全 文 ：微绿球藻固宝化培养及其对对虾养殖水质调控
郑 莲 , 黄翔鹊 , 刘楚吾 , 陈艳娟
(湛江海洋大学 水产学院 , 广东 湛江 524025 )
摘要 : 用褐藻酸钙作固定化载体 , 初 步探讨 了胶球直径 、 不 同接种黄 、 心C 12 溶液浓度 、 揭簇酸
钠浓度等固定化条件对徽绿球藻 (服朋。刁以曰` ` 伙溉么勿 ) 生长及其对养殖水质的影响 。 结果表
明 , 徽绿球藻固定化培养的最好条件是胶球的直径 为 2 . 5 ~
、 微藻接种量为 1 x 106 Q ll/ n止 ,
(治C l: 溶液的质 1 分数为 3% , 褐藻酸钠溶液质童分数为 2% 。 在此条件下制备的 固定化藻珠 ,
徽绿球藻生长率较高 , 生长周期较长 。 实脸期 问固定化徽绿球旅的生物黄增加 了约 17 倍 , 证明
了它的生理活性不余因固定化而受干扰 。 引入 固定化的徽绿球藻不但 可以降低养挂水体中氛
氮 、 亚峭酸氮等有害 因子的浓度 , 还能提高水中溶解氧含蚤 , 使水体环境长时间处于 良好的动
态平衡状态。
关锐词 : 固定化培养 ;微绿球藻 ;养殖水质 ;调控
中圈分类号 : 0 178 . n Z 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0创)一 30% (2 X() 5) 06 一 以刃4 一 05
藻类固定化技术起始于 20 世纪 80 年代 , 早期主
要应用于生化生产和能源提供川 。 在环境领域中固定
化藻类主要应用于生物监测和废水处理 , 它具有藻细
胞密度高 、 反应速度快 、 运行稳定可靠 、 微生物流失
少 、不需分离 、能提纯和保存高效菌株等优势 。 固定化
微藻细胞净化污水的研究刚刚起步 , 其研究包括对
N
、
P 的去除 12 一 ` 〕, 对重金属的吸收 , 如 iW l拓~ 等 5I]
人研究表明 , 用海藻酸钙固定小球藻可去除污水中
9 % 的汞 , 固定化技术大大提高了藻类对重金属的富
集。 孙红文等 (6腊出 , 藻类能为降解有机物的好氧细
菌提供氧气 , 因而提高抗击高浓度废水的能力 , 并指
出藻类固定化技术用于废水治理是非常有前景的 ,
尤其是采用藻菌共生系统 。 陈衍昌 7I] 初步研究了固
定化栅藻改善养殖水质 。 微绿球藻 (Na n n 伏火友“ 、 oc -u
必at ) 是虾池中广泛存在的优势藻种 , 隶属于绿藻门
( C日o or p h抓 a )的四胞藻目 (及加 s p o ar les ) l8] 。 作者以微
绿球藻为材料 , 以褐藻酸钙包埋固定在不同条件下培
养以选择固定化培养的最佳条件 。 以期为固定化培养
海洋微藻技术的应用及发展提供必要的实验依据和
理论基础 , 同时也为今后微藻生态调控防病理论的研
究提供依据。
1 材料与方法
1
.
1 藻种来源
实验所用的微绿球藻 (Na n n o hc l`` ` 记叉注d鹿勿 ) 于
20( 刃 年 3 月从海南三亚湛泰对虾养殖场分离所得 , 经
驯化培养在实验室备用 。
1
.
2 培养条件
微藻培养用海水取自湛江市东风码头海区 , 经过
沉淀 、沙滤和煮沸后冷却的海水 。质量密度为 1 . 0 10 士
0
.
0 1
。 培养液成分采用湛水 107 一 18 培养液配方 , 培
养容器为 1 0侧) 币L 三角烧瓶 , 培养光源为自然光照 ,
光照强度为 阅O一 10 (X扣 伙 , 培养温度为 29 ℃ 土 l℃ 。
培养过程中每日振摇数次 , 保证微藻正常生长 。
1
.
