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葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及生理特性研究



全 文 :西北林学院学报 2013,28(4):32~37
Journal of Northwest Forestry University
  doi:10.3969/j.issn.1001-7461.2013.04.07
 收稿日期:2013-11-30 修回日期:2013-01-12
 基金项目:西安园林观赏花卉示范园建设子项目(NC10031-2)。
 作者简介:张雯,女,硕士研究生,研究方向:植物生理。E-mail:529709937@qq.com
*通信作者:周存田,男,高级实验师,研究方向:采后处理。E-mail:zhoucuntian1959@163.com
葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及生理特性研究
张 雯1,周存田1*,王 飞1,杨凤美2,3,酒立君2,鲍遵宇1,李志根2
(1.西北农林科技大学 园艺学院,陕西杨凌712100;2.西北农林科技大学 林学院,陕西 杨陵712100;3.南郑县林业局,陕西 南郑723106)
摘 要:以葡萄风信子“蓝穗”叶片为材料,分别对器官发生和体胚胎发生过程中不同时期超氧化物
岐化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶活性(POD)、可溶性糖和可溶性蛋白质含量进行
测定,并对2种途径中的典型时期进行解剖结构观察。结果表明:抗氧化酶类活性、可溶性糖和蛋
白质含量与植物细胞形态发生密切相关;在不定芽分化和体胚发生初期,胚性愈伤的POD、SOD活
性与可溶性蛋白质含量显著高于非胚性愈伤组织。此外,器官发生和体胚发生途径差异在愈伤组
织形成期已开始产生,说明该期是器官和体细胞胚发生关键的调控时期。因而可通过向培养体系
中加入不同激素、糖或蛋白等物质,进而调节植物细胞生理代谢方向,达到影响培养物形态发生的
目的。
关键词:葡萄风信子;器官发生;体胚发生;生理特性
中图分类号:S682.29   文献标志码:A   文章编号:1001-7461(2013)04-0032-06
Physiological Characteristics of Organogenesis and Somatic Embryogenesis in Muscari botryoides
ZHANG Wen1,ZHOU Cun-tian1*,WANG Fei 1,YANG Feng-mei 2,3,JIU Li-jun2,BAO Zun-yu1,LI Zhi-gen2
(1.College of Horticulture,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,China;
2.College of Forestry,Northwest A&F University,Yangling,Shaanxi 712100,china;
3.Nanzheng County Forestry Bureau,Nanzheng,Shaanxi 723106,China)
Abstract:Taking the leaves of Muscari armeniacumcv.Blue Spike as experimental materials,the activities
of superoxide dismutase(SOD),catalase(CAT)and peroxidase(POD),and the contents of soluble sugar
and protein were measured in different stages of organogenesis and somatic embryogenesis.Anatomical
structures were also observed during the typical stages of the two processes.The results demonstrated that
that the SOD,POD and CAT activities,and soluble sugar,and protein contents were closely related to plant
morphogenesis.In the initial stages,the levels of three antioxidant enzymes,soluble sugar,and protein were
higher in embryonic calus than those in non-embryonic calus.The difference already appeared at calus
formative period,indicating that calus formative period played an important role on regulation of organo-
genesis and somatic embryogenesis.Metabolisms in the plant cels may be regulated by adding different
hormones,sugar,or protein in culturing systems to alter morphogenesis of the cultures.
