全 文 :食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry 研究与探讨
104 2007年第 09期
苦荞蛋白水解过程及其水解产物
抗氧化活性的初探
周小理 1 ,李红敏 1, 2 ,周一鸣3
(1.上海应用技术学院 , 上海 200235;2.上海水产大学 ,上海 200090;
3.陕西师范大学 ,陕西西安 710062)
摘 要:阐述了以多肽浓度和水解度(DH)为评价指标, 采用木瓜
蛋白酶将苦荞麦蛋白水解成为低分子量的苦荞麦多肽的过
程。分别对加酶量、pH、固液比、温度、酶解时间五个因素
对木瓜蛋白酶酶解效果的影响进行了研究 , 确定出其适宜
工艺条件;并采用亚油酸-硫氰酸铁法确定所制得的苦荞
麦多肽液在脂类中的抗氧化活性。
关键词:苦荞多肽 ,多肽浓度 ,水解度 ,酶解,抗氧化活性 Abstract:Theoptimum conditionsofpapainonbuckwheat
proteinandantioxidantactivityofthehydrolysate
werestudied.Theefectofenzymeamount, pH,
time, temperature, substrate︰ solventofpapainon
buckwheatproteinwasstudiedaccordingtopeptide
concentrationand hydrolysisdegree(DH).The
antioxidantactivityofbuckwheatpeptidesinlipidwas
determinedusinglinoleicacid-KSCNmethod.
Keywords:tartarybuckwheatpeptide;peptideconcentration;
hydrolysisdegree;enzymolysis;antioxidantactivity 中图分类号:TS201.2+ 5 文献标识码:A
文 章编 号:1002-0306(2007)09-0104-04
收稿日期:2007-04-05
作者简介:周小理(1957-),女 ,教授 ,主要从事食品资源的研究开发。
荞麦又叫三角麦 , 是粮药兼备资源。荞麦起源
于中国 ,在中国各地均有种植 ,面积和产量居世界第
二位。荞麦的营养成分丰富。目前对荞麦蛋白生理
功能的研究已证明荞麦蛋白具有显著降低血液胆固
醇浓度的功效 ,且效果优于大豆蛋白 [ 1] ;具有降低血
糖的作用 [ 2 ] ;有较低的消化率 ,具有膳食纤维的作用;
抑制脂肪蓄积的作用;改善便秘的作用;防止脂类过
氧化的作用 [ 3] ;抑制大肠癌发生的作用 [4 ] ;减少胆结
石的作用 [ 5 ] ;对生物体有一定营养和抗衰老作用 [6 ] 。
最近 ,具备抗氧化活性功能的多肽是食品界研究的
热点之一。目前国内外已经有很多关于从动物和植
物中制取抗氧化多肽的报道 ,如从蚕茧层中制取抗
氧化多肽 [ 7] ,从玉米蛋白粉中制得玉米抗氧化肽 [ 8]以
及从菜籽中制取菜籽抗氧化肽等等 [ 9 ] ,但尚未有关于
苦荞麦抗氧化多肽的研究报道 。本研究以多肽浓度
和水解度(DH)作为评价指标 ,采用木瓜蛋白酶将苦
荞麦蛋白水解成为低分子量的苦荞麦多肽 ,探寻加
酶量 、pH、固液比 、温度 、酶解时间五因素对木瓜蛋白
酶酶解效果的影响 ,从而确定出酶法制备苦荞多肽
的适宜工艺条件 ,并采用亚油酸-硫氰酸铁法测定酶
法制得的苦荞麦多肽液的抗氧化活性 。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
荞麦复合蛋白草药 自制;木瓜蛋白酶 Novo
公司;盐酸 、三氯乙酸(TCA) 上海凌峰化学试剂有
限公司;茚三酮 、四肽标准物(BR) 国药集团化学
试剂有限公司;L-酪氨酸(生化试剂 BR)、亚油酸
Sigma公司。
754型分光光度仪 上海箐化科技仪器有限公
司;TL-18M型台式高速冷冻离心机 上海市离心机
械研究所 。
1.2 实验方法
1.2.1 酶解液多肽浓度的测定
