全 文 ：No.6.2008
超声酸提江蓠硫酸酯多糖工艺
及其性质研究
郝晓敏,林海生,许金涛,何 辉,谷长生,宋文东 *
(广东海洋大学理学院化学系,湛江 524088)
摘要:采用超声波酸法从江蓠菜提取硫酸酯多糖,通过单因素实验和正交实验,确定制备最佳工艺
条件为酸度(HCl)0.20mol/L、时间为 25min、物料比 1∶40及温度 65℃。按最佳提取条件,采用
乙醇分级沉淀法制得多糖样品,多糖含量平均为21.71%,硫酸基含量平均为10.23%,蛋白含量平均
为0.76%,并对其理化性质进行研究。
关键词:江蓠菜;硫酸酯多糖;工艺;理化性质
中图分类号:TS201.1 文献标志码:A 文章编号:1005-9989(2008)06-0171-04
Researchonultrasonicacidextractionandpropertiesof
sulfatedpolysaccharidesfromgracilariatenuistipitata
HAOXiao-min,LINHai-sheng,XUJin-tao,HEHui,GUChang-sheng,SONGWen-dong*
(DepartmentofAppliedChemistry,ColegeofScience,GuangdongOceanUniversity,
Zhanjiang524088)
Abstract:Thispaperstudiedultrasonicacidextractionofsulfatedpolysaccharides.Preparationtechnologyof
sulfatedpolysaccharidesfromGracilariatenuistipitatahasbeenstudied:one-factorexperiment,oneafactor
experimentorthogonalexperimentwereinvestigated.Theoptimalconditionchosenextractionacidity(HCl)0.20
mol/L,extractiontime25min,ratioofmaterial1∶40andextractiontemperature65℃.Folowthiscondition,we
getthreesamplesusegradeprecipitationbyalcohol,theaveragecontentofpolysaccharides,sulfate,proteinis
21.71%,10.23%,0.76%respectively,andstudyonphysicochemicalproperty.
Keywords:Gracilariatenuistipitata;sulfatedpolysaccharides;technology;physicochemicalproperty
多糖类化合物在自然界的高等植物、藻类、细
菌类及动物体内均广泛存在,是生命物质的重要组成
成分。它不仅能够控制细胞分裂、还具有调节细胞生
长以及维持生命有机体正常代谢等方面的重要作用。
因此,从20世纪60年代以来,有关多糖的研究越来
越受到研究人员的关注和重视[1]。
海洋占地球总面积的1/3,蕴藏着极其丰富的生
物资源,是有机物的最大生产者。海藻是海洋生物资
源的重要组成部分,是海洋中有机物的原始生产者和
无机物的天然富集者(包括氯、溴、碘等卤素)。海藻
中含有丰富的多糖,占海藻干质量的一半以上,其中
的硫酸酯多糖对细胞具有免疫调节作用、抗肿瘤作
用、抗突变作用、诱导细胞分化、抗病毒等多种功
效。随着海藻的广泛应用和人们对硫酸酯多糖这一
类重要生命物质认识的深入,对硫酸酯多糖生物活性
的研究越来越受到重视,它的提取制备及应用成为生
物、医药、食品等行业研究的热点[2]。
江蓠属于红藻门、真红藻纲、杉藻目、江蓠科、
江蓠属,为热带性海藻,在我国的南海有广泛的分
布。江蓠不仅生长快、产量高,其经济价值也极为显
著。国内对江蓠的研究主要集中在各种江蓠琼脂的理
化性质及其受季节变化和不同世代的影响、琼脂的分
收稿日期:2007-10-07 *通讯作者
基金项目:广东省教育厅重点项目(0609084);广东海洋大学校选课题(0612178、0612179)。
作者简介:郝晓敏(1967—),讲师,主要从事天然产物制药及保健食品的研发工作。
提取物与应用
171
DOI:10.13684/j.cnki.spkj.2008.06.011
No.6.2008
