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Mn~(2+)对四尾栅藻生长及Ca~(2+)、Mg~(2+)吸收的影响



全 文 :第 3卷 第 2期
2 0 10年  3月
水生 态 学 杂 志
JournalofHydroecology
 Vol.3, No.2
 Mar., 2010
  收稿日期:2009-07-21
基金项目:江苏省环境材料与环境工程重点实验室项目资助。
通讯作者:封克。 E-mail:fengke@yzu.edu.cn
作者简介:刘静 , 1984年生 ,女 ,江苏射阳人 ,研究方向为植物营
养学。 E-mail:liujing841123@yahoo.com.cn
Mn2+对四尾栅藻生长及 Ca2+ 、 Mg2+吸收的影响
刘 静 ,赵海涛 ,盛海君 ,徐轶群 ,封 克
(扬州大学环境科学与工程学院 ,江苏 扬州 225009)
摘要:通过实验室模拟培养的方法 ,采用 6个不同 Mn2+浓度(0、10、 100、1 000、10 000、 30 000 nmol/L)的培养处
理 ,对四尾栅藻(Scenedesmusquadricauda)的生物量 、叶绿素 a含量 、培养基中 Ca2+、Mg2+离子的含量分别进行了
测定。结果表明 ,不同 Mn2+浓度对各指标均有显著影响 , 其中对叶绿素 a含量的影响达极显著(P<0.01);低
Mn2+浓度(0 ~ 1 000 nmol/L)促进四尾栅藻细胞生长和叶绿素 a的合成 , 而高浓度 Mn2+(30 000 nmol/L以上)抑
制四尾栅藻细胞生长 ,导致生物量下降;叶绿素 a含量显著降低(P<0.05);四尾栅藻细胞吸收的 Ca2+、Mg2+与
其生物量成正比。在所设置的浓度范围内 , Mn2+并未表现出与 Ca2+、Mg2+之间明显的拮抗作用。
关键词:四尾栅藻;Mn2+;Ca2+;Mg2+;生物量;叶绿素 a
中图分类号:Q493.99  文献标志码:A  文章编号:1674-3075(2010)02-0032-06
  在藻类细胞的生命周期中 ,除了需要大量的营
养元素 N、P外 ,还需要有微量元素的存在。缺少微
量元素 ,藻类虽然可以生长 ,但其生理过程及代谢作
用缓慢 。自从 Martin& Fitzwater(1988)报道了 Fe
限制会造成富含氮 、磷的亚寒带北太平洋地区表面
的水体浮游植物生物量很低的现象后 ,微量元素对
藻类生长的影响逐渐受到人们的重视 。近期研究发
现 ,微量元素 Mn也是限制藻类生长的主要因素之
一 ,在水体富营养化和水华暴发过程中起到较大的
作用 (Jefrey& Milton, 1999;Alexander& Markus,
2006)。锰元素作为藻类生长必需的微量元素之
一 ,是生物体进行光合作用的催化剂 ,对有氧呼吸产
生的氧化产物有去毒作用 ,是一些酶的活化剂 ,在生
成 ATP方面也起功能性作用(徐景亮 , 2005)。有研
究表明 , Mn元素的吸收与其存在形式有关 ,以可溶
性的还原态为主 (秦晓明和邹景忠 , 1997),且过量
的 Mn元素往往会对藻类产生毒性 ,抑制其生长(王
海明等 , 2008;刘静等 , 2009)。目前 ,国内外相关研
究主要侧重于 Mn与其他环境因素(营养元素 N、P
和光照等)的交互作用 ,特别是 Fe与 Mn的交互作
用对藻类生长的影响 ,结果往往比单个因子的限制
作用更强(李灏等 , 2006;黄邦钦等 , 2000;陈慈美等 ,
1996)。然而 ,研究对象大多集中在海洋藻类 ,且有
关单营养元素 Mn对淡水微藻生长及生理的影响研
究却很少 。
四尾栅藻 (Scenedesmusquadricauda)属于绿藻
门 、栅藻科 ,细胞呈纺锤形或长筒形 ,藻体一般为 2、
4或 8个细胞组成的单列群体 ,繁殖迅速 、适应性
强 ,是国内外广泛分布的一种淡水藻类(胡鸿钧和
魏印心 , 2006)。在太湖水体中 ,由于受污染影响 ,
富营养化现象越来越严重 ,导致春季和冬季四尾栅
藻数量增多(胡小贞等 , 2005);且高浓度 CO2或低
pH值水体中 ,也有利于绿藻和硅藻占优势 (杨波
等 , 2007)。因此 ,本文选取四尾栅藻为研究对象 ,