1.2.1.1 多肽标准曲线的绘制 称取 Gly-Gly-Try-
Arg标准物 0.5000g,溶解 ,并用 50mL容量瓶定容至
50mL,即 10mg/mL,分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、
1.2、1.4、 1.6、 1.8mL标准溶液于试管中 , 加水补足
6mL,各加入双缩脲试剂 4mL,混合摇匀后 ,在室温条
件下放置 30min后 ,采用 754型分光光度计测定光密
度(540nm)。根据光密度值与多肽浓度绘制标准
曲线 。
1.2.1.2 酶解液多肽浓度的测定 吸取酶解液 4mL,
加入 1mL10%TCA溶液 ,沉淀酶解液中的大分子蛋
白质及大分子物质 ,以 3000r/min离心沉淀 10min,
然后吸取上清液 1mL,加入 5mL水 ,再加入 4mL双缩
脲试剂 ,混合摇匀后 ,在室温条件下放置 30min,用
754型分光光度计进行光密度测定(540nm),同时做
空白 。酶解液多肽浓度是根据光密度值在标准曲线
DOI :10.13386/j.issn1002-0306.2007.09.045
研究与探讨 食品工业科技Vol.28 , No.09 , 2007
2007年第 09期 105
查得的毫克数 ,再乘以稀释倍数得出 。
1.2.2 酶解液 -NH2的测定
1.2.2.1 酪氨酸标准曲线的绘制 称取 0.0500g酪氨
酸(BR),溶解并定容至 50mL,所得浓度为 1mg/mL,
分别吸取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mL标准溶液
于试管中 ,加水补足 4mL,加入 pH8.0的缓冲液 1mL,
再加入 1mL1.5%茚三酮溶液 ,然后在沸水浴中水浴
加热 15min后取出 ,并冷却至室温 ,用比色管定容至
50mL,再用 754型分光光度计进行光密度测定
(570nm)。根据光密度值与酪氨酸浓度绘制标准
曲线。
1.2.2.2 苦荞麦复合蛋白酸解液 -NH2总量的测定
称取 1.3711g苦荞麦复合蛋白 ,加入 6mol/L的盐
酸 100mL,放入 85℃的恒温干燥箱中 ,加热消化 24h,
取出冷却 ,过滤除去不溶物 ,然后用真空旋转蒸发器
浓缩至 10mL, 用 40%NaOH调 pH至中性 , 定容至
100mL,此即为酸解原液 。吸取 10.0mL原液 ,定容至
50mL,即为 1∶5稀释液 ,吸取稀释液 1mL于试管中 ,
加水补足 4mL, 加入 pH8.0的缓冲液 1mL,再加入
1mL1.5%茚三酮溶液 , 然后在沸水浴中水浴加热
15min后取出 , 并冷却至室温 , 用比色管定容至
50mL,再用 754型分光光度计进行光密度测定
(570nm),同时做空白 。
1.2.2.3 酶解液中 -NH2 总量的测定 吸取 4mL酶
解液 ,加入 1mL10%TCA,沉淀酶解液中的大分子蛋
白质和大分子物质 , 然后以 3000r/min离心沉淀
10min, 再吸取上清液 1mL, 加水补足 4mL, 加入
1mLpH8.0的缓冲液 ,再加入 1mL1.5%茚三酮试剂 ,
然后在沸水浴中水浴加热 15min后取出 ,并冷却至
室温 ,用比色管定容至 50mL,用 754型分光光度计进
行光密度测定(570nm),同时做空白。
1.2.2.4 DH的计算 DH的计算是根据光密度值在
标准曲线上查得酪氨酸的浓度 ,乘以稀释倍数 ,再根
据下式计算:
DH=酶解上清液中的总 -NH2 量 /苦荞麦复合
蛋白总 -NH2量 ×100%
1.2.3 木瓜蛋白酶的水解工艺研究 以多肽浓度和
DH为指标 ,运用单因素实验选择和确定木瓜蛋白酶
酶解苦荞麦复合蛋白的适宜加酶量 、pH、固液比 、温
度及酶解时间。
1.2.4 抗氧化活性测定方法———亚油酸过氧化
反应 [ 10]
1.2.4.1 亚油酸过氧化反应 在 5mL具塞玻璃试管
中加入 1.5mL0.15mol/L(pH7)的磷酸盐缓冲液 ,加
入待测苦荞麦多肽液样品 100μL, 加入 100μL