3 固定化胶球制备
藻酸盐为化学纯褐藻酸钠 , 称取不同质量的褐藻
酸钠 ,慢慢搅动 (约 h4 )分别溶入 1 《XX ) n正 燕馏水 ,并
收稿 日期 : 20 3 一 12 一 2;3 修回日期 : 2阅 4 一 05 一 10
基金项目 : 广东省科技攻关项目 ( C 20 犯8)
作者简介 : 郑 莲 ( 1% 7 一 ) , 女 , 广东湛江人 , 硕士 , 实验师 , 电
话 : 07 59 一 2 38 2 18() , E 一 am i l : U 23 82 l 8() @ 16 3 . n et
海洋科学 2/ 0 5 年 /第 29 卷 /第 6 期
分别加入 卜抽C1 2 0 9 ,配制成一定体积不同质量浓度的
凝胶溶液 , 高温灭菌冷却备用 。 按凝胶溶液体积 : 藻
液为 1 : 4 接种藻种 , 充分搅匀 , 然后用注射器吸取混
合液 , 通过不同的针头 , 以 s n正 /而n 的速度滴入不同
质量分数的 C冶C l : 溶液中 , 边滴边摇 ,此时褐藻酸钠中
的 aN 于与公C l: 中的 Q Z +发生置换 , 形成褐藻酸钙凝
胶网状结构 , 从而使细胞得以固定 , 约 30 而 n 后形成
固定化的胶球 。 用消毒海水洗涤 3 次 , 移入 1 o o mL
的三角烧瓶内 , 每瓶装 巧O n止 的培养液 , 接种 30 粒
胶球 。
1
.
4 固定化条件的选择
1
,
4
.
1 藻珠大小的对比试验
用不同大小的针头滴成不同大小的藻珠 , 设 2
个平行组 。
1
.
4
.
2 接种量试验
用 10 4 、 10 5 、 10 6 级 eC ll / ir正 藻种密度 , 设 2 个平行
组 。
1
.
4
.
3 褐藻酸钠浓度与氯化钙浓度正交试验
褐藻酸钠溶液的质量分数为 1% , 2 % , 3 . 5 % 分别
与质量分数为 1% , 2% , 3 % 的心C l: 正交试验 , 即 9 种
褐藻酸钠与氯化钙浓度组合进行试验 。
1
.
5 水质调控试验方法
采用优化的固定化条件制作藻珠备用 。 将藻珠用
筛绢网袋包装好 , 以 吊挂的形式把藻珠引入在水体为
0
.
5时 的实验室水族箱中进行 。 实验 1组为对照组 ,
实验 2组引入微绿球藻藻珠 40 0 0 粒 。实验室的光照
强度为 60 一 2 00 伙 , 水温度为 29 ℃ 士 1℃ , 并加入微
藻生长所需的营养盐 。 每组放养对虾 25 尾 ,各组通气
量 、 温度 ,盐度 、 投饵量和投饵次数等实验条件保持一
致 。
1
.
6 浏定的方法
1
.
6
.
1 藻细胞数量的测定
每 4 d 取相同个数的胶球加入一定体积的 5 %的
柠檬酸钠溶液溶解胶球并用血球记数板在显微镜下
计算藻细胞数量 。
1
.
6
.
2 生长率的测定
根据公式 K = ( In从一 h1N 夕/ T 其中 : N 。是开始
的细胞软 N ,是经过 T 时间后的细胞数 T 代表一段
生长的时间, K 为相对生长常数 表示生长效率。
1
.
6
.
3 水质因子的测定
试验结束后 , 分别从试验组和对照组取水样来测
定各项水质因子 , 氨氮 (N H J 一 N )用奈氏试剂法测定 ;
亚硝酸氮 (降〕2一 N ) 用 G R 试剂法测定 : 溶解氧 (以 ) )
用碘量法 ; PH 值用 60 0 型 PH 计测定 。
2 结果
2
.
1 胶球直径对 固定化微绿球藻细 胞生长
的影响
结果表明直径 2 . 5~ 胶球的藻生长速率最快
, 生
长率最高 , 3 . 5~ 胶球较差 , 4
.