了解 Mn对淡水藻类生长及生理的影响 。
1 材料与方法
1.1 仪器和设备
光照培养箱 、显微镜 、血球记数板 、离心机 、721
分光光度计等 。为减少金属污染 ,所用的玻璃器皿
均在 1mol/L盐酸中浸泡 2 ~ 3d,用超纯水冲洗干
净 ,在 60℃下烘干 , 121℃下高压灭菌 20min后备用
(吕秀平等 , 2006)。
1.2 藻种
试验所用四尾栅藻购自中国科学院武汉水生生
物研究所 ,编号 FACHB-44。
1.3 培养基的配置
实验所用基本培养基为无铁 SE, 其配方为:
NaNO3 0.25 g/L, K2HPO4· 3H2O0.075 g/L, MgSO4
· 7H2O 0.075 g/L, CaCl2 · 2H2O 0.025 g/L,
KH2PO4 0.175 g/L, NaCl0.025 g/L, A5 +Cosolu-
tion1mL。其中 , A5 +Cosolution为 HBO3 2.86g/L,
MnCl2· H2O1.81 g/L, ZnSO4· 7H2O0.222 g/L,
DOI :10.15928/j.1674-3075.2010.02.005
CuSO4· 5H2O0.079g/L, Na2MoO4· 2H2O0.390g/
L, Co(NO3)2· 6 H2O0.049g/L。
整个实验均以上述培养基为基础 ,以 1mmol/L
的 MnCl2· 4H2O为母液 ,其他组分不变 ,配置成不
同 Mn2+浓度的培养基。本实验设 Mn2+浓度为 0、
10、100、1 000、10 000、30 000 nmol/L。
实验选用 250 mL广口三角瓶 ,内装培养基 150
mL,用无菌封口膜封住瓶口 ,每个浓度设 3个重复 ,
121℃高压灭菌 20 min后备用。
1.4 培养方法和实验条件
藻种实验前进行扩大培养 ,在指数生长期时离
心(5 000 r/min, 15min)收集细胞 ,用无锰 SE培养
基洗涤 2次 ,然后用无锰 SE培养基饥饿培养 5d。 5
d后离心收集细胞 ,用少量无锰 SE重悬 ,用重悬液
作为藻源 ,接种到已准备好的不同 Mn2+浓度的培养
基中 ,接种密度为 3×104个 /mL,在平行样之间的
相对偏差小于 10%时 ,实验数据取自 3个平行样的
均值。培养时间为 1个月 ,培养期间 ,每天定时摇动
3 ~ 4次 ,并变换位置 ,以减少光照的影响 。每隔 2d
取样 ,测定叶绿素 a含量和生物量(650 nm处的吸
光度)。
整个实验均在恒温培养室中进行 , 培养温度
(25±1)℃,光强为 2 000 lx,光暗比 12L∶12D。整
个实验过程均保持无菌操作。
1.5 生物量的测定
取一定量藻液 ,按不同倍数稀释后 ,用 721分光
光度计分别测定其在 650nm处的吸光度;另吸取 1
mL藻液放入事先加入 50μL鲁格试液的胶卷盒中 ,
染色固定后 ,用血球记数板在显微镜下记数 (陈海
柳等 , 2003)。生物量用藻液中的藻个数(N)表示 ,
得出溶液中藻的数量与吸光度之间的对应关系并绘
制成标准曲线 ,计算公式如下:
N(104个 /mL)=A650 ×136.08 +3.4756 (R2
=0.9961)
1.6 藻细胞的比生长速率(μ)测定
按下列公式计算藻细胞的比生长速率(μ):
μ=(lnN2 -lnN1)/(t2 -t1)
式中:t1、t2为培养时间;N1 、N2分别为培养 t1、t2
时的细胞密度(陈静峰等 , 2006)。
1.7 叶绿素 a含量的测定
根据改良的 Jefrey&Humphrey(1975)方法 ,取
5 mL藻液经 0.45 μm微孔滤膜过滤 ,滤膜于 -8℃
冷冻干燥(过夜或 12h以上),然后剪碎放入 50 mL
离心管中 ,加入少量 80℃的 95%乙醇 ,于暗处静置
6h后过滤 ,滤液定容至 10 mL,用紫外分光光度计
在 663、646、470nm下比色。计算公式:
Chl-a(mg/L)=(12.21×A663 -2.81×A646)×
10 mL/5 mL
1.8 培养基中 Ca2+、Mg2+的测定
实验结束后 ,取一定量藻液 ,用 0.45 μm微孔
滤膜过滤 ,滤液备用 ,直接测定。 Ca2+、Mg2+含量采
