全 文 ：收稿日期:2006-11-08
*湖北省自然科学基金项目(2003ABA095)资助
缪礼鸿 ,男 , 1965年生 ,博士 ,副教授.工作单位:武汉工业学院生物与制药工程系 ,武汉 430023. E-mail:lhmiao2002@yahoo. com. cn
1株异养型绿球藻的生长特性及营养价值评价*
缪礼鸿　文金丽　邹有红　王　琛
(武汉工业学院生物与制药工程系 , 武汉 430023)
摘要　对分离到的 1 株异养型绿球藻(Chlorococcum sp. )的碳源 、氮源及其它培养特性进行了研究 , 并分析
了该藻种在不同氮源及其水平下的氨基酸组成和含量。试验结果表明:该绿球藻异养培养的最佳碳源和氮源分
别为葡萄糖和尿素;最适 pH 值为 7. 0～ 8. 0;最适培养温度 30 ℃左右 , 最适异养培养条件下的倍增时间为 5 h
左右。在含 1 倍和 2倍氮浓度的培养条件下 ,绿球藻的粗蛋白含量分别达 30. 8%和 36. 6%。相同氮浓度下 ,氮
源对氨基酸组成和含量无明显影响。
关键词　绿球藻;异养生长;氨基酸
中图法分类号　Q 949. 21+7 　　文献标识码　A　　　文章编号　1000-2421(2007)04-0533-05
　　微藻中富含蛋白质 、氨基酸和维生素等营养成
分 ,是虾 、蟹等水产品的重要饵料[ 1-2] 。有研究报道
微藻中的某些藻类 ,如小球藻(Chlorel la )可以在无
光照的条件下利用有机碳源进行异养生长。与自养
相比 ,异养条件下可以增加微藻的细胞培养密度 ,获
得较高的生物量[ 3] 。微藻在生长过程中能有效去除
废水中的氮 、磷等成分 ,改善水质[ 4-5] 。邱昌恩等[ 6]
对自养绿球藻的生长及生理特性研究的结果表明 ,
绿球藻(Chlorococcum)是一种很好的耐氮微藻。但
有关异养型绿球藻的研究国内尚未见报道。笔者对
1株自污泥中分离纯化得到的异养绿球藻的生长特
性及氨基酸含量进行了分析 ,旨在为该藻种在相关
领域的应用提供理论依据 。
1　材料与方法
1. 1　藻　种
异养绿球藻(Chlorococcus sp.)为本研究分离
获得;土生绿球藻(Chlorococcus humicola)为中国
科学院水生生物研究所提供。
1. 2　培养基
绿球藻原始分离培养基为牛肉膏蛋白胨培养
基;绿球藻生长及营养试验采用藻类基础培养基
BG11。自养培养时不加碳源 ,异养培养时每升培养
基中加入 10 g 葡萄糖 。进行碳源和氮源试验时 ,其
种类和浓度按不同的配方设计要求添加 。配制不同
pH 值的培养基时 , 分别采用 NaH 2PO4 H 2O /
Na2HPO 4 2H2O (pH 7. 0 ～ 8. 0)和 Na2CO 3 /
NaHCO 3(pH 9. 0)缓冲液。味精废水培养基为某
味精厂的发酵母液 ,经适当稀释 ,将 NH4 +-N 浓度
调至 3 152 mg /L ,pH 调至 7. 5 ,经灭菌后备用 。
1. 3　绿球藻菌种的分离与培养方法
称取 10 g 黑液处理好氧活性污泥 ,用无菌水进
行系列稀释后涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上 ,28 ℃
培养箱中培养 5 d ,观察到平板上有绿色单菌落长出
后 ,挑取单菌落经纯化后获得纯的藻种。绿球藻液
体摇床培养条件为:28 ℃20 ～ 40 h , 180 r /min。
1. 4　绿球藻细胞数量及生物量的测定
藻细胞数量采用血球计数板计数[ 7] 。生物量的
测定采用浊度法和干重法 。浊度法用 721分光光度
计测定培养样液在 540 nm 处的吸光度(OD540 nm);
干重法为 1 L 培养液经 4 000 r /min离心 10 min ,洗
涤后收集湿藻体于 80 ℃恒温干燥至恒重 ,测干藻体
重量 。
1. 5　叶绿素及还原糖含量测定
叶绿素含量测定采用丙酮提取比色法[ 8] 。还原
