全 文 ：西北林学院学报 2011 , 26(4):104 ～ 107
Journal o f No r thw est Fo restry Univer sity
中华山蓼克隆的分子鉴定
　收稿日期:2010-05-06　修回日期:2010-07-05
　基金项目:国家自然科学基金(30800133)
　作者简介:李芳 ,女 ,本科 ,主要从事植物遗传多样性研究。
＊通讯作者:李钧敏 ,女 ,教授 ,硕士生导师 ,主要从事植物分子生态学研究。
李　芳1 ,宋垚彬2 ,陈　琢1 ,李钧敏1＊
(1 台州学院生命科学学院 ,浙江 临海 317000;2中国科学院植物研究所植被与环境变化国家重点实验室 ,北京 100093)
摘　要:采用 ISS R分子标记对 21个中华山蓼克隆进行了鉴定 ,结果表明:从 100 个 ISS R引物中
筛选出 8个引物 ,对 21个中华山蓼克隆进行 DNA扩增 ,共扩增出 84个清晰条带 ,其中 44条具多
态性 ,平均多态比率为 52.4%。共扩增出 73 种条带类型 ,其中特异性条带类型为 40种 。综合分
析这些条带类型 ,可知只要通过 8个引物中的 3个即可将所有的克隆鉴定出来 ,表明 ISSR技术在
分子水平上鉴定中华山蓼的克隆是一种行之有效的方法。
关键词:中华山蓼;克隆鉴定;ISSR
中图分类号:Q948.1　　　文献标志码:A　　　文章编号:1001-7461(2011)04-0104-04
M olecular Identification of Oxy ria sinensis Clones
LI Fang
1 , SONG Yao-bin2 ,CHEN Zhuo , LI Jun-min1＊
(1.S chool o f Li fe S ciences , TaizhouUn iver sity , Linhai , Zhej iang 317000 , China;
2.Isti tute o f Botany Vegetat ion and S tate K ey Laboratory o f En vironmental Change , Bei j ing 100093 , Ch ina)
Abstract:Tw enty one Oxyria sinensis clones w ere identif ied by means of ISSR molecular markers.The re-
sults show ed that 84 distinguishable bands w ere amplif ied using 8 prime rs , which w ere selected f rom a to-
tal of 100 ISSR markers.Among them , 44 bands w ere polymorphic and the percentage of polymorphic
bands reached 52.4%.Seventy three kinds of band profi les were determined in 21 clones and 40 profi les
were specif ic.Comprehensive analy sis of these bands show ed tha t 21 clones could be identified by only
three primers:UBC 840 , UBC 864 and UBC 889.The resul ts that ISS R technique could be a reliable and
ef fective to ol to identify Oxyria sinensis clones.
Key words:Oxyria sinensis;clone identification;ISS R
　　在长期进化过程中 ,植物种群的克隆结构及克
隆多样性是种群进化过程中适应环境的结果 。一直
以来 ,人们普遍认为克隆生长将会导致种群内基因
型变异和遗传变异的下降[ 1] 。近年来 ,利用分子标
记进行克隆鉴定的研究越来越多[ 2] ,但运用等位酶 、
RAPD 、AFLP 和 ISS R等技术对克隆植物种群遗传
多样性水平的研究发现 ,克隆植物的遗传多样性水
平并不象预期的那么低 ,一些克隆植物种群具有较
高的遗传多样性[ 3-8] ,而且不同的克隆植物种群遗传
多样性水平有较大差异。深入研究克隆植物种群的
