全 文 ：( 中国海洋药物 》杂志 2 0 0 2 年第 6 期 (总第 90 期 )
孔石纯多糖的分离分析 △
王艳梅 , 牛锡珍 , 张虹 , 李智恩 , 张全斌
(中国科学院海洋研究所 , 山东 青岛 2 6 07 1)
摘 要 : 研究孔石 苑中多糖的提取分 离方法 , 并对 多糖进行了灰分 、 总糖 、 水 解硫酸根含黄 、 特性粘度等浏
定 , 以及元素分析 、 单糖气相色语分析 、 氛基酸 分析 、 红外光谱和核磁共振光语等仪器分析 。
关健词 : 孔石跪 ; 绿藻 ; 多糖 ;化学分析
中图分类号 : R 9 3 1 . 6 文献标识码 : A 文章编号 : 1 0 0 2一 3 4 6 2 ( 2 0 0 2 ) 0 6一 0 0 0 4一 0 4
S e P a r a t i o n a n d a n a ly s i s o f P o l y s a c e h a r i d e s fr o m lU
v a P e r t u s a
( C h l o or P h y t a )
W A N G Y
a n 一 m e i
,
N I U X i
一 z h e n
,
Z H A N G H o n g
, e z a l
.
( I n s t乞r u t e o f Oc e a n o l o g 夕
,
hC i
n e s e A e a d e m i c S
e i e n e e s
,
2 6 6 0 7 1
,
hC i
n a )
A b s t r a e t : A f t e r s e p a r a t i n g m e t h o d o f p o ly s a e e h a r i d e s w a s s t u d ie d
, a s h e o n t e n t
,
t o t a l s u g a r
,
s u l f a t e e o n t e n t
,
i n t r i n s i e v is e o s i t y o f t h e p o l y s a e e h a r id e s w e r e a n a l y z e d
.
E l e m e n t a : 、 a l y s i s
,
s a e e h a r i d e r e s id u e s
’ r a t i o , a m i n o a e id a n a l y s i s
, a n d I R N M R a n a l y s i s w e r e e a r r i e d o u t b y i n
-
s t r u m e n t a l m e t h o d s
.
K e y w o川 s : lU va P e rt u s a K j e l lm ; C h l o r o p h y t a ; P o l y s a e e h a r id e s ; C h e m i e a l a n a l y s i s
孔石药 ( lU v a p e r t u s a K j e l lm )是 1 种大
型绿藻 , 俗称海白菜 、海菠菜 、海窝芭等 ,属绿
藻门石纯科 石药属 。 其化学组 分主要 有多
糖 、 脂类 、蛋 白质 、 氨基酸 、 维生素及无机矿物
元素等 lj[ 。 多糖类物 质以其丰富的资源 , 独
特的生理活性 ,吸引了众多研究者的注意川 ,
最先为人们认识并开始研究 。
本研究拟为进一步开发利用孔石纯资源
做部分基础性工作 。
1 材料与方法
1
.
1 实验材料
孔石 药 ( lU v a p e r t u s a K j e l lm ) 29 9 8 年
12 月采 自青岛太平角潮间带 。 去除杂藻 、 无
脊椎生物及砂石 ,用冷 自来水冲冼干净 , 自然
风干 ,剪碎 ,塑料袋封口备用 。
1
.
2 实验方法
1
.
2
.
1 孔石苑多糖的提取
用 3 0 倍 的蒸馏水于 1 0 0℃ 提取孔石药
干藻 3 h , 8 0 目筛绢过滤 ,重复提取 1 次 ,水提
取液合 并 。 滤后 的藻 体用 0 . 4m ol · L一 ` 的
N a O H 稀碱溶液于 10 0℃提取 3 h , 筛绢过滤
得碱提取液 , 弃去藻渣 。 两份提取液分别用
S a v a g e 法脱 蛋 白 s h , 4 0 0 o r · m i n 一 ` 的速度
离心 ZOm in ,倾出上清液 ,用 4 倍 95 % 的酒精
沉淀 ,放置过夜 , 26 0 目筛绢过滤后在红外灯
下烘 干 , 得 孔 石 纯 多 糖 。 水 提 物 编 号 为
W P S
,碱提物编号为 A P S 。 相同的方法提取
脱脂孔石纯 (酒精处理后 的孔石纯干藻 ) , 得
到相应样品 , 分别编 号为 D W P S 和 D A P S 。
如图 1 所示 。
1
.