级、各级分的组成及其化学结构等几方面,但对其硫
酸酯多糖的提取制备研究较少,且集中在热水[3]和超
声波方法[4]等,而用热酸液提取使得褐藻酸在较低pH
下难以溶解,也可增加硫酸酯多糖的提取率[5]。本文
结合上述的热水、超声波和酸法优点采用超声波辅
助热酸法从江蓠中提取岩藻硫多糖并探讨了其工艺
条件,同时对得到的产物进行理化性质研究,为江蓠
的综和利用和开发提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料和试剂
江蓠菜(产地汕头)、盐酸、95%乙醇、葡萄糖、
苯酚(蒸馏纯)、硫酸、牛血清蛋白(Sigma)、D-山梨醇
(BRSCRC生产)、考马斯亮蓝 G-250(Sigma)、硫酸
钾、氯化钡、 85%磷酸、五水硫酸铜、氢氧化钠、
酒石酸钾钠、三氯化铁、碘-碘化钾、石油醚等。
1.2 仪器
VU-2102C紫外可见光光度计:尤柯尼上海仪器
有限公司;DZF-6020真空干燥箱、GZX-9070MBE数
显鼓风干燥箱:上海博讯实业有限公司;RE52-99旋
转蒸发仪:上海亚荣生化仪器厂;AUY120-电子分析
天平:岛津;DL-5-B大容量离心机;KQ-500B超声
波器;DDSJ-308A电导率测定仪;pH酸度计等。
1.3 实验方法
1.3.1 原材料处理 干江蓠菜用水漂去杂、风干。粉
碎95%乙醇和等体积的石油醚脱脂处理2h,上清液
回收乙醇,残渣干燥用于提取多糖。
1.3.2 多糖提取流程 干江蓠→水漂去杂、风干→粉
碎90%乙醇脱脂处理2h→用HCl溶液浸取→超声波
提取→离心得滤液→滤液加NaOH中和→离心将上清
液浓缩→加乙醇至 60%→静置→离心沉淀→用乙醇
洗涤沉淀物→减压干燥得硫酸酯多糖粗品(A)。
粗多糖(A)→配制成水溶液→加乙醇至 20%→沉
淀(褐藻胶B)→离心→上清液加乙醇至 60%→离心→
沉淀用乙醇和丙酮浸洗→40℃干燥→硫酸酯多糖(C)。
1.3.3 多糖含量的测定(苯酚-硫酸法)[6] 精确称取葡
萄糖 0.05、0.10、0.15、 0.20、0.25、0.30g放入 50
mL容量瓶中配制成标准摩尔浓度溶液,分别吸取 1
mL于具塞试管中,加苯酚溶液 1.00mL,摇匀,再
加入浓硫酸 5.00mL,静止 15min后,摇匀,置 30
℃水浴30min,取出至室温,于波长490nm处测定
吸收度。以标准糖浓度(μmol/L)为横坐标,吸收度为
纵坐标,绘制标准曲线,得回归方程为:Y=
0.1728X+0.0308,相关系数r=0.995。
1.3.4 硫酸基的 Dodgson法定量测定[7] 称取 105℃
干燥至恒质量的 K2SO4固体溶于盐酸(1mol/L),配制
成0.6mg/mL溶液。取7支编好号码的试管,准确吸
取 K2SO4标准溶液 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10
mL和0.12mL,以水补至4.0mL,依次加入0.80mL
体积分数为50%的盐酸、4.0mL的山梨醇溶液(7mg/
mL)和 4.0mL的氯化钡(2mg/mL)溶液,混合均匀放
置10min,在448nm波长下测得其吸光度,根据浓
度和吸光度关系作标准曲线。回归方程为:Y=
0.0545X-0.0026,R=0.9772。
1.3.5 蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250法[8]
1.3.5.1 血清白蛋白标准溶液的配制 准确称取 100
mg牛血清白蛋白溶于100mL蒸馏水,低温保存。蛋
白试剂考马斯亮蓝G-250的配制:称取100mg考马
斯亮蓝 G-250,溶于 50mL乙醇(90%)中,加入 100
mL磷酸(85%),用蒸馏水定容到1000mL。
1.3.5.2 标准曲线
取 7支干净的 10mL具塞试管,分别加入 1.0
mg/mL的牛血清白蛋白标准溶液 0、0.01、0.02、
0.04、0.06、0.08、0.10mL,然后用无离子水补充到
0.1mL。最后各试管中分别加入 5.0mL考马斯亮蓝
G-250试剂,每加完一管,立即在旋涡混合器上混
合。2~5min后在 595nm波长下测得其吸光度,根
据浓度和吸光度关系做标准曲线。得回归方程:Y=
4.484884X+0.010442,R=0.990799。
1.3.6 硫酸酯多糖含量的测定
多糖提取率(%)=(VCfW2/W3W1)×100
图1 苯酚-硫酸法测定多糖含量的标准曲线