Key words:Muscari armeniacum;organogenesis;somatic embryogenesis;physiological characteristic
   葡萄风信子是百合科(Liliaceae)蓝壶花属,作
为良好的林下地被与园林花卉,具有较高观赏价值,
传统繁殖方法为球茎繁殖,但因无性繁殖易积累病
毒、繁殖率低以及优良种性易退化,利用组织培养可
解决此问题。组织培养有器官发生与体细胞发生2
种繁殖方式,葡萄风信子器官发生的研究有部分报
道,但有关体细胞胚的诱导以及发生过程的生理生
化特性报道极少,只有S.Suzuki[1-2]等人进行了相
关研究,而在其他植物中已有相关报道[3-7]。因此,
本试验以葡萄风信子“蓝穗”叶片为材料,对不同时
期的器官发生和体细胞胚胎发生过程进行相关生理
生化特性和细胞形态学观察,以明确2种发生途径
中植物细胞内抗氧化酶活性以及可溶性糖和蛋白质
的变化规律,为不定芽诱导和体细胞胚诱导的调控
提供依据,并为建立稳定高效的葡萄风信子体细胞
胚胎发生体系提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
以葡萄风信子“蓝穗”(Muscari armeniacum
cv.Blue Spike)的叶片为材料。
1.2 方法
1.2.1 葡萄风信子不定芽和体细胞胚胎的诱导 
葡萄风信子不定芽的诱导是采用许胜[5]等的方法:
体细胞胚的培养过程是将消毒后的叶片接种在 MS
+0.6mg·L-12,4-D+0.1mg·L-16-BA培养基
中,7d后逐渐开始在切口处形成淡黄色愈伤组织,
继代2次后,可观察到2种不同形态的愈伤:白色紧
实愈伤组织和淡黄色松散愈伤组织。将2种愈伤组
织分别转入不含任何激素的 MS培养基中遮光培
养,再继代1~2次后,白色紧实愈伤组织表面开始
形成体细胞胚胎,随后将形成的细胞胚胎转接到生
根培养基 MS+0.2mg·L-1 NAA+0.1mg·L-1
IBA中生根、形成小鳞茎、植株。
1.2.2 细胞结构观察 采用Olympus体式显微镜
进行体胚发育各阶段的观察。同时选取体胚发生途
径中胚性愈伤组织、球形胚、棒状胚以及器官发生途
径中非胚性愈伤组织以及带有芽点的非胚性愈伤组
织进行常规石蜡切片[8],材料用FAA固定液固定,
纵切切片厚度8~10μm,番红固绿染色,加拿大树
胶封片,用Olympus光学显微镜观察并拍照。
1.2.3 生理生化指标测定 选取器官发生过程中
6个不同时期的材料:叶片(A1)、非胚型愈伤组织形
成期(B1)、芽点形成期(C1)、不定芽形成期(D1)、小
苗形成期(无根)(E1)、完整植株形成期(已形成根)
(F1)。以及体细胞胚胎发生过程中6个不同时期的
材料:叶片(A2)、胚性愈伤组织形成期(B2)、球形胚
形成期(C2)、棒状胚形成期(D2)、小苗形成期(无小
鳞茎与根)(E2)、完整植株形成期(已形成小鳞茎与
根)(F2)。
将以上不同时期的材料分别准确称取0.3g放
置于冰浴上,加入PBS(pH值7.8,含1%PVP)缓
冲液及少许石英进行研磨,定容至4mL,充分混匀
后,于12 000r·min-1离心30min,取上清液用于
抗氧化酶类活性及可溶性蛋白质含量的测定。SOD
活性测定用NBT光还原法[9];CAT活性采用过氧
化氢氧化法[9];POD活性测定采用氧化愈创木酚
法[9];可溶性蛋白质含量,选用考马斯亮蓝比色
法[10]。
同时称取如上不同时期的材料0.1g,加入
80%乙醇研磨、定容、水浴、离心15min,取上清液
进行蒽酮比色法进行可溶性糖含量测定[10]。
1.3 数据处理
数据为3次重复的平均值,采用SPSS13.0软
件进行方差分析,并用新复极差法进行显著性检测,
不同小写字母代表在p<0.05水平上差异显著。
2 结果与分析
2.1 葡萄风信子叶片诱导体细胞胚胎发生及植株
再生
图1是体视镜下观察的不同形态的体细胞胚。
首先是由叶片托分化形成而形成的的愈伤组织,并
形成少量具有白色绒毛的根(图1-A)。经过2次继
代,形成白色愈伤组织(图1-B)。然后在愈伤组织
表面观察到的间接发生的体细胞胚胎(图1-C)。葡
萄风信子为单子叶植物,其体细胞胚胎发生经历了
典型的单子叶植物胚发育阶段,即球形胚(图1-C)、
偏梨形胚(图1-D),鱼雷期(图1-E)和棒状胚(图1-
F)这3个阶段。在体细胞胚胎的发育过程中,还观
察到葡萄风信子可形成具有鳞叶包裹的成熟小鳞茎
(图1-G),最后发育成为成熟小植株(图1-H)。
A.叶片诱导形成的胚性愈伤B.白色愈伤组织×20C.球形胚×
10D.偏梨形胚×20E.鱼雷期×10F.棒状胚×8G.成熟小植
株×8H.体细胞胚形成的植株
图1 葡萄风信子叶片诱导体细胞胚胎发生及植株再生
Fig.1 Somatic embryogenesis and plant regeneration from
the leaves of M.armeniacumcv.Blue Spike.