用原子吸收分光光度法测定 ,详见 《水和废水监测
分析方法指南 》(1990)。
2 结果分析
2.1 Mn2+对四尾栅藻生长的影响
不同 Mn2+浓度对四尾栅藻生长的影响似乎并
不明显 ,但单因子方差分析(one-wayANOVA)结
果表明 ,不同 Mn2+处理下四尾栅藻最终生物量间有
显著性差异(F=4.794;P=0.025<0.05)。在生长
初期 ,不同 Mn2 +浓度下的生长曲线基本重合 ,在指
数生长后期和衰老期时生物量的差异逐渐增大(图
1)。当 Mn2+浓度为 0时 , 最终生物量最低 , 为
28.11×104个 /mL;当 Mn2+浓度为 10nmol/L时 ,最
终生物量增加并不显著(P=0.700>0.05);而当
Mn2+浓度增加到 100、1 000和 10 000nmol/L时 ,最
终生物量显著增加(与 0 nmol/L时相比 , P分别为
0.015、0.007和 0.018),且 1 000 nmol/L时最终生
物量最大 ,为 31.17×104个 /mL(表 1),达极显著差
异(P=0.007 <0.01)。当 Mn2+浓度大于 1 000
nmol/L时 , 生物量却呈现出下降趋势。 10 000
nmol/L时生物量为 30.62 ×104个 /mL, 而 30 000
nmol/L时生物量仅为 28.51×104个 /mL。
图 1 Mn2+浓度 0 ~ 30 000nmol/L
时四尾栅藻的生长曲线
Fig.1 BatchgrowthcurvesofScenedesmus
quadricaudainthemediumwithMn2+
concentrationsof0 ~ 30000 nmol/L
比生长速率 μ用来表示藻类的平均生长速率。
由表 1可以看出 ,平均比生长速率的变化趋势与图
332010年第 2期          刘静等 , Mn2+对四尾栅藻生长及 Ca2+、Mg2+吸收的影响
1相似。不同 Mn2 +浓度处理四尾栅藻的比生长速
率有差异 ,在统计上达显著(F=4.752;P=0.026<
0.05)。 Mn2 +浓度为 0时 ,平均比生长速率最小为
0.065 d-1;Mn2+浓度为 1 000 nmol/L时 ,平均比生
长速率最大 ,为 0.0684d-1 ,两者差异达极显著水平
(P=0.008<0.01);而在 Mn2+浓度为 30 000 nmol/
L时 ,平均比生长速率下降为 0.0655 d-1 ,与最大值
相比有显著差异(P=0.022<0.05)。
指数生长期比生长速率是指在四尾栅藻生长进
入指数生长阶段的平均比生长速率。根据预备实验
及胡小贞等(2004)的研究 ,本实验确定 3 ~ 21 d为
四尾栅藻的指数生长阶段。因此 , μ0 =(lnN21d-
lnN3 d)/18 d。不同 Mn2+处理下四尾栅藻指数生长
期比生长速率的差异显著(F=5.622;P=0.016<
0.05)。值得注意的是 , Mn2 +浓度为 10 000 nmol/L
时 ,指数生长期比生长速率大于 1 000nmol/L时 ,达
最大为 0.0733 d-1 , 但两者差异并不显著 (P=
0.607>0.05);当 Mn2+浓度为 30 000 nmol/L时 ,指
数生长期比生长速率显著下降(P=0.033<0.05),
生长受到显著抑制作用。
表 1 不同 Mn2+浓度下四尾栅藻的比生长速率
和最大生物量比较
Tab.1 Finalyields(N)andspecificgrowthrates(μ)
ofScenedesmusquadricaudaunderdiferent
Mn2+concentrations
Mn2+浓度 /
nmol· L-1
平均比生长速率 /
d-1
指数生长期比
生长速率 /d-1
最终生物量 /
104个· mL-1
0 0.0650 0.0675 28.11
10 0.0666 0.0707 29.47
100 0.0677 0.0700 30.46
1 000 0.0684 0.0726 31.17
10 000 0.0678 0.0733 30.62
30 000 0.0655 0.0712 28.51
2.2 Mn2+对四尾栅藻叶绿素 a含量的影响