5
~ 胶球生长最慢 (表
1)
。 同时 , 对微绿球藻不同球粒试验结果进行单因子方
差分析 , F = 40 . ” > F 。 、 0l( 2 , 3) 二 30 . 82 , 也表明了2 . 5~胶球对固定化微绿球藻细胞的生长影响极显著。
衷 1
T血b , 1
3 种不同球径的胶粒对固定化微绿球藻细胞生长的影响
T h e e f fe ct o f d l f fe re n t d 亩a献te r o f h 时闷s on t址 g门 w t加 o f l价n . 口o b盆l盆乞曰 倪 l l s o f 八ar 月砚优而j d对` 。 亡“ !a at
组别 胶球直径
( m m )
接种量
( x 10 礴e e ll/ m L )
2 0 d 后的细胞数
( 义 1 0 4 e e l l/ m L )
生长量
( x 1 0 4
e e l l/ m L )
3 3 6 5
4 8 0
3 8 0
1 15
2 3 0
1 3 0
0
.
1 2 9
0 3 1 5
0
.
0 20 5
0八UO一勺七飞气以2,一
2
.
2 接种量对 固定化细 胞生长的影响
从表 2 中可看出接种量小于 1 0 4 Cel / rnL 时藻几
乎停止生长 , 到后期 , 细胞数目减少了 39 % , 因此 , 10 6
ce l / 11止接种量对固定化微绿球藻生长比较适合 , 单
因子方差分析结果 F 二 2 .分 F 。 05 ( 1 , 2) 二 18 . 51 差
异显著 。
M岔ine 反 ien ce s八七」. 2 9 ,从 ) . 6 2/ 0 5
农 2 不同接种 t 对固定化徽绿球蕊细胞生长的影响
aT b
.
2 Th
e e到飞 e t o f d ffe 比 at 回 dal l毗川毗 10 . 0 . 比 e lg旧钾 t血 。幻 . ” . 。加” . 月 ec l l s fo N囚说“ hj o d s uoc 坛勿
组别 接种量
( x 1 04 e e l l/m L )
20 d后的细胞数
( x l o 4 e山八】I L )
生长量
( x 1 0 4e e ll/川」沪 )
01 1 6
1 1
.
6
1 9 7 0 1 8 5 4
1 5 1
,
4
14 2
1 3 2
3 1
.
1 6 0
.
8 6 一 一
2
.
3 C冶Q Z浓度与揭藻酸钠浓度正交试验 短 。用 2 % 褐藻酸钠制成藻球 , 微绿球藻细胞生长率比
对固定化微绿球藻细胞的影响 1% 和 3 . 5 % 时的生长率明显增大 ,而单因子方差分析
试验结果表明 , 用 3% 的 。 尤 12溶液与 2 % 的褐藻 结果 F 一 3 . 87 > F 。 01 ( 8 , 9) = 5 . 47 , 表明 。 C12 浓度和
酸钠形成的凝胶珠 , 微绿球藻的生长量和生长率最 褐藻酸钠浓度的不同组合对固定化微绿球藻细胞生
大 。 实验过程中发现 6 C 12浓度高 , 形成藻珠时间就 长的影响极显著。
农 3 c ac l : 浓度与祠旅. 钠浓度在徽绿球兹固定化培养中的正交试验结果
aT b
.
3 R . 间扭 Ot 州抽脚喇 . . . of 山知目yt 砧 O目 , .目 血 . 助y 侧白娜。时 e on t加 砂 , 叭加 of i . 朋. 。 七111别月 t触 凡明脚吧血肠月 s oc u j“ a
组别
c ac 卜质量分数
( % )
褐藻酸钠质
量分数 (% ) 初始细胞数 2 0 d 细胞数
3 15
28 0
33 0
2 5 1 0
2 9 0 0
2 9 4 0
1 5 8 5
1 4 70
1 1 65
0
.
0 20
0
.
0 14
0
.
0 2 0
0
.
1 24
0
.
1 3 1
0
.
1 32
0
.
0 56
0
.
0 9 5
0
.
0 8 6
210210
2
.