2
.
2 灰分分析 参见中国药典 , 19 9 5 年版 。
△ 九五 国家重点科技攻关项 目 “ 海洋生物多糖新药 ”专题 (项 目编号 : 9 6一C o Z一 0 4一 0 4) .
《 中国海洋药物 》杂志 2 0 0 2 年第 6期 (总第 0 9期 )
孔石 珑 ,脱脂孔石 苑
备水提取 2次
川 )目筛绢过摊
导核磁 共 振谱 仪上 测定 , sm m 样 品管 。 在
35 ℃测定 ’ 件 N M R 及质子去偶 ` 3 -C N MR 谱 。
水提取液备
a v a g 。法脱蛋白奋
「斗竺赞”碱提取液
上穿音液
实验结果和讨论
孔石 苑多糖的得率及化学分析 (见表 1 ) 。
” “ %酒精沉淀杏
W P S / D A P S
备
“ ”
ag
e法脱蛋自备
上清液
奋9 “ %酒精沉淀
W P S / D A P S
图 l 孔石纯多旅提取流程图
1
.
2
.
3 水解硫酸根分析
以 P Z 0 5 干燥的 K Z 5 0 、 为标准 , 制作标
准曲线 ,采用 明胶一氯化钡法测定硫酸根 的
含量 。
1
.
2
.
4 总糖测定
以 S i g m a 公司生产 的鼠李糖 为标准 , 采
用苯酚一硫酸法测定样品中的总糖含量 。
1
.
2
.
5 特性粘度测定
采用稀释外推法 ,用落球式粘度计测定
不同相对浓度下的溶液粘度 刀及蒸馏水 刀。 ,
刀s。 = , /刀。 一 l , 以 , s P / C `一 C ’ 回归方程 ,截距
即为 [刀〕。
1
,
2
.
6 元素分析
采用 P E 2 4 0 0 E A 型元素分析 仪测定各
样品中的 C 、 H 、 N 3 种元素的含量 。
1
.
2
.
7 中性单糖组成分析
将多糖样品完全酸解后还原 , 乙酞化制
备阿尔迪醇乙酸醋衍生物进行 G C 分析 ,计
算出各中性糖残基的物质 的量的 比 。 其 中 ,
糖醛酸含量采用间苯二酚法测定 。
1
.
2
.
8 氨基酸分析
试验样品在氮气的保护下 ,用盐酸水解 ,
在 日立 8 35 一 50 型氨基 酸 自动分析仪上测定
氨基酸的含量 。
1
.
2
.
9 红外光谱分析
采用 iN co le t 5 1o P 型 F T es 1R 光谱仪 ,样品
以 K Br 压片 ,在 40 0 ~ 4 0 0 0 Cm 一 ` 区间扫描 。
1
.
2
.