由图 2可以看出 ,不同 Mn2+浓度下四尾栅藻叶
绿素 a含量的差异较生物量明显 ,达极显著水平(F
=10.685;P=0.002 <0.01)。在刚进入指数生长
期时 ,不同处理下的叶绿素 a含量即表现出差异 ,在
指数生长期后期和衰老期差异更为明显。 Mn2+浓
度为 1 000 nmol/L时 ,最终叶绿素 a浓度最大 ,为
0.9227 mg/L;其次是 Mn2 +浓度为 10 000 nmol/L
时 ,叶绿素 a浓度为 0.9146 mg/L;Mn2+浓度在 0 ~
1 000 nmol/L时 ,叶绿素 a浓度逐渐增加 。然而 ,与
生物量变化不同的是 , Mn2+浓度为 30 000 nmol/L
时 ,叶绿素 a浓度达最低 ,为 0.6822 mg/L,比 Mn2+
浓度为 0时的叶绿素 a浓度还要低 0.1978 mg/L。
图 2 不同 Mn2+浓度下四尾栅藻
叶绿素 a含量随时间的变化
Fig.2 ChlorophylacontentsofScenedesmusquadricauda
withincubationtimeunderdifferentMn2+concentrations
表 2 Mn2+浓度为 0 ~ 30 000 nmol/L
时单细胞叶绿素 a含量
Tab.2 ChlorophyllacontentsofScenedesmusquadricauda
inpercelasafunctionofMn2+concentrations
Mn2+浓度 /
nmol· L-1
单细胞叶绿素 a含量 /
10-9mg·个 -1
0 2.85
10 2.86
100 2.78
10 00 2.96
10 000 2.99
30 000 2.39
  单细胞叶绿素 a含量的结果与图 2略有不同 ,
但在统计上仍达显著水平(F=5.136;P=0.021 <
0.05)。Mn2+浓度为 10 000nmol/L时 ,单细胞叶绿
素 a含量最高 ,为 2.99 ×10-9 mg/个;其次是 Mn2+
浓度为 1 000nmol/L时(表 2)。这个结果与最终叶
绿素 a浓度的结果相反 ,但与表 1中指数生长期的
比生长速率结果相符 , 说明 Mn2+浓度为 10 000
nmol/L时 ,可能为四尾栅藻的最适生长浓度。 Mn2+
浓度为 30 000nmol/L时 ,单细胞内叶绿素 a含量最
低 ,仅为 2.39×10-9mg/个。
2.3 Mn2+对四尾栅藻吸收 Ca2+、Mg2+的影响
图 3和图 4分别为培养 30 d后 ,培养基中剩余
的 Ca2 +、Mg2 +浓度 。 2图的趋势基本相同 ,都是在
Mn2+浓度为 1 000nmol/L时 , Ca2+、Mg2+浓度最低 ,
分别为 0.8021mg/L和 6.5733 mg/L;在 Mn2+浓度
为 0时 , Ca2 +、Mg2+浓度最高 ,分别为 1.0417 mg/L
和 6.892mg/L。这与四尾栅藻的生长情况相符 ,即
细胞生物量越大 ,吸收的 Ca2+、Mg2+越多。 Mn2+浓
度为 30 000 nmol/L时 ,溶液中剩余的 Ca2+、Mg2+浓
度仍较大 ,分别为 1.0139 mg/L和 6.7337 mg/L。
但方差分析结果却显示 , 微量元素 Mn2+对 Ca2 +、
34 第 3卷第 2期            水 生 态 学 杂 志                 2010年 3月
Mg2 +吸收的影响程度不同 , Mn2+对 Mg2+吸收的影
响达极显著(F=12.729, P=0.001 <0.01),而对
Ca2+的吸收影响显著 (F=5.154, P=0.017 <
0.05)。
图 3 培养 30d后不同 Mn2+浓度处理
培养基中 Ca2+的含量
Fig.3 Ca2+contentinmediumofdiferentMn2+
treatmentafter30days
图 4 培养 30d后不同 Mn2+浓度处理培养
基中 Mg2+的含量
Fig.4 Mg2+contentinmediumofdifferent
Mn2+treatmentafter30 days
3 讨论
运用 SPSS软件分析微量元素 Mn2+对四尾栅藻