克隆结构及克隆多样性是了解克隆植物种群的形
成 、维持和衰退机制的重要方面 ,同时对研究植物定
居 、侵殖和演替的机理也具有重要意义。
中华山蓼(Oxyria sinensis)为蓼科(Po ly go-
naceae)山蓼属(Qxyria)多年生草本植物 ,为中国特
有种 ,主要分布在四川 、云南和西藏 , 生长在海拔
1 600 ～ 3 800 m的山坡 、山谷 、路旁和田边 。该物种
具有强烈的克隆繁殖能力 ,可通过地下根状茎进行
克隆生长[ 9] 。目前有关中华山蓼的研究主要集中在
化学成分[ 10] 、繁殖分配[ 9] 、土壤的重金属污染与防
治等几个方面。
早期的研究一般根据形态变异和其它的表型性
状进行克隆鉴定 ,或是直接根据分株之间的连接情
况来确定克隆系[ 9 , 11] 。随着生化技术和分子生物学
手段的迅速发展 ,出现了一大批比形态学指标灵敏
得多的适用于克隆鉴定的遗传标记[ 10] 。简单重复
序列区间 (inter simple sequence repeat , ISSR)是
一种基于 PCR的分子标记技术[ 11] ,具有多态性水
平高 ,操作简单 ,重复性好和稳定性高等特点 ,能够
检测出丰富的遗传多样性 。本文利用 ISSR分子标
记对 21个中华山蓼克隆进行了分子标记鉴定 ,以获
得中华山蓼克隆鉴定的引物组合 ,为中华山蓼克隆
多样性的进一步分析提供理论基础 。
1　材料与方法
1.1　材料
中华山蓼采自中国四川马尔康县和理县 。从每
一典型的斑块中采集 1个中华山蓼个体 ,共采集 21
个个体。
1.2　方法
1.2.1　DNA 提取与定量　采用改进的 SDS 法提
取总 DNA[ 12] 。DNA 经 0.8%琼脂糖凝胶电泳分
析 ,用 GIS凝胶成像分析系统(上海天能科技服务
公司)拍照定量 , 稀释成终浓度 10 ng · μL -1 ,
-20℃保存 ,备用。
1.2.2　 ISS R的反应体系　ISSR引物是根据加拿
大哥伦比亚大学(Set No.9 , No.801-900)提供的
序列 ,由上海生工生物工程公司合成。从 100个引
物中筛选出可扩增出清晰条带 ,条带重复性好 ,特异
性高 ,同时阴性对照中无带的 8个引物用于 PCR扩
增[ 13] 。扩增反应在 PTC-220 热循环仪(美国伯乐
公司)中进行。经过优化 ,确定了最适的 ISSR扩增
反应条件为:10 μL 的 PCR反应体积中 , 0.3 mmol
·L-1 dN TP , 1 Taq酶配套缓冲液(10 mmol· L-1
T ris · HCl pH 9.0 , 50 mmo · L -1 KC l , 0.1%
T ri ton X-100), 1 mg · mL -1牛血清白蛋白 , 10 ng
模板 DNA , 10 pmo l引物(上海 Sangon 公司), 0.3
U Taq DNA 聚合酶(金思特公司)。 ISSR-PCR 扩
增采用 Touch-down PCR扩增程序:94 ℃预变性 5
min , 94 ℃变性 30 s , 57 ℃退火 1 min(每个循环降
低 0.5 ℃),72 ℃延伸 1.5 min ,每个循环下降 0.5
℃,共 10个循环;94℃变性 30 s ,52 ℃退火 1 min ,
72 ℃延伸 1.5 min ,共 25个循环;72 ℃延伸 5 min 。
所有反应在美国 Bio-Rad 公司生产的 PTC 220
PCR仪中进行 。
1.2.3　PCR产物鉴定　扩增产物在 1.6%的琼脂
糖凝胶(含0.5μg ·mL-1溴化乙锭)中电泳 ,电泳缓
冲液为 0.5×TBE ,用 PCR参照物(金思特公司)做
分子量标记 , 在 80 mA的恒流下电泳 1.5 h 。电泳
结束后于GIS 凝胶成像分析系统(上海天能科技服
务公司)拍照保存 。
1.2.4　数据统计与分析　根据片段大小排列并记
录 ,条带有计为“1” ;条带无计为“0” ,构建原始数据
0-1矩阵 ,仅记录清晰 、可重复的条带 。有一个条带
不同的个体即判断为不同的克隆 。
2 　结果与分析
2.1　ISSR-PCR扩增结果
从 100个 ISS R引物中筛选出 8个引物 ,其中
引物 UBC 890的扩增结果(图1)。根据扩增产物分
子大小结果 ,只对清晰 、明亮 、重复性好的条带进行
统计。8个引物在 21 个个体中共扩增出 84 个条
带 ,每个引物扩增的条带数为 9 ～ 13条 ,平均每个引
物扩增的条带数为 10.5 ,多态性条带数为 44条 ,多