0 0.05 0.1 0.15 0.2
浓度/(mg/mL)
1.2
0.8
0.4
0
吸
光
度
图2 Dodgson法测定硫酸基含量的标准曲线
0.01 0.02 0.03 0.04
浓度/(mg/mL)
4.8
3.8
2.8
1.8
0.8
吸
光
度
图3 蛋白含量的标准曲线
11.2 15.8 22.4 28.0 33.639.2
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
吸
光
度
浓度/(μmol/L)
提取物与应用
172
No.6.2008
式中:W1为称取干江蓠的质量,g;
W2为由W1提取的硫酸酯多糖的质量,g;
W3为从 W2中称取的用于分析测定的硫
酸酯多糖质量,g;
V为溶解W3定容后的体积,L;
f为多糖的校正系数,f=0.9;
C为由回归方程计算所得多糖的浓度,g/L。
1.3.7 单因素实验 称取江蓠菜,在功率 500W超
声波作用下分别以不同浓度的HCl、提取时间、物料
比和提取温度进行单因素实验。
1.3.8 正交实验[9] 为了确定超声酸提的最佳工艺条
件,根据单因素实验结果,设计L9(34)正交实验。
1.3.9 电导率的测定 多糖溶液浓度为1mg/mL,以
蒸馏水为空白,于20℃测定。
1.3.10 多糖样品的鉴别反应 还原糖的鉴定:
Molisch反应、Fehling反应;淀粉鉴定:碘-碘化钾反
应;多酚类物质鉴定:三氯化铁反应;蛋白质的定性
鉴定:茚三酮反应;硫酸基定性鉴定:氯化钡-明胶
反应。
2 实验结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 HCl浓度的影响 功率 500W,温度 60℃,
时间20min,物料比 1∶60(g/mL)的条件下,考察 HCl
浓度对江蓠菜多糖提取的影响。
从图4可看出,随着HCl的浓度提高,多糖的提
取率也不断提高,当HCl浓度大于0.15mol/L时对提
取率的影响趋于平稳。HCl酸度选择0.15mol/L为宜。
2.1.2 物料比的影响 功率500W,温度60℃,时间
20min、0.15mol/LHCl的条件下,考察提取液固比对
江蓠菜多糖提取的影响。
由图5可知,随着液固比的不断增加,多糖的提
取率也不断增加,在液固比为1∶40时达最大值,1∶40
以后上升的幅度趋于平缓。这是因为增加溶剂的比
例有利于传质扩散,但在实际操作中溶液体积过大
不利于后续的浓缩,因此选择液固比1∶50为宜。
2.1.3 提取时间的影响 功率 500W,温度 60℃,
0.15mol/LHCl,物料比 1∶50(g/mL)的条件下,考
察提取时间对江蓠菜多糖提取的影响。
从图6可以看出,超声波酸法提取多糖时间消耗
明显缩短,随着浸提时间的增加,江蓠中多糖提取
率也有所增加,但 20min以后增加趋势缓慢。所以
选择提取时间为20min。
2.1.4 提取温度的影响 功率 500W,物料比为 1∶
50,时间 20min、0.15mol/LHCl的条件下,考察提
取温度对江蓠菜多糖提取的影响。温度单因素实验
表明:温度对江蓠多糖的提取率有显著的影响,温
度的上升伴随着多糖提取率的显著上升。选择温度
为65℃。
2.2 正交实验
根据单因素实验结果,设计L9(34)正交实验,实验
因素水平见表1。
采用的直观极差分析对江蓠多糖提取率结果表明
(表2),超声酸法提取多糖的最佳工艺条件为A3B1C3D3,
即盐酸浓度0.20mol/L、物料比 1∶40、提取时间为 25
min和温度65℃。此反应条件没有在正交实验表中出
现,按此实验条件反应制备的多糖提取率为 10.32。
比较各因素R值可知,RC>RD>RA>RB,因素对试验指
标影响的主次顺序是 CDAB,即提取时间影响最大。
提取时间和提取温度因数波动最大,其次是酸浓度和
物料比。
0 0.1 0.2 0.3
HCl浓度/(mol/L)
11
10
9
8
提
取
率
/%
图4 HCl酸度对江蓠多糖提取率的影响
1∶25 1∶35 1∶45 1∶55 1∶65 1∶75
11
10
9
8
提
取
率
/%
物料比
图5 物料比对江蓠多糖提取率的影响
5 15 25 35
时间/min
11
10
9
8
提
取
率
/%
图 6 时间对江蓠多糖提取率的影响
40 50 60 70
温度/℃
11.5
11
10.5
10
9.5
提
取
率
/%
图7 提取温度对江蓠多糖提取率的影响
表1 正交实验因素水平表