细胞生长的影响情况(one-wayANOVA)后发现 ,不
同 Mn2+浓度对细胞的生物量 、叶绿素 a含量 、比生
长速率及 Ca2 +、Mg2 +吸收均具有显著影响 ,其中对
叶绿素 a含量和 Mg2+吸收的影响所造成的差异达
到极显著水平(P<0.01)。
3.1 不同的 Mn2 +浓度对藻类生物量的影响
低浓度 Mn2+可以促进四尾栅藻细胞的生长 ,在
高浓度时表现出一定毒害效应 。这与 Mn2 +对铜绿
微囊藻生长的影响情况相似(刘静等 , 2009;王海明
等 , 2008)。Mn2+浓度在 0 ~ 1 000 nmol/L范围内 ,
四尾栅藻生物量随 Mn2+浓度的增加而增加;当
Mn2+浓度为 30 000 nmol/L时 ,生长受到抑制 ,生物
量下降 。这与刘静等(2008)发现的 Fe3+对四尾栅
藻生长的影响情况有所不同 ,高浓度 Fe3+(30 000
nmol/L)对四尾栅藻细胞的生长未表现出抑制作
用 ,只是比生长速率已不再增加;Omar(2002)研究
结果也表明 ,当 Zn2+达到 8.0 mg/L时才表现出对
四尾栅藻生长的抑制作用 ,说明其对 Fe3+和 Zn2+的
耐受能力较强;Ting& Larson(1991)也证实四尾栅
藻合成金属结合蛋白的能力较强 ,能容纳较多的金
属离子;Stenvenson等(1996)认为 ,由于各种离子的
性质(离子半径等)不同 ,与细胞膜上官能团的亲和
能力的不同 ,因此导致同种藻类对不同金属的敏感
性和耐受性有所差别;阎海等 (2001)也证实 ,不同
金属离子与藻细胞的不同亲和性是导致金属离子抑
制蛋白核小球藻生长毒性差异的主要原因。
3.2 高浓度 Mn2+对叶绿素 a合成的抑制作用
Prassad(1987)研究认为 ,金属离子可影响与叶
绿素合成有关的酶活性 。本实验中 ,不同 Mn2+浓度
下 ,叶绿素 a浓度在指数生长初期就表现出差异 ,且
最终叶绿素 a含量达极显著差异 ,说明不同 Mn2+浓
度直接影响叶绿素 a的合成。当 Mn2+浓度为
30 000 nmol/L时 , 叶绿素 a含量极显著降低 (与
10 000nmol/L时相比 , P=0.001);四尾栅藻细胞叶
绿素 a的合成受到明显的抑制作用 ,浓度比 0 nmol/
L时还要低 ,说明过量的 Mn2+对四尾栅藻产生了毒
害机制。同时 ,有研究表明 ,过量的 Mn2+(30 000
nmol/L)对铜绿微囊藻的生长和叶绿素合成也有抑
制作用(刘静等 , 2009a);Yan& Pan(2002)研究认
为 ,金属离子可以与藻细胞壁表面含硫 、氮和氧的基
团结合 ,通过影响藻类的光合作用 、呼吸作用和酶活
性 ,从而抑制藻类的正常生长 。
3.3 微生物吸收的竞争关系
微生物吸收金属离子有不需要能量的表面吸附
和消耗能量的细胞膜转运两个过程。微生物在吸收
不同金属离子的同时 ,或多或少存在着竞争关系 ,如
竞争表面吸附位点 、能量 、载体等(Stenvensonetal,
1996)。作者也发现 ,高浓度 Fe3+(30 000 nmol/L)
影响了铜绿微囊藻和小颤藻对 Ca2+、Mg2+的吸收
(待发表资料)。王海明等(2008)测定了不同 Mn2+
浓度下 ,铜绿微囊藻单细胞内外吸附的 Mn2+含量 ,
证实在高 Mn2+浓度下 ,单细胞外吸附和细胞内吸收
的 Mn2+显著增加 。然而 ,本实验中 ,四尾栅藻吸收
Ca2 +、Mg2 +的浓度与其生物量成正比 ,即四尾栅藻
的生物量越大 ,吸收的 Ca2+、Mg2+越多。当 Mn2+浓
度为 30 000nmol/L时 ,一方面 ,过量的 Mn2+浓度抑
制了四尾栅藻细胞的生长 ,从而使新陈代谢所需要
的 Ca2 +、Mg2 +含量降低;另一方面 ,四尾栅藻生物量
352010年第 2期          刘静等 , Mn2+对四尾栅藻生长及 Ca2+、Mg2+吸收的影响
的减少使细胞总表面减少 , Ca2+、Mg2+吸附减少 。
对于 Mn2+与 Ca2+、Mg2+之间的竞争关系 ,本实验结
果并未体现出来 。
4 结论
单因子方差分析结果表明 ,不同 Mn2+浓度对四
尾栅藻的生物量 、叶绿素 a含量以及生长率均有显
著影响 ,其中对叶绿素 a含量的影响达极显著。