态比率为 52.4%(表 1)。
表 1　ISSR引物序列和每个引物的多态性条带数
Tab le 1　Sequen ce of ISSR primers and the num ber
of polymorphic band s of each primer
引物 序列 扩增条带数 多态条带数 多态带百分率/ %
UBC808 (AG)8C 9 4 44.40
UBC826 (AC)8C 10 4 40.0
UBC840 (GA)8YT 12 6 50.0
UBC842 (GA)8YG 10 8 80.0
UBC864 (ATG)6 10 5 50.0
UBC888 BDB(CA)7 9 2 22.2
UBC889 DBD(AC)7 11 10 90.9
UBC890 VHV(GT)7 13 5 38.5
　　Y=(C , T)
图 1　中华山蓼 ISSR 扩增结果(引物 UBC 890)
M:DNA marker;1-21:21个分株.
Figure 1 The IS SR amplif ication resul t s of Qxyria sinensi s
(primer UBC 890)M:DNA marker;1-21:21 ramets.
105第 4 期 李芳 等　中华山蓼克隆的分子鉴定
2.2　中华山蓼克隆的鉴定
用 8个引物对 21个中华山蓼个体进行 PCR的
扩增(表 2),扩增出的条带类型最多的为 UBC 840 、
UBC 842和 UBC 864 ,均为 13种类型 ,特异性条带
类型数分别为 10 、7和 9种;其次是 UBC889 ,为 10
种条带类型 ,特异性条带类型为 6 种;再次是 UBC
808 ,扩增出 7种条带类型 ,其中 3种为特异性条带
类型;UBC 826 、UBC 890 和 UBC 888 分别扩增出
6 、6和 5种条带类型 ,特异性条带类型分别为 1 、2 、2
种 。8个引物共扩增出特异性条带类型 40种 ,占总
条带类型的 54.8%。中华山蓼个体除第 12 和 20
号无特异性条带类型外 ,其余均有 1 ～ 3个不等的特
异性条带类型。拥有特异性条带类型的个体能直接
通过对应的引物进行扩增而直接区分出来。经分
析 ,只要采用其中多态性较高的 UBC 840 、UBC 864
和 UBC 889三个引物 ,即可对 21个中华山蓼克隆
进行准确的鉴定。
表 2　中华山蓼克隆鉴定结果
T able 2　 Identi ficat ion of Qxyr ia sinensi s clones
个体编号 各引物扩增出的条带类型
UBC808 U BC826 UBC840 UBC842 UBC 864 UBC888 UBC889 UBC890
克隆编号
1 A A A A A A A A 1
2 B B B A B A B B 2
3 C C A B C B B B 3
4 D A C C D A B C 4
5 D C D C E C B D 5
6 D D E D F D C E 6
7 A D F E B A D C 7
8 A D G F F E E F 8
9 C E H G G E F D 9
10 A F I G H D G D 10
11 B C J H I C H F 11
12 A A K I J C I D 12
13 E D K I A A I D 13
14 D D L J K A B D 14
15 A D M A L A B D 15
16 D A E K M A A B 16
17 A C E L A A I B 17
18 C A E M J A I C 18
19 F E E K M A J C 19
20 D C E K M A A C 20
21 G F K H A A J B 21
　　A-M :每个引物产生的条带类型。
3　讨论
ISSR分子标记技术兼具 SSR、RAPD 、RFLP 、
AFLP 等分子标记的优点 。与 SSR相比 , ISSR 不
需要预先获知序列信息而使成本降低 ,且多态性更
丰富;与 RA PD相比 , ISS R重复性高 ,稳定性好 ,同
时具备 RAPD的简便 、易操作等特点[ 14] ;与 RFLP 、
AFLP 相比 , ISSR更快捷 、成本较低 、DNA 用量小 、
安全性较高[ 15] 。由于上述优点 , ISS R标记技术在
植物分子生物学研究中得到广泛的应用 。同时也把
ISS R技术引入到克隆植物的研究中 ,如李钧敏[ 16]