10 核磁共振光谱分析
样品溶于 玖 O , 在 扮uc k er DP 》 4 0 M 超
表 1 孔石筑多箱得率及化学分析
样品编号 W P S A P S I )W P S D A P S
得率 ( % ) 3 0 . 1 6 8 . 0 2 3 6 . 2 8 1 2 . 5 9
灰分 ( % ) 2 9 . 9 1 2 4 . 2 8 2 9 . 0 3 2 4 . 9 2
硫酸基 ( % ) 1 5 . 9 4 0 18 6 4 1 2 . 5 4
总糖 ( % ) 4 9 . 3 0 一 6 2 . 0 9 5 9 . 1 9
特性粘度 [ ,皿 3 1 . 5 8 2 8. 9 0 ` . 1 9 . 7 2 4 9 . 2 9
、 注 : 28 . 90 为样品 A P S 经过重溶 、 过滤 、 沉淀处理
后所得样品的实验数据 。
海藻多糖 中含有硫酸基等极性基团 , 使
得硫酸多糖在水中有较大的溶解度 。 第 1 次
水提时 ,含极性基团较多的 、 相对分子质量较
小的大部分水溶性多糖首先被提取 出来 , 故
第 2 次水提物的量少于第 1 次 。 两次水提取
后 , 碱提物中的极性基团含量较少 ,且因稀碱
的作用样品中含有部分短纤维 , 导致水溶性
不大好 ( A P )S 尤为突出 ) 。
A P S 中未检测到硫酸根 , 且由于其无法
完全溶于蒸馏水 , 故不能用苯酚一硫酸法测
定其总糖含量 。 各样品硫酸根的含量与灰分
含量变化趋势相似 。
对于同类物质而言 , 特性粘度 的大小可
反映其相对分子质量的大小 , D W P S 的特性
粘度最小 ,表明用乙醇处理后的脱脂孔石药
提取所得 的多糖 相对分 子质 量相对 最小 ;
W P S 的特性粘度较 D W P S 大 , 相对 分子质
量亦较大 ; D A P S 的特性粘度远大于 D W P S ,
印证了相对低分子质量的多糖首先被热水提
取出 ,稀碱提取糖的相对分子质量较水提物
要大 。
2
.
2 仪器分析
2
.
2
,
1 元素分析
《中国海洋药物 》杂志 2 0 0 2 年第 6期 (总第 90 期 )
表 2 孔石纯多糖 C、 H 、 N含且
样品编号 WPS AS P DWS P DAPS
C( %) 2 9
.
0 3 3 7
.
1 3 0 3
.
1 2 3 4
.
0 4
LI ( %) 4
.
48 4
.
72 3
.
9 0 3
.
9 0
N( %) 2
.
2 9 2
.
8 32
.
30 2
.
4 6
粗蛋白 ( %) ` 1 4. 31 1 4. 8 8 1 4. 38 1 5. 38
注 :粗蛋白含量由 N% 6 x. 2 5计算得出 。
碱处理过程中 ,藻体细胞遭到严重破坏 ,
牢 固结合与藻细胞蛋白质也发生了不同程度
的解离 ,导致 A P S 与 W P S 、 D A P S 与 D W P S
相 比 ,元素氮含量 比较高 。
2
.
2
.
2 单糖含量分析
表 月 实验样品中氨墓酸含 t 分析
氨基酸 符号 W P S A P S
(m g
·
10 Om g ’ ) ( rn g
·
l oo m g
一 ’ )
表 3 各样品中精醛含 t 和错残基物质的且的比
样品编号 糖醛酸含量
( % )
R h
a : X y l
:
G l
e :
M
a n :
A
r a
WP S 2 3
.
2 3 8
.
5 : 3
.
9
:
1 1
.
2
:
1
.
8
:
1
.
0
A P S 2 0
.
5 3 4
.
4 : 1 1
.
4
:
2 2
.
9 : 4
.
0
:
1
.
0
D W P S 2 3
.
0 4 0
.
7 : 1 8
.
9
:
4 3
.
7
:
2
.
2
:
1
,
O
D A P S 2 0
.
0 1 3
.
7
:
8
.
5
:
1 7
.
0
:
1
.
2
:
1
.
0
注 : R h a 一 R h a m n o s e X y l一 X y lo s e G le 一 G lu e o s e
M
a介 M a n n o s e A r a 一 A r a b o s e
由表 3 可知 ,孔石药的单糖主要为鼠李糖 、
木糖 、葡萄糖和糖醛酸等 。 此外 ,还检测到少量
的甘露糖和阿拉伯糖 ,有人分析孔石药多糖得
出结果为 R h a 二 X y l , lG c , N肠 n ’ rA a ’ rT i ’
F u e : G a l= 18
: 56 : 8
.
0 7 : 1 6
.
6 1 : 0
.
59 : 0
.
19
: 3
.
1 : 1
.
28
: 1
.