水平
因素
酸浓度/%A 料液比B 时间/minC
1 0.10 1∶40 15 55
2 0.15 1∶50 20 60
3 0.20 1∶60 25 65
温度/℃D
提取物与应用
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表2 正交实验方案及结果分析
实验号
因素
多糖提取率/%
A B C D
1 1 1 1 1 8.56
2 1 2 2 2 10.28
3 1 3 3 3 10.46
4 2 1 2 3 10.38
5 2 2 3 1 9.43
6 2 3 1 2 8.92
7 3 1 3 2 10.93
8 3 2 1 3 9.88
9 3 3 2 1 9.33
K1 29.3 29.87 27.36 27.32
K2 28.73 29.59 29.99 30.13
K3 30.14 28.71 30.82 30.72
k1 9.77 9.96 9.12 9.11
k2 9.58 9.86 10.00 10.04
k3 10.05 9.57 10.27 10.24
R 0.47 0.39 1.15 1.13
2.3 多糖的理化性质
按最佳工艺条件得到的粗多糖、褐藻胶、硫酸
酯多糖的理化性质见表3。由表3可知:3种多糖的蛋
白质含量很低,以C最低,仅为0.21%,3种硫酸多糖
的Molisch反应、Fehling反应、碘-碘化钾反应、三氯
化铁反应均为阴性,说明它们均不含有还原糖、淀粉、
多酚类物质。
3 结论
通过超声波酸法从江蓠菜提取硫酸酯多糖,通
过单因素实验,考察了酸浓度、时间、物料比及温
度对硫酸酯多糖提取率的影响,确定正交实验方案,
结合极差分析,得出最佳工艺条件为盐酸浓度 0.20
mol/L、提取时间为 25min、物料比 1∶40和温度 65
℃。按最佳提取条件制得多糖样品,多糖含量平均
为 21.71%,硫酸基含量平均为 10.23%,蛋白含量
平均为 0.76%,江蓠硫酸酯多糖是一类含有硫酸基
团的非还原性糖,无淀粉和非多酚类物质的杂多糖。
参考文献:
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品科学,2006,(2):141-143
表3 江蓠多糖产物理化性质表
项目 粗多糖A 褐藻胶B 硫酸酯多糖C
蛋白含量/% 1.49 0.57 0.21
多糖含量/% 24.34 21.57 19.22
硫酸基含量/% 11.08 9.95 9.67
颜色 褐色 褐色 灰白色
水溶性 好 好 好
电导率/(μs/cm) 142.2 121.3 112.4
Fehling反应 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-)
Molisch反应 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-)
碘-碘化钾反应 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-)
三氯化铁反应 阴性(-) 阴性(-) 阴性(-)
茚三酮反应 阳性(+) 阳性(+) 阳性(+)
硫酸基定性实验 阳性(+) 阳性(+) 阳性(+)
提取物与应用
福建省农业厅副厅长姜绍丰近日在杭州召开的中国茶
叶生产与消费论坛上透露,中国乌龙茶有八成出口到日本,
日本已成为中国乌龙茶的最大进口国。
姜绍丰说,日本是中国乌龙茶最主要的外销市场。
1980年,日本经销商以福建乌龙茶为原料创制罐装茶水获
得成功,开创世界茶水饮料的先河,促进了中国乌龙茶在
日本的销售,日本国内几度掀起乌龙茶热。2007年,中国
对日本出口乌龙茶 1.8万吨,出口额 4486万美元,分别占
乌龙茶总出口量与出口金额的82.9%和80%。
乌龙茶是中国的特有茶类,产区主要集中在福建、广
东、台湾三省。福建是乌龙茶原产地,也是全国乌龙茶面
积、产量、出口创汇第一大省,福建省乌龙茶面积、产量
都占全国的七成以上。
据姜绍丰介绍,中国乌龙茶出口始于 1951年,当年出
口量仅为 243吨。1981年出口量近 3000吨。自从 20世纪
80年代成功开发日本市场以来,乌龙茶出口进入快速增长
期,2001年后一直稳定在 2万吨左右,平均单价为每公斤
2.5美元,高于同期的红茶与绿茶价格。 (小文)
日本成为乌龙茶最大进口国
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