2.2 细胞结构观察
经组织切片观察发现,非胚性愈伤组织(图2-
A)和胚性愈伤组织(图2-B)结构差异明显。胚性愈
伤组织体积相对较小,细胞排列紧密规则,大小均
一,细胞核增大、居中,核仁明显,细胞壁显著增厚,
细胞质浓厚。而非胚性愈伤组织细胞较大壁薄,细
33第4期 张 雯 等:葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及生理特性研究
胞排列不规则,形状不一,细胞核小且位于边缘,细
胞质稀薄且近壁分布,有中央大液泡。
非胚性愈伤进一步发育分化,可观察到不定芽
(图2-C),细胞排列紧密,质浓,突出愈伤组织表面,
但与周围细胞未有明显界限。胚性愈伤组织继续培
养,获得球形胚(图2-D),球形胚为生长旺盛的胚性
愈伤突出于愈伤组织表面形成,有明显孤立化,但并
不脱离愈伤组织。球形胚进一步发育偏梨形胚(图
2-E)和伸长形成棒状胚(图2-F)。
A.非胚性愈伤组织×40B.胚性愈伤组织×40C.不定芽×10D.球形胚×20E偏梨形胚×4F.棒状胚×4
图2 葡萄风信子器官发生途径和体细胞胚胎发生途径关键时期的细胞形态学观察
Fig.2 Histological structures of several stages during organogenesis and somatic embryogenesis
2.3 器官发生和体胚发生中不同时期抗氧化物酶
类活性变化
2.3.1 SOD酶活性的变化 图3显示的是葡萄风
信子植株再生途径中两种繁殖方式的SOD活性变
化,从图中可看到器官发生各阶段SOD活性随着发
育时间的增加,而非胚型愈伤组织形成期(图3-B1)
和完整植株形成期(已形成根)(图3-F1)减少,但在
芽点形成期(图3-C1)、不定芽形成期(图3-D1)、小
苗形成期(无根)(图3-E1)SOD活性变化较稳定。
而SOD活性在体胚发生途径中表现出在棒状胚形
成期(图3-D2)最高。SOD活性的增加与细胞分化
频率成正比[11],说明高SOD活性对体胚的发育与
成熟发生起了重要的作用。2种途径中的SOD活
性从愈伤组织形成期开始直到完整植株形成期均保
持差异,且差异显著。
2.3.2 CAT酶活性的变化 图4所示,3种植株再
生途径中CAT 活性在A1、A2、B1、B2、C1、C2、E1、E2
与F1、F2 阶段变化不大,仅在不定芽形成期(图4-D1)
和棒状胚形成期(图4-D2)急剧升高出现峰值而后迅
速回落。表明高CAT活性在促进器官不定芽的形成
以及体细胞胚的发育成熟中起重要作用。
图3 葡萄风信子植株再生途径中外植体
SOD活性的变化
Fig.3 Changes in activity of SOD in explants of M.armeniacum
cv.Blue Spike during different develop stages
2.3.3 POD酶活性的变化 图5表明,体胚发生
过程中POD活性在胚性愈伤组织形成期(图5-B2)
以及球形胚形成期(图5-C2)显著高于器官发生途
径的非胚性愈伤组织形成期(图5-B1)与芽点形成
期(图5-C1),非胚性愈伤组织形成期(图5-B1)在整
个器官发生过程中最高,而后下降并维持稳定。说
明POD活性的高低对不定芽和体细胞胚的诱导起
着重要调节作用。另外两种途径的POD活性在胚
43 西北林学院学报 28卷 
图4 葡萄风信子植株再生途径中
外植体CAT酶活性的变化
Fig.4 Changes in activity of CAT in explants of M.
armeniaeumcv.Blue Spike during different develop stages
性愈伤组织形成期(图5-B2)与非胚性愈伤组织形
成期(图5-B1),以及芽点形成期(图5-C1)与球形胚
形成期(图5-C2)诱导时期存在显著差异,这种差异
表明POD活性在确定是否形成胚性组织还是非胚
性组织上起决定性作用。可作为胚性组织还是非胚
性组织上的预选指标之一。
图5 葡萄风信子植株再生途径中外植体
POD酶活性的变化
Fig.5 Changes in activity of POD in explants of M.