08
,说明由于采集海藻的地点 、
时间的不同 ,实验结果可能有差异闭 。
2
.
2
.
3 氨基酸分析
碱处理严重破坏藻细胞 , 蛋 白质也发生
了不同程度的解离 ,故 A P S 与 W P S 相 比 , 大
部分种类 的氮基酸以及氨基酸总和均偏离 。
实验结果表明 ,谷氨酸 、 天冬氨酸含量最
高 ; 除此之外 , 精氨酸 、 甘氨酸 、 丙氨酸 、 亮氨
酸 、 撷氨酸含量亦较显著 。 值得指出的是半
耽氨酸含量与其他氨基酸相比虽不算很高 ,
但此含硫氨基酸在红藻中检测不到 , 在褐藻
中虽 可检测出但量非常低 ,存 于红藻和褐藻
中的含硫氨基酸为牛磺酸 。
天冬氨酸 A s p 0 . 9 4 1 . 5 4
苏氨酸 T h r 0 . 2 5 0 . 1 2
丝氨酸 S e r 0 . 5 6 0 . 2 3
谷氨酸 G l u 2 . 3 6 2 . 0 7
甘氨酸 G l y 0 . 69 0 . 85
丙氨酸 A la 0 . 4 7 0 . 9 9
半肤氨酸 C y s 0 . 10 0 . 1 1
撷氨酸 V a l 0 . 3 3 0 . 9 0
蛋氨酸 M e t 0 . 0 6 0 . 0 6
异亮氨酸 I le 0 . 1 2 0 . 4 1
亮氨酸 l e u 0 . 2 1 0 . 9 6
酪氨酸 ` f y r 0 . 1 7 0 . 3 3
苯丙氨酸 P ll e 0 . 1 2 0 . 5 4
赖氨酸 I y s 0 . 2 8 0 . 5 8
氨 N I { ` 0 . 6 3 0 . 3 0
组氨酸 H i、 0 . 0 6 0 . 0 6
精氨酸 A r g 1 . 7 5 0 . 1 3
脯氨酸 P r o 0 . 1 2 0 . 1 9
总 和 T o t a l 9 . 2 2 1 0 , 3 7
2
.
2
.
4 红外光谱分析
图谱的主要吸收峰都很相似 , 说明各实
验样品中的单糖组分和主要官能团种类没有
太大差别 。 3 4 2 5 一 3 4 4 5 C rn 一 ` 系多糖上 的经
基以及样品中含有 的少量水 分的吸收峰 ; 饱
和碳氢伸缩振动 cY 一 H在 2 9 3 5 c n l一 ’ 左右 ;糖醛
酸残基 的吸收峰出现在 1 6 4 0 c m 一 ` 附近 , 各
样品 的吸收 峰位 置略 有差 异 ; 1 0 5 0 ~ 1 1 13
c m
一 ’ 之间的强宽 吸收带 为多糖各糖 残基之
间糖昔键 C 一 0 一 C 的振动峰 , 由于各糖残基连
接方式及顺序不一 而导致糖昔键之 间的差
异 , 导致这个宽吸收带峰形不规则 , 主峰位置
随糖昔键之间比例的不 同略有变化 ; 1 22 5 ~
1 2 6 5 e : 1: ’ 的强 峰 和 8 4 0 c m 一 ’ 、 7 8 2 ~ 7 8 6
c m
’ 两尖峰是硫酸基的吸收信号 已5」 。
B
.
R ay 等的 甲基化 实验并未 发现硫 酸
基 与此处的吸收峰有相关性 , 不能证 明此 处
的峰位置可 以预测硫 酸基的位置和取 向川 。
本实验样品中的硫酸基不仅接在 鼠李糖的某
些位置上 ,在木糖的某些位置也有连接叫 ,故
不能根据吸收峰的位置而推测硫酸基的连接
位置和方式 。
2
.
2
.
5 核磁光谱分析
《中国海洋药物 》杂志 2 0 0 2 年第 6期 (总第 90 期 )
2
.
2
.
5
.