4 藻珠 中微藻生物童变化
将藻珠用筛绢袋装好放入养殖桶 , 第 2 天就观察
到袋内有气泡 , 说明藻细胞已开始生长 。 第 3一 4天颜
色明显加深 , 呈鲜绿色 , 啼绢袋在藻珠的影响下浮于
水面 . 袋内气泡增多 , 接近培养后期时 , 藻珠颜色呈深
绿色 。 镜检结果显示 , 微绿球藻藻珠中细胞数从
1
.
50 义 10 7个 / 粒增加到 2 5 . 4 7 x l 0 7个 / 粒 , 生物量从
0
.
5 1
义
10
一 ’ 魄 / 粒增加到 8 . 6 x 10 一 2魄 / 粒 , 约增加
了 17倍 。
2
.
5
2
.
5
.
1
主要水质因子的检浏
IX ) 和 PH 值的变化
试验过程中 , 实验组 以) 比对照组提高了 1 . 9% ;
实验组 PH 为 7 . 92 ,对照组为 7 . 61 。 因此 , 固定化微藻对 PH 的上升具有促进作用 。 实验过程处于充氧状态 ,
因此 , 以 )和 PH 无明显的相关性 (图 1 , 2) 。
8
.
4
8
.
2 - 今- 实驹组
一月卜- 对照组
86别拜7 2工j
工d
2
}
0 l
3 D 9 3」1 3 1 3
叫卜- 实驹组
-月卜一 对照组
8
1
64
3 .1 5 31 7 3 1 9 3
.
2 1 3
.
2 3 3
.
2 5 .3 27
时间 / ( 月 . 日 )
7 L -一3 D 9 3 ` 1 1
图 1 实验过程中以〕值的变化
叱 . 1 hT e ~ iat on of 以 ) d明ng r l l e e x l〕 e n n l e nt F语 . 2
3 13 3 j 5 3 .1 7 3 j 9 3
.
2 1 3
.
23 3
.
2 5 3 2 7
时间 / (月 . 日 )
图 2 实验过程中 PH 值的变化
T’h e v a l l at i二 of P H d州ng ht e 。 中 e n 、e nt
海洋科学 / 20(] 5 年 /第 29 卷 /第 6 期
2
.
5
.
2 氨氮和亚硝酸氮的变化
引入固定化微藻可降低养殖环境中氨氮与亚硝
酸氮含量 , 实验组 的氨氮含量 比对照组 降低 了
38
.
5% ;亚硝酸氮含量比对照组降低了 47 % (图3 , 4) 。
实驹组
对照组
3,`1…0
ǎ目bEà、谈喊骊恻
0 Ise
3 D 9 3」1 3」3 3 1 5 3 1 7 3 1 9 3 .2 1 3 . 2 3 3 2 5 3 2 7
时间 / (月 , 日 )
图 3 亚硝酸氮的变化
F谊 , 3 仆 e v a n a it on of 从)沁 -
- , 卜 . 实验组
一 . 卜 . 对照组
432
, .
0
ǎ钱任à、铡悦喊肖召目
O之三
3
.
09
3
.
1 1 3
.
13 3 J 5 3 17 3」9 3 .2 1 .3 2 5 .3 2 7
时间 / (月 . 日 )
图 4 氨氮的变化
纯 . 4 们、e ~ at lon of N H矛一 N
3 讨论
3
.
1 不 同 固定化条件对固定化藻类的影响
3
.
1
.
1 胶球的直径对固定化藻类的影响
不同型号的针头 , 其内径不同 , 由其所形成的凝
胶球的直径也不同 , 型号越大 , 胶球直径越大 。 从表 1
生长率结果和方差分析可以看出胶粒的大小对固定
化微绿球藻细胞的生长影响是显著的。 杨海波 l9] 等认
为胶球直径越大 , 所产生的扩散传质阻力越大 , 胶球
内所需营养不足 , 积累的代谢物过多 , 细胞生长环境
恶化 , 同时由于直径过大 , 使得胶球内光照不足 , 这些
不利条件使得大直径不利于小球藻生长 。 试验结果表
明大直径也不利于微绿球藻生长 , 所以用直径 2 . 5
~ 胶球较好
。
3 1
.