等对入侵植物薇甘菊(Mikania micrantha)的克隆
结构和多样性的研究上就运用了 ISSR技术来鉴定
基株并做出分析;此外 ,在沙鞭(P sammochloa v i l-
losa)[ 17] 和蛇莓(Duchesnea indic)[ 18] 等克隆植物的
研究中也都运用了 ISSR 技术对基株进行克隆鉴
定 。
目前对中华山蓼的研究很少 ,本研究利用筛选
出来的 8 个引物对 21 个中华山蓼个体的总 DNA
进行 PCR扩增 ,结果共获得 84个条带 ,其中 44个
为多态性条带 ,多态性百分率为 52.4%。遗传鉴定
的效率和精确度可能受给定植物的可用多态条带的
106 西北林学院学报 26 卷　
数量的影响[ 17] 。本研究发现:ISS R标记多态性强 ,
能很好地区分中华山蓼的克隆个体 ,采用的 8 种引
物均能扩增出个体特异性条带 ,综合分析这些谱带 ,
仅需其中 3种引物即可将形态上极难鉴别的克隆准
确鉴定出来 。因此 ,利用 ISS R分子标记进行克隆
植株中华山蓼的分子鉴定可行且相当有效。
参考文献:
[ 1] 　BRZOSKO E , WRóBLEWSKA A , RA TKIEWICA M.Spatial
genet ic st ructure and clon al diversi ty of i sland populat ions of
ladys slipper (Cypripedium calceolu s)f rom the Biebrza Na-
ti onal Park(n orth east Poland)[ J] .Molecular Ecology , 2002 ,
11(2):2499-2509.
[ 2] 　CASTIGLIONE S , WANG G , DAMIANI G , et a l.RAPD
fingerp rin t s for identif icat ion and for tax onom ic s tu dies of E lite
poplar(Populu s S pp)clon es[ J ] .Theoret ical and Applied Ge-
net ics , 1993 , 87(1-2):54-59.
[ 3] 　ELLST RAND N C , ROOSE M L.Pat tern s of gen otypic di-
versi ty in clonal plant species[ J] .American Jou rnal of Bota-
ny , 1987 , 74(1):123-131.
[ 4] 　FA LINSKA K.Genet disintegrat ion in Filipendula ulmaria
consequences fo r populat ion dy namics an d vegetation su cces-
sion[ J] .Journal of Ecology , 1995 , 83(1):9-21.
[ 5] 　K UDOH H , DH IBAIK E H , WHIGHAM D F , et al.Genet
st ructu re and determ inants of clonal st ructu re in a tem perate
deciduous w oodland herb , Uvularia perfoloata[ J] .Jou rn al of
Ecology , 1999 , 87(2):244-257.
[ 6] 　STENST ROM A , JONSSON B O , JONSDO TTI R I S , et al.
Genetic variation and clonal diversity in four clonal sedges
(Carex)along th e A rctic coast of E urasia[ J] .Molecular E col-
ogy , 2001 , 10(2):497-513.
[ 7] 　XIE Z W , LU Y Q , GE S , et a l.Clonalit y in wi ld rice(Oryza
rufipogon , Poaceae)and i t s implication s for con servation man-
agemen t[ J] .Am erican Journal of Botany , 2001 , 88(6):1058-
1064.