1’ 3 C
一
N M R 光谱分析
表 5 ’ “ C一 N M R 光谱分析结果
样品
编号
化学位移 (占)
CI CZ C3 C4 CS C 6
G A 0 2 1
.
9 1
9 7
.
3 2
9 9
.
59
10 0
.
8 0
0 5 1
.
53
10 2
.
1 6
10 3
.
3 7
10 5
.
53
0 2 1
.
8 6
9 8
.
0 8
10 2
.
10
0 0 1
.
7 5
10 5
.
3 1
0 12
.
1 1
3 10
.
0 0
0 12
.
1 1
(7 5
.
6 6)
肠
(7 1
.
2 3 )
17 5
.
1 1
1 6
.
58
(7 1
.
2 3 )
(7 8
.
1 6)
(7 3
.
9 9 )
(7 3
.
2 6)
(7 3
.
62 )
67
.
53
(7 0
.
18 )
(8 0
.
45)
(7 1
.
2 7 )
(7 0
.
1 1)
( 60
.
3 3 /
7 7 1
.
7 1
_
57
.
18 )
G A l 6
68
、声沙、 J、 .声汽é只OJ产 CA几Q亡 刁J500 1几匕, l…,:O曰061丫ǎ乙ù匀,Iō了厅才ù丫
口门八书了r、了`子r/、、夕刃、.尹矛、 JQù八ǎO`夕一亡Jlaǎ从IJ月OóhA通Q口…一了O八jOJ00山7.咋了,口门ē只门了`、.r、子rZ了`zRXGSPW
G A ( 7 5
.
8 )
( 7 1
.
3 6 )
( 7 5
.
8 0 )
( 7 7
.
9 1 )
( 6 9
.
8 5 )
( 7 5
.
8 )
( 8 0
.
4 3 )
( 7 2
.
5 5 )
( 7 5
.
4 1 )
( 7 9
.
5 1 )
( 7 3
.
6 6 )
7 8
.
1
( 7 7
.
9 1 )
( 8 0 6 1 )
( 7 6
.
1 3 )
( 8 0
.
9 3 )
( 7 7
.
9 7 )
( 8 0
.
4 3 )
( 7 7 9 1 )
( 6 8
.
6 9 )
( 6 7
.
8 7 / 6 2
.
7 3 )
( 6 8 6 9 )
( 7 9
.
4 3 )
( 7 1
.
2 2 )
( 7 0
.
4 2 )
( 6 2
.
8 8 )
1 7 6
.
8 9
1 6
.
6 7
XRG
P SA
( 6 0
.
3 5 / 5 9
.
8 7 )
GXR
SPWD
G A ( 7 8
.
6 1 )
( 7 3
.
5 6 )
( 7 5
,
4 1 )
1 7 5
.
0 0
1 9
.
17
( 6 2
.
8 8 )
, 括号中的结果巫待于进一步证实 。
注 : G A一葡萄糖醛酸 ; R 一鼠李糖残基 ; X- 木糖残基 ; G葡萄糖残基 。
化学位移在 1 7 5 a 左右位于最低 场的孤 M ar c L ha ay e 等石药属其他海藻多糖组分的
峰是糖醛酸上竣基 的 C 6 峰 , 位于最高场化 谱图推测而 出 , 巫待于将多糖降解为寡糖分
学位移为 15 a一 20 a 的信号峰是 鼠李糖中甲 级后用二维核磁技术进一步证实 。
基 C 6 的吸收峰 , 由于附近没有干扰峰 , 易于 2 . 2 . 5 . 2 ’ H 一 N M R 光谱分析
识别 。 其他 C Z一 C S 信号峰 的位置 是根据
表 6 ’ H一 N M R 光谱分析结果
样品 化学位移 (劫
编号 H l H Z LI 3 H 4 H S H 6
R 5
.
3 8 4
.
1 8 ( 4
.
5 7 )
`
( 3
.
8 0 / 3
.
7 4 ) ( 3
.
9 6 ) 1
.
2 9
W P S G A ( 4
.
