糖体-RNA(rRNA)与
蛋白质的复合物。其中rRNA有4种类型,即 18S
rRNA、5.8SrRNA、28SrRNA和5SrRNA。18SrRNA
位于小亚基40S上，其它3种位于大亚基60S上。编
码这几种rRNA的基因有2种，一种为45SrDNA，
另一种为5SrDNA。其中45SrDNA是串联重复序
列，它位于核仁组织区上(LongandDaw,1980)，每个
重复单位依次编码18S、5.8S和28SrRNA。
前人研究发现二倍体被子植物一般拥有1~5对
45SrDNA位点 (CastilhoandHeslop-Harison,1995;
Linaresetal.,1996;Ricrochetal,1992;Zhangand
Sang,1999)。Lim(2000)以5S和45SrDNA为探针，
对麝香百合(L.longiflorum)和红花百合(L.rubelum)
进行了研究；Marasek等 (2004)以5S和25SrDNA
为探针，对湖北百合(L.henryi)、“MarcoPolo”和“Ex-
pression”进行了研究。本研究表明45SrDNA在岷江
百合根尖染色体上有5对杂交信号，这与前人的研
究结果相一致。
将C-带和FISH分析相结合可以对岷江百合的
染色体进行有效的鉴定，为百合杂交育种后代鉴定、
染色体追踪及其基因的染色体定位提供了技术平台。
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