低浓度 Mn2+(0 ~ 10 000 nmol/L)促进四尾栅
藻细胞生长和叶绿素 a的合成 , 高浓度 Mn2+
(30 000nmol/L以上)抑制四尾栅藻细胞生长 ,生物
量下降 ,叶绿素 a含量显著降低。
四尾栅藻细胞吸收 Ca2+、Mg2+的量与其生物量
成正比 ,且在所设置的能度范围内 , Mn2+并未表现
出与 Ca2 +、Mg2 +之间明显的拮抗作用。
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(责任编辑 万月华)
36 第 3卷第 2期            水 生 态 学 杂 志                 2010年 3月
EffectsofMn2+onGrowthofScenedesmusquadricauda
andUptakeofCa2+andMg2+
LIUJing, ZHAOHai-tao, SHENGHai-jun, XUYi-qun, FENGKe
(ColegeofEnvironmentalScienceandEngineering, YangzhouUniversity, Yangzhou 225009, China)
Abstract:Mnisoneoftheessentialtraceelementsforalgaegrowthandfunctionsinmanyphysiologicalaspectsin
algaecel.However, theammentiontoefectsofMnonthegrowthofScenedesmusquadricaudaandonothernutri-
entcationuptakewererarelygivenbyus.InthisexperimentweobservedtheefectofMn2+concentrationonthe
growthandCa2+ , Mg2+uptakeofScenedesmusquadricaudainlaboratory.Seriesof250 mLflaskscontainingthe
preparedScenedesmusquadricaudaculturewereincubatedat25℃ for1monthunderdiferentMn2+concentrations
(0, 10, 100, 1 000, 10 000, 30 000nmol/L).Afterthatthebiomass, chlorophylacontent, thecongcentration
ofCa2+andMg2+inculturemediumweredetermined.Theresultsshowedaltheindexweresignificantlyinfluenced
byMn2+, amongwhichtheefectofchlorophylacontentwasextremelysignificant.LowerMn2 +concentrationsin
culturemedium(0 ~ 1000 nmol/L)promotedthegrowthofScenedesmusquadricaudaandsynthesisofchlorophyl
a, andhigherMn2+concentrationwouldsuppressitsgrowth, resultinginalowerbiomassandalowerchlorophyla
concentrationincels.WithincreaseofbiomassofScenedesmusquadricaudamoreCa2 +andMg2+inmediumhad
beenadsorbedbythem.InrangeofMn2+concentrationadoptedinthisexperimenttherewasnoantagonismbetween
uptakeofMn2 +andCa2+、Mg2+.
Keywords:Scenedesmusquadricauda;Mn2 +;Ca2+;Mg2+;Biomass;Chlorophyl-a
372010年第 2期          刘静等 , Mn2+对四尾栅藻生长及 Ca2+、Mg2+吸收的影响