7 5 ) ( 3
.
4 6 / 3
.
4 2 ) 3
.
6 5 3
.
6 2 ( 3
.
8 0 / 3
.
7 4 )
X ( 4
.
5 7 ) ( 3
.
2 1 ) ( 3
.
5 9 ) ( 3
.
7 4 ) 3
.
3 2
R 5
.
4 9 4
.
0 6 3
.
9 3 1
.
4 1
A P S G A 4
.
7 1 ( 3
.
5 6 ) ( 3
.
7 6 ) ( 3
.
7 6 ) ( 3
.
9 3 )
X ( 4
.
1 2 ) ( 3
.
1 0 ) ( 3
.
5 8 ) ( 3
.
9 3 ) ( 3
.
4 5 )
R 5
.
3 8 ( 3
.
9 5 ) ( 3
.
8 1 ) 1
.
2 9
】)W P S G A 4 . 9 0 3 . 4 2 ( 3 . 6 3 ) ( 3 . 6 2 ) ( 3 . 8 1 )
X ( 4
.
5 8 / 4
.
2 3 ) ( 3
.
4 6 ) ( 3
.
8 1 ) ( 3
.
3 3 )
R 5
.
5 0 4
.
1 9 3
.
9 3 4
.
0 7 1
.
4 1
D A P S G A 5
.
0 2 3
.
5 9 ( 3
.
7 6 ) ( 3
.
7 6 / 3
.
7 4 ) 3
.
8 5
X 4
.
8 0 ( 3
.
4 5 ) ( 3
.
7 4 ) 3
.
8 2 3
.
5 6
, 括号中的结果函待于进一步证实 。
注 : G左葡萄糖醛酸 ; R 鼠李糖残基 ; -X 木糖残基 。
较低场 4 . 5储~ 5 . 5璐 处的信号为各组分
H l 的吸收峰 , H Z一 H S 的信号峰在 3 . 0 ~ 4 . s a
之间 〔6一 8〕 。 鼠李糖 6 位为一 甲基 , 在谱图上
1
.
3各处 有一强烈 吸收双峰 , 即为 鼠李糖 的
H 6 信号峰 。 与 ’ 3 C一 N M R 相似 , H Z~ H S 信
号峰的位置是根据 (下转第 19 页 )
《 中国海洋药物 》杂志 2 0 0 2 年第 6 期 ( 总第 90 期 ) l 9
表明 ,肿瘤患煮机体的抗氧化能力较低 ,体内
SO D (尤 其 为 M n 一 S O D ) 的 活性 下 降 , 且
SO D 的水平与肿瘤的发展密切相关「7川 。 因
此 ,根据本实验的结果可推断枝管藻多糖的
抑瘤作用可能与其降低荷瘤 鼠体内自由基水
平 ,提高 S O D 活性有关 , 但枝管藻 多糖的抗
氧化机制尚需进一步研究 。
不同来源的 F uc io da n 结构不同 ,其功能
存在着显著性差异 。 F uc io da n 的生物 活性
与它的化学组分特别是硫酸根的含量 、 相对
分子质量 、 一级结构和高级结构密切相关 仁,〕 ,
有关枝管藻多糖的生物学及化学性质将进行
深入研究 。
参考文献
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(上接第 7 页 )
石纯属其他海藻多糖组分的谱 图推测而出 ,
函待于二维核磁技术进一步证实 。
孔石苑多糖单糖种类多 , 连接比较复杂 ,
结构图谱上峰与峰重叠严重 。 如进一步研究
其连接结构 ,建议将多糖降解后用 S eP h a d e x
分级分离为组成 比较 简单的寡糖后进行 , 或
用二维核磁技术 。
致谢 :
中国科学院上海药物研 究所方积年老师
帮助本实验进行 了单糖含量分析 , 中国科 学
院生物物理研 究所周淑华老师帮助进行了变
温核磁共振光谱分析 ,在此时他们 的 热 心 帮
助表示诚挚的 感谢 。
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( 收稿 日期 : 2 0 0 2一 0 7一 0 7 )