50mmol/L亚油酸的乙醇溶液和 30μL50mmol/L的
FeCl2-EDTA溶液 ,采用漩涡分散器振荡后 ,盖上玻
盖 ,于 50℃暗处水浴保温 ,记录保温时间 。
1.2.4.2 苦荞麦多肽液抗氧化活性检测 另取一支
普通试管 , 加入 3mL75%乙醇 、 100μL上述混合液 ,
100μL1mol/LFeCl2 的 1.0mol/LHCl溶液 , 100μL
30%KSCN,采用漩涡分散器振荡后 ,立即计时 , 3min
后用蒸馏水作参比 ,在 480nm处测定溶液的吸光度
A0抗氧化剂空白的吸光度为 A0 ,加抗氧化剂时吸光
度为 AS,抗氧化活力 AA(antioxidantactivity)可用公
式表示:
AA=(A0 -AS)A0 ×100%
2 结果与讨论
2.1 多肽标准曲线
见图 1。
图 1 多肽标准曲线
2.2 酪氨酸标准曲线
见图 2。
图 2 酪氨酸标准曲线
2.3 荞麦复合蛋白酶解液 -NH2总量的测定
荞麦复合蛋白总 -NH2的测定结果为:在含有
1.3711g荞麦复合蛋白的酶解液中 , -NH2 总量为
37.5mg,其 OD570值为 0.284。
2.4 木瓜蛋白酶酶解的适宜工艺
2.4.1 不同加酶量对酶解效果的影响 酶解条件为
固液比 1∶9, pH6.0,温度 60℃,酶解时间 4h,结果见
表 1。
表 1 加酶量对酶解效果的影响
酶加量(U/g) 多肽浓度(mg/mL) DH(%)
6167.8 4.62 16.82
11810.7 5.16 23.93
17492.2 5.38 26.67
23164 5.73 33.64
29017.1 5.76 31.34
37118.2 5.76 31.47
44881.0 5.87 30.96
从表 1看出 ,随着加酶量的增加 ,多肽浓度也随
之增加 ,当达到 23164U/g底物加量时 , 多肽浓度达
到了最高点 ,此后 ,随着加酶量的继续增加 ,多肽浓
度的增加变缓;此外 , DH的增加变化趋势与多肽总
量的变化也基本相同。故选择 23164U/g作为适宜
加酶量。
2.4.2 pH对酶解效果的影响 酶解条件为固液比
1∶9,酶解温度 65℃,酶解时间 4h,结果见表 2。
食品工业科技
ScienceandTechnologyofFoodIndustry 研究与探讨
106 2007年第 09期
表 2 pH对酶解效果的影响
pH 多肽浓度(mg/mL) DH(%)
5.0 4.70 21.65
5.5 6.98 29.86
6.0 5.46 25.74
6.5 4.40 16.08
木瓜蛋白酶的最佳酶解 pH是偏酸性的 ,故从
表 2实验结果来看 ,当 pH为 5.5的时候 ,多肽浓度和
DH都达到了最好的效果 。
2.4.3 底物固液比对酶解效果的影响 酶解条件为
pH5.5,酶解温度 60℃,酶解时间 4h,结果见表 3。
表 3 底物固液比对酶解效果的影响
固液比 多肽总量(mg) DH(%)
1∶6 116.43 26.91
1∶9 139.92 26.95
1∶12 154.13 24.94
1∶15 143.15 25.99
从表 3实验结果来看 ,随着底物固液比的增加 ,
多肽总量也随之增加 ,但当底物固液比到达 1∶12时 ,
多肽总量达到最高点 ,当底物固液比到达 1∶15时 ,多
肽总量有所下降 。 DH的增加趋势与多肽总量基本
相同。故得出当底物固液比为 1∶12时酶解效果
最好。
2.4.4 酶解时间对酶解效果的影响 酶解条件为固
液比 1∶12, pH5.5,酶解温度 50℃,结果见表 4。
表 4 酶解时间对酶解效果的影响
酶解时间(h) 多肽浓度(mg/mL) DH(%)
1 5.82 28.69
2 5.82 28.77
3 6.09 28.40
4 6.28 30.59
5 6.14 30.61
6 5.93 29.79
从表 4可看出 ,当其它酶解条件不变时 ,随着酶
解时间的推移 ,多肽浓度不断增加 ,到达 4h时 ,多肽
浓度达到最高点 ,即 6.28mg/mL。然后随着时间的增