糖含量测定采用 3 , 5-二硝基水杨酸比色定糖法
(DNS 法)。
1. 6　粗蛋白及总氮的测定
粗蛋白测定采用微量凯氏定氮法[ 9] 。总氮测定
第 26卷 第 4期
2007 年　8 月
华　中　农　业　大　学　学　报
Journal o f Huazhong Ag ricultural Unive rsity
Vo l. 26　No . 4
Aug. 2007 , 533～ 537
采用过硫酸钾氧化 -紫外分光光度法[ 10] 。
1. 7　氨基酸含量分析
绿球藻在异养条件下经摇床培养 40 h后 ,4 500
r /min 离心 10 min ,收集菌体 ,于 55 ℃烘箱中烘干 ,
磨碎后测定其氨基酸含量 , 测定仪器采用美国
Waters公司的 HPLC分析仪 。
2　结果与分析
2. 1　绿球藻的分离与形态观察结果
采用稀释平板分离法 ,从牛肉膏蛋白胨平板上
获得了 1种单菌落 、呈深绿色的菌株 ,镜检确认为 1
种单细胞的藻类 。进一步在含葡萄糖和硝酸钠的藻
类培养基 BG11上划线分离纯化后 ,制备水浸片 ,用
400倍光学显微镜进行形态观察 ,根据所观察到的
细胞形态及分裂方式可以将其初步归为绿球藻属
(Chlorococcus)(图 1)。
图 1　绿球藻(Chlorococcus sp. )(400×)
Fig. 1　The photomicrograph of Chlorococcus sp.(400×)
2. 2　分离藻种的异养性验证结果
将分离到的绿球藻经培养后按 5%接种量分别
接种于 2 瓶含葡萄糖培养液的 BG11中 ,将其中 1
瓶用黑布包裹 ,使培养液完全避光 ,另 1 瓶不包裹 ,
一同进行摇床培养 ,然后分别于 24 h 和 36 h 取样
计数藻细胞数量 。结果表明 ,24 h取样时 ,未用黑
布包裹的样品藻细胞数量明显高于用黑布包裹的样
品藻细胞数量 , 2个样品中的藻细胞数量分别达每
毫升 1. 3×108 个和 4. 2×107 个;但 36 h取样时 , 2
个样品中的藻细胞数量接近 ,分别为每毫升 2. 3×
10
8 个和 2. 1×108 个 。此结果表明 ,在完全避光条
件下 ,分离获得的绿球藻可以利用葡萄糖为碳源进
行异养生长。与未避光培养的样品相比 ,完全避光
培养的绿球藻培养早期细胞数量增长缓慢 ,但培养
后期细胞数量的增加明显加快 。这可能是由于绿球
藻在生理上从混合营养到完全异养的转换过程中细
胞的增长有一个停滞期的缘故[ 11] 。
检测绿球藻在未进行光照的摇瓶培养条件下对
葡萄糖的利用结果表明 ,随培养时间的延长 ,培养基
中葡萄糖浓度直线下降 , 40 h 时降至 0. 7 mg /mL ,
培养基中 90%的葡萄糖已被消耗 。表明该绿球藻
能很好地利用葡萄糖进行生长 ,具有异养性藻类的
显著特征 。而对照藻种土生绿球藻在含葡萄糖的
BG11培养基上不进行光照培养时 ,藻体由接种时
的绿色变成黄色 ,没有生长的迹象 。
2. 3　绿球藻的生长曲线
将绿球藻按 10%的接种量接入新鲜的含
10 g /L葡萄糖的 BG11液体培养基中 ,每隔 3 h 取
样测藻细胞数量及吸光度值 ,制成生长曲线(图 2)。
根据图 2-A 的生长曲线 ,计算出绿球藻异养条件下
的世代时间为 4 ～ 5 h。比较图2-A 和图 2-B 可以看
出 ,当藻细胞数量达到最大时 , 其吸光度值仍在上
升 ,约延迟 6 h 后才达到最大值。这可能与藻细胞
的代谢特点有关 ,当细胞数量不再增加时 ,藻细胞对
培养基中氮素吸收仍在进行 ,叶绿素含量不断增加 ,
导致吸光度值上升。
　　　　　　　　　　　　　A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　B
图 2　绿球藻生长曲线
Fig. 2　The growth curve of Chlorococcus sp.