[ 8] 　陈小勇 , 宋永昌.青冈种群克隆多样性及其与环境因子的关
系[ J] .植物生态学报 , 1997 , 21(4):342-348.
CHEN X Y , SONG Y C.C lonal diversi ty in cyclobalan op sis
glauca p opu lations and i ts relationship w ith en vi ronm en tal fac-
to rs[ J] .Acta Phytoecologica Sinica , 1997 , 21(4):342-348.
[ 9] 　赵方 , 杨永平.中华山蓼不同海拔居群的繁殖分配研究[ J] .
植物分类学报 , 2008 , 46(6):830-835.
ZHAO F , YANG Y P.Reproductive allocation in a dioecious
perennial Oxyr ia sinensi s(Polygonaceae)along alti tu dinal gra-
dients[ J] .Journal of Sy stematics and Evolut ion(f ormerly Ac-
t a Phytotaxon omica Sinica), 2008 , 46(6):830-835.
[ 10] 　李兴玉 , 龙春林 , 王跃虎 , 等.中华山蓼化学成分研究[ J] .
天然产物研究与开发, 2008 , 20(5):816-820 , 845
[ 11] 　ZIETKIEWIEZ E , RAFA LSKI A , LABUDA D.Genome
fingerp rinting by simple s equence repeat(SSR)-anch ored pol-
ymerase chain reaction am plifi cation[ J] .Genomics , 1994 , 20
(2):176-183.
[ 12] 　李钧敏 , 柯世省 , 金则新.濒危植物七子DNA 的提取及分析
[ J] .广西植物 , 2002 , 22(6):499-502.
　LI J M , KE S S , JIN Z X.Ex t ract ion and determinat ion of
DNA from Hep tacod ium m iconioides[ J] .Guihaia , 2002 , 22
(6):499-502.
[ 13] 　顾婧婧 , 金则新 , 李钧敏 , 等.乌药 IS SR 扩增条件的优化
[ J] .西北林学院学报 , 2008 , 23(6):94-99.
　GU J J , JIN Z X , LI J M , et al.Optimization of the IS SR
condit ions in Lindera aggregate[ J] .Jounal of Northw es t For-
es t ry Universi ty , 2008 , 23(6):94-99.
[ 14] 　金则新 , 李钧敏.濒危植物长叶榧 ISSR-PCR反应体系的建
立[ J] .西北林学院学报 , 2006 , 21(5):94-96.
　JIN Z X , LI J M .Es tablis hment of IS SR-PCR reaction sys-
t em of endangered plant Torrey a jackii[ J] .Journal of No rth-
w est Fores t University , 2006 , 21(5):94-96.
[ 15] 　朴红梅 , 李万良 , 穆楠 , 等.ISSR标记的研究与应用[ J] .吉
林农业科学 , 2007 , 32(5):28-30.
[ 16] 　LI J M , DONG M.Fine-s cale clonal st ructu re and diversity
of invasive plant Mikania micrantha H .B.K.an d it s plant
parasi te Cuscuta cam pestri s Yunker[ J] .Biological In vasions ,
2009 , 11(3):687-695.
[ 17] 　LI A , GE S.Gen et ic Variat ion and clonal diversity of Psam-
mochloa vi l losa(Poaceae)detected by IS SR markers[ J] .An-
nals of Botany , 2001 , 87(5):585-590.
[ 18] 　宋文静 , 李钧敏 , 金则新.克隆植物蛇莓基株的分子鉴定
[ J] .植物研究 , 2010 , 30(1):111-115.
　SONG W J , LI J M , JIN Z X.Molecular ident ifi cation of
gen ets of clonal plan t Duchesnea ind ica [ J] .Bu lletin of Bo-
t anical Research , 2010 , 30(1):111-115.
107第 4 期 李芳 等　中华山蓼克隆的分子鉴定