armeniacumcv.Blue Spike during different develop stages
2.4 器官发生和体胚发生中不同时期可溶性糖与
可溶性蛋白含量变化
2.4.1 可溶性糖含量的变化 糖含量的积累预示
着培养物即将进入新的发育状态。由图6看出,不
定芽诱导过程和体胚发生过程中可溶性糖含量变化
趋势基本一致,在整个发育进程中有2个积累高峰。
第1次积累高峰期在器官发生途径与体胚发生途径
胚性愈伤形成期(图6中B1)(图6中B2),说明体胚
发生过程与不定芽诱导过程均需积累物质能量。第
2次积累高峰是在小苗期(图6中 E1)与(图6中
E2),这次的糖积累是为小苗生根形成完整植株提
供物质能量基础,从整个发育过程中看,可溶性糖含
量一直处于较高的变化动态,说明器官发生与体胚
发生过程均需较高的糖浓度。
图6 葡萄风信子植株再生途径中
外植体可溶性糖含量的变化
Fig.6 Changes in the content of water-soluble sugar in explants
of M.armeniacumBlue Spike during different develop stages
2.4.2 可溶性蛋白质含量的变化 图7中看出,在
器官发生初期,可溶性蛋白质仅在芽点形成期(图7
中C1)有较高含量;体胚发生初期,蛋白质则一直处
于较高水平(图7中A2、C2 和D2)。说明体细胞胚
诱导在胚性愈伤组织形成期(图7中B2)开始就需
较多的可溶性蛋白质,而器官发生途径的不定芽在
芽点形成期(图7中C1)也需更多的可溶性蛋白质,
只有这样,才能为体细胞胚的诱导以及不定芽的诱
导提供一定的能量,促进体细胞胚的诱导以及不定
芽的进一步诱导与发育。
图7 葡萄风信子植株再生途径中外植体
可溶性蛋白含量的变化
F  ig.7 Changes in the content of water-soluble protein in explants
of M.armeniacumBlue Spike during different develop stages
3 结论与讨论
詹园凤[6]等研究发现大蒜体胚发生过程中
SOD和CAT活性变化趋势基本一致,而POD活性
变化则相反,POD对胚性愈伤组织的诱导起主导作
用,而SOD和CAT对体胚的发育和成熟起关键作
用。本研究中得到类似结果,在器官发生和体胚发
生过程中,POD活性均在外植体脱分化时期急剧上
升达高峰后逐渐下降;CAT和SOD活性则是先处
于较低水平而后逐步上升达到高峰。表明POD对
53第4期 张 雯 等:葡萄风信子器官和体胚发生的解剖及生理特性研究
分化不定芽和体细胞胚胎的诱导有促进作用,CAT
和SOD活性对不定芽生长和体细胞胚的发育成熟
起主要促进作用,即抗氧化酶类对不同时期的器官
发生和体胚发生有促进作用。但是崔凯荣[12]等在
对枸杞体胚发生的研究中发现,SOD活性的变化趋
势正好与POD和CAT活性的变化趋势相反,另外
刘福平[7]等在蝴蝶兰的研究中也得到SOD活性是
影响抗氧化能力的主要因素,与本研究结果不一致。
分析其原因可能是不同植物中的抗氧化酶代谢方式
不同所致。
2种发生途径中可溶性糖含量的变化均在细胞
脱分化时期上升较高,而后在小苗形成期再升高,可
溶性糖在细胞分化早期出现第一次积累,说明此时
细胞内大量合成糖类物质,为细胞分裂和发育提供
物质和能量基础,不定芽和体细胞胚成熟期可溶性
糖再次升高,表明可溶性糖为形成完整植株这一新
的阶段提供了物质能量准备。可溶性蛋白质含量分
别在芽点形成期和棒状胚形成期达到峰值,其后下
降,表明可溶性蛋白的积累为不定芽和体细胞胚胎
的进一步发育提供了物质基础。由此可见,不同的
发生途径中,细胞内的抗氧化酶类活性、可溶性糖和
蛋白含量与植物细胞的形态发生有密切联系。龚一
富[13]等研究结果认为氧化酶活性、可溶性糖与蛋白
质含量、激素通过调节基因表达,导致细胞内一系列
复杂的生理生化变化,从而调节植物体细胞在离体
培养条件下的形态发生过程,这种观点与本实验研
究结果一致。
李茜[14]等对白皮松的研究中发现胚性愈伤组
织生理生化活性高于非胚性愈伤组织。本研究结果
表明,抗氧化酶活性,可溶性糖和可溶性蛋白质含量
在器官发生和体胚发生途径中存在差异,差异在愈
伤组织形成期已产生。在分化不定芽和体细胞胚初
期,胚性愈伤组织的POD、SOD活性以及可溶性蛋
白质含量显著高于非胚性愈伤组织,这与对石刁柏
和小麦等[15-17]的测定结果是一致的;通过石蜡组织
切片观察亦发现,相对于非胚性细胞,胚性细胞大多
含有2个或2个以上细胞核、体积小且染色更深。
说明胚性愈伤组织比非胚性愈伤组织生理代谢旺
盛。研究表明,蛋白质、核酸、糖类物质以及POD活
性等物质的生理生化变化的高低与植物细胞经过愈
伤组织分化形成胚性愈伤组织还是非胚性愈伤组织
这一途径的形态发生密切相关[18]。通过试验得出,
愈伤组织形成期是调控葡萄风信子器官发生或体胚
发生的关键时期。
综上所述,在愈伤组织形成初期,可通过向培养
体系中加入不同激素、糖或蛋白等物质,进而调节植
物细胞生理代谢方向,达到影响培养物形态发生的
目的。但若要探讨器官发生和体胚发生的调控机
理,则有待从分子水平加以深入研究。
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