A.培养时间与细胞数量的关系 Relat ionship betw een culture t ime and the numbers of cell s;
B. 培养时间与吸光度值的关系 Relationship betw een cul tu re tim e an d the opt ical den sity values
534 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 26 卷　
2. 4　不同碳源对绿球藻生长的影响
在含 1 g /L NaNO 3 的 BG11培养基中分别加
入浓度为 10 g /L 的蔗糖 、葡萄糖和甘油作为碳源 。
结果表明 ,葡萄糖为绿球藻异养培养的最佳碳源 ,藻
细胞数量可达每毫升 2. 6×108 个 ,而以蔗糖和甘油
为碳源培养时藻细胞数量分别为每毫升 1. 3×108
个和 7. 0×107 个。
用含不同浓度的葡萄糖进行异养培养的结果表
明(图 3):葡萄糖浓度在 5. 0 ～ 12. 5 g /L 范围内 ,绿
球藻的吸光度值变化不大。葡萄糖浓度为 10 g /L
时 ,藻液的吸光度值达到最大 。当培养基中的葡萄
糖浓度达 15. 0 g /L 时 ,藻液颜色由深绿转变为黄绿
色。有报道表明过高的糖浓度会抑制藻类叶绿素的
合成[ 11] 。
图 3　不同葡萄糖浓度对绿球藻生物量的影响
Fig. 3　Effects of different glucose concentrations
on the optical density values of Chlorococcus sp.
2. 5　不同氮源对绿球藻生长及叶绿素含量的影响
在含 10 g /L 葡萄糖的 BG11 基础培养基中
分别加入硝酸钾 、硝酸钠 、尿素 、硫酸胺和蛋白胨
作为氮源 ,培养基中 N 的浓度为 0. 01 mol /L ,比
较这 5 种氮源对绿球藻异养生长的影响 。结果
表明 ,绿球藻在以尿素为氮源的培养基中细胞数
目最多达 2. 7×108 个 ,其次为硝酸钾和硝酸钠 ,
藻细胞数量分别达每毫升 1. 8×108 个和1. 7×
108 个;蛋白胨和硫酸胺作为唯一氮源的培养基
中生长最差 ,藻细胞数量分别只有每毫升 7. 0×
10
7 和 8. 0×107 个 。
采用不同浓度的 NaNO3 培养绿球藻的试验结
果表明:当 NaNO3 浓度为 1 g /L 时 ,藻液的 OD 值
接近最大值 ,在 N aNO 3 浓度 1 ～ 3 g /L 范围内藻细
胞的生物量增加缓慢。当 NaNO 3 浓度从1 g /L增
加到 2 g /L 时 , 叶绿素的含量几乎增加1倍(图 4)。
由此可以推断 ,在氮源丰富的条件下 ,绿球藻可以吸
收超过自身生长需要的过量的氮素 ,以叶绿素的形式
储存于叶绿体中 ,而在其他条件适合而仅缺氮源的情
况下 , 叶绿素可降解放出氮以供细胞生长。但
NaNO3 浓度超过3 g /L时 ,细胞数量和叶绿素含量都
下降 ,表明过高的氮浓度会抑制绿球藻细胞的生长 。
图 4　不同 NaNO3 浓度对藻细胞数量及叶绿素含量的影响
Fig. 4　Effects of different sodium nitrate concentrations
on the numbers of cells and chlorophyll content
of Chlorococcus sp.