加 ,多肽浓度不再上升 ,反而有所下降 , DH的增加
趋势与多肽总量基本相同。故得出酶解 4h时酶解
效果最好。
2.4.5 酶解温度对酶解效果的影响 酶解条件为固
液比 1∶12, pH5.5,酶解时间 4h,结果见表 5。
表 5 酶解温度对酶解效果的影响
酶解温度(℃) 多肽浓度(mg/mL) DH(%)
50 5.16 28.33
55 6.28 30.83
60 5.38 27.33
65 5.46 26.29
由表 5可以看出 ,温度对酶解效果具有较大影
响 ,随着温度的增加 ,多肽浓度和 DH都有所增加 ,到
达 55℃时多肽浓度和 DH都达到了最高值。但随着
温度的继续上升 ,多肽浓度和 DH均不再继续上升而
呈下降趋势 ,故选用 55℃作为酶解的最佳温度。
2.4.6 木瓜蛋白酶酶解工艺 木瓜蛋白酶是一种内
切酶 ,它可作用于蛋白质中的含有巯基(-SH)的氨
基酸 ,可以破坏蛋白质的高级结构 ,使其酶解成低分
子的肽段 。实验发现 ,其酶解后的上清液为淡黄色 ,
粘度低 ,便于测定。经实验得出 ,木瓜蛋白酶酶解的
适宜工艺条件为酶用量 23164U/g底物 , pH5.5 ,酶解
温度 55℃,酶解时间 4h和底物固液比为 1∶12,酶解
液的多肽浓度为 6.28mg/mL, DH为 30.83%。
2.5 木瓜蛋白酶的酶解多肽液随水解时间变化的抗
氧化活性对比
表 6 不同水解时间所得苦荞麦多肽液的抗氧化活性比较
水解时间(h) 1 2 3 4
抗氧化活性(%) 21.78 22.17 21.58 6.73
实验表明 ,采用木瓜蛋白酶酶解荞麦复合蛋白
所得到的苦荞麦多肽液的抗氧化活性并不是随着水
解时间的延长而越来越强 ,而是在一定的水解时间
下呈现出最高的抗氧化活性。从表 6可以看出 ,酶
解 2h的苦荞麦多肽液其抗氧化活性最高。上述结
果与报导的肽类物质的抗氧化活性与其结构 、氨基
酸组成以及氨基酸末端 -NH2 , -COOH有关的研究
相符 。表明苦荞麦多肽液的抗氧化活性不仅与其多
肽浓度有关 ,还与其结构 、氨基酸组成以及氨基酸末
端 -NH2 , -COOH有关 。因此 ,课题尚需进一步研
究苦荞麦多肽的抗氧化活性的机理所在。
3 结论
3.1 通过实验确定出木瓜蛋白酶酶解的适宜工艺条
件为加酶量 23164U/g底物 , pH5.5,酶解温度 55℃,
酶解时间 4h和底物固液比为 1∶12,酶解液的多肽浓
度为 6.28mg/mL, DH为 30.83%。
3.2 苦荞麦多肽液的抗氧化活性在酶解 2h时达到
最大 。苦荞麦多肽液的抗氧化活性的机理研究目前
尚无研究报道 ,有待进一步研究。
参考文献:
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2007年第 09期 107
活性炭脱除猪血红蛋白酶解液色泽的
技术研究
姚成虎 ,王志耕* ,许 飞 ,董娟娟
(安徽农业大学畜产品加工研究所 ,安徽合肥 230036)
摘 要:采用正交实验法 ,比较研究用量、pH、温度和时间 4因素对
活性炭脱除猪血红蛋白酶解液色泽效果的影响。结果表
明:活性炭的添加量为 1%, pH为 4.0,温度为 80℃,时间为
40min时 ,猪血红蛋白酶解液脱色效果明显 ,蛋白质损失
较少。
关键词:猪血红蛋白 ,活性炭 ,脱色 Abstract:Theefectsofthequantityofactivatedcarbon, pH,
temperaturesandtimeondecolorationofporcine
hemoglobinhydrolysatebyenzymewerestudied.The
resultsshowedthatobviousdecolorationandlower
lossrateofproteinwereobtainedunderthefolowing
conditions:thequantityofactivated carbon 1%,
pH4.0, temperature80℃ andtime40minutes.