2 接种量对固定化藻类的生长影响
试验结果表明接种量小于 1 0 4 级时藻几乎停止
生长 , 接种量大 , 生长量大 , 生长率也高 , 从单因子方
差分析差异显著 , 10 6级接种量对固定化微绿球藻生
长 比较适合 。 李英敏 〔10 等也认为接种量大的细胞生
长较快 , 且胶球的稳定性较好 。 但为了避免离心的麻
烦 , 又可以获得较好的结果 , 因此 , 选用 1 0 6级的细胞
密度进行固定化为宜 。
3
,
1
.
3 不同浓度的 Q C I: 溶液与不同来源的褐藻酸
钠对固定化藻类的生长影响
韩丽君 1 ]等人考察了不同浓度的 C a C I : 溶液与
不同来源的褐藻酸钠形成凝胶珠后 , 其强度的变化规
律 。 发现褐藻酸钠中的甘露糖醛酸 (M )越高 , 所形成
胶球的强度越差 ; 古罗糖醛酸 ( G ) 越高 , 所形成胶球
的强度越高 。 同时 , 实验表明 , 褐藻酸钠的浓度明显对
藻细胞的生长有影响 , 当用 1% 的褐藻酸钠时 , 培养
液随时间的延长逐渐变成绿色 . 说明胶珠散落 , 包埋
于珠内的细胞游离至培养液中 , 使测得的细胞密度
低 。 随着褐藻酸钠浓度增大 , 其与形成的网格变密 , 凝
胶珠的机械强度增高 , 藻细胞能够较好地包埋于其
中 , 并通过凝胶网格的孔隙获得培养液中的营养 , 排
除代谢物 , 当褐藻酸钠浓度增加到 3 . 5 % 时所形成的
凝胶网格过于致密 , 从而加大了培养液中的底物和造
细胞产生的代谢物进出凝胶珠的阻力 , 使细胞生长环
境恶化 , 随着培养时间的延长 , 珠内营养不断消耗 , 代
谢物不断增多 , 细胞开始衰老 , 并逐渐死亡 。本实验结
果 (表 3) 表明 , 用 3% 的 Q C 12溶液与 2 % 的褐藻酸钠
形成的凝胶珠 , 微藻的生长量大 , 生长率最高 ; 实验过
程中发现 (抽C l : 浓度高 , 形成藻珠时间就短 , 所以选用
3% 的 。 C 12浓度为佳 。
3 2 固定化技 术在水产养殖中的应用
微藻固定化技术在环境领域中的应用逐渐受到
重视 , 尤其在污水处理和养殖水质调控 、 养殖废水处
理等方面 。 藻类最初应用于废水处理是在 1 957 年就
提出的 , 至现在已有一定的研究基础 。 aB il e S 等 12 研
究固定化丛粒藻细胞的生理生特性时发现 , 固定化丛
粒藻光合放氧量高于悬浮藻的 3倍 ; 载体凝胶可保护
藻细胞免受汞等有毒物质的伤害 , 保证微藻的生理活
性 ; 严国安等 13 服道 , 小球藻的固定化增加了其生理
代谢活性 , 对水质的净化效率要比悬浮态相对要高 。
本实验的结果可以看出 , 固定化微绿球藻的数量增加
了约 17 倍 , 由此证明了微绿球藻的生理活性不会因
固定化而受干扰 。 同时 , 固定化的微绿球藻能把对虾
/ù一3
N万*{晗1碑尸一3
入玉lr in e 反 ien e es 尸八〕】. 2 9 , N o 6 / 2 0 0 5
养殖环境中的氨氮和亚硝酸氮当成营养盐而吸收 , 使
水质中氨氮和亚硝酸氮浓度明显低于对照组 。 因此 ,
引入固定化的微绿藻不但可以降低水体中氨氮 、 亚硝
酸氮等有害因子的浓度 , 消除胁迫 , 还能提高水中的
溶解氧含量 , 使水体环境长时间处于良好的动态平衡
状态 。
今考文献 :
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(本文编样 :张培新 )
海洋科学 / 20 5 年 /第 29 卷 /第 6 期