Keywords:porcinehemoglobin;activatedcarbon;decoloration 中图分类号:TS201.2+ 1 文献标识码:A
文 章编 号:1002-0306(2007)09-0107-03
猪血是一种含有较高营养价值的食品工业副产
品 ,蛋白质含量高达 18.9%,其中含有 18种氨基酸 , 8
种必需氨基酸含量占 44.3%[ 1] 。猪血蛋白大部分为
血红蛋白(Hemoglobin, Hb),存在于红血球中 ,占总
蛋白质的 80%。血红蛋白由血红素和珠蛋白组成 ,
在酶解过程中释放大量的血色素 ,同时血色素中的
二价铁可迅速被氧化成三价铁 ,使酶解液呈现出深
褐色 ,影响产品的纯度和呈色 ,使其用途受到限制 。
因此 ,脱色是猪血红蛋白有效利用的关键技术之一 。
国外最早是用酸性丙酮 [ 2 ]对血红蛋白进行脱色 ,由于
收稿日期:2007-01-29 *通讯联系人
作者简介:姚成虎(1982-),男 ,在读硕士研究生 ,研究方向:畜产品品
质与加工。
丙酮消耗量大 ,血液蛋白中的溶剂残留难处理 ,不适
宜工业化应用。 Auto[ 3]直接使用吸附剂羧甲基纤维
素对牛血红蛋白进行脱色 ,结果仍有大约 20%的血
红素铁没有被脱除 。目前 ,用活性炭对酶解液进行
吸附脱色在鱼肉 、低聚糖脱色研究中已取得了满意
的效果 [ 4~6 ] 。利用活性炭对猪血红蛋白酶解液进行
脱色 ,具有酶用量少 ,成本低 ,副产物少 ,易进行规
模化生产 ,无二次污染等优点。得到的水解蛋白具
有优良的起泡性和乳化性 , 能够广泛应用于食品
工业。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜猪血 来自合肥市四河屠宰场;AS1398中
性蛋白酶 无锡市博立生物制品有限公司;粉末活
性炭 食品糖用级;柠檬酸钠 分析纯 。
BS-210S电子天平 , pHS-3B精密 pH计 ,电热
HH-S恒温水浴锅 , TU-1901双光束紫外可见分光光
度计 , DT-51离心机 , QL-901旋涡混合器等。
1.2 实验方法
1.2.1 工艺流程 新鲜猪血※纱布过滤※离心去血清
(4000r/min, 15min)※加水溶血※蛋白酶解(酶解条件:pH为
7.5、温度为 55℃、酶量为 5000U/g、时间为 4h)※灭酶※离心
取上清液 (4000r/min, 15min)※脱色 ※离心 (5000r/min,
10min)※上清液※指标测定
1.2.2 测定方法
1.2.2.1 色素测定 用 TU-1901双光束紫外可见分
光光度计在 250nm到 450nm波长之间对酶解液进行
扫描 ,得到两个特征峰 OD280和 OD410 , OD280为蛋白质
的特征峰;OD410为色素的特征峰 。对于浓度较高的
溶液 ,因色素含量较高 ,可以采用示差法 [ 7]进行测定。
按下式计算脱色率:
脱色率 =(AS-AO)/AS×100%
[ 8] 张强 , 阚国仕 ,陈红漫 , 刘剑利 .酶解玉米蛋白粉制备抗
氧化肽 [ J] .食品工业科技 , 2006, 26(6):109~ 111.
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究 [ D] .华南理工大学学位论文 , 2003.