2. 6　温度和 pH值对绿球藻生长的影响
采用 20 ℃、25℃、30℃和 35 ℃4种不同培养温
度的生长对比试验结果表明 ,异养绿球藻的最适培
养温度为 30 ℃左右。
按 5%接种量将藻液接种到起始 pH 为 7. 0 、
8. 0 、9. 0 的含葡萄糖和硝酸钠的 BG11 培养基液
中 ,28 ℃摇床培养 ,不同的时间取样测定 OD 值 ,结
果显示 ,该绿球藻在 pH 7. 0 ～ 8. 0的中性到偏碱性
的条件下生长良好。当培养基的 pH 为 9. 0时 , OD
值显著降低 ,绿球藻的生长受到抑制(图 5)。
图 5　pH值对绿球藻生长的影响
Fig. 5　Effects of different pH on the growth
of Chlorococcus sp.
2. 7　不同氮源及氮素水平下异养绿球藻的氨基酸
组成及含量分析
　　对异养培养条件下绿球藻的氨基酸分析结果见
表 1。由表 1可知 ,相同氮素浓度下 ,不同氮源培养
的绿球藻的氨基酸含量很接近 。不同的氮素浓度
下 ,绿球藻的氨基酸含量有一定差异 ,但在培养基含
535　第 4 期 缪礼鸿等:1 株异养型绿球藻的生长特性及营养价值评价 　
氮量增加 1倍的条件下 ,绿球藻的氨基酸含量只增
加约 6%～ 8%。用味精废水培养的绿球藻的氨基
酸含量比其他 2种氮源培养的稍低 ,可能与味精废
水中所含的氮素浓度偏高有关 。
表 1　不同氮源及水平下绿球藻的氨基酸含量与组成1)
Table 1　The amino acid contents and compositions of Chlorococcus sp. cul tured with different nitrogen sources and concentrations
氨基酸
A A
1倍硝酸钠2)
含量7) /
(mg g - 1)
百分组
成8) /%
2倍硝酸钠3)
含量7) /
(mg g - 1)
百分组
成8) /%
1倍尿素4)
含量7) /
(mg g - 1)
百分组
成8) /%
2倍尿素5)
含量7) /
(m g g - 1)
百分组
成8) /%
味精废水6)
含量7) /
(mg g - 1)
百分组
成8) /%
天冬氨酸 Asp 22. 03 9. 98 21. 54 8. 96 21. 79 9. 74 22. 54 9. 45 19. 78 9. 67
丝氨酸 Ser 26. 43 11. 98 32. 08 13. 34 28. 87 12. 91 29. 79 12. 49 18. 94 9. 26
谷氨酸 Glu 29. 57 13. 40 30. 34 12. 62 28. 17 12. 59 29. 08 12. 20 28. 14 13. 76
甘氨酸 Gly 14. 07 6. 38 16. 40 6. 82 16. 13 7. 21 16. 45 6. 90 18. 69 9. 14
组氨酸 H is* 2. 97 1. 35 4. 17 1. 73 3. 89 1. 74 3. 97 1. 66 1. 93 0. 94
精氨酸 Arg * 12. 79 5. 80 12. 94 5. 38 11. 54 5. 16 13. 67 5. 73 14. 54 7. 11
苏氨酸 Th r* 12. 12 5. 49 10. 53 4. 38 11. 48 5. 13 12. 52 5. 25 9. 78 4. 78
丙氨酸A la 17. 41 7. 89 17. 31 7. 20 16. 52 7. 39 17. 15 7. 19 15. 97 7. 81
半胱氨酸 Cys 4. 98 2. 26 8. 10 3. 37 6. 89 3. 08 7. 09 2. 97 3. 54 1. 73
酪氨酸 Ty r 7. 15 3. 24 8. 16 3. 39 7. 94 3. 55 7. 13 2. 99 7. 12 3. 48
结氨酸 Val* 11. 57 5. 24 12. 32 5. 12 12. 53 5. 60 12. 77 5. 36 11. 48 5. 61
蛋氨酸 Met * 2. 76 1. 25 3. 34 1. 39 3. 07 1. 37 3. 98 1. 67 2. 53 1. 24
赖氨酸 Lys* 14. 14 6. 41 15. 15 6. 30 13. 89 6. 21 15. 32 6. 42 13. 94 6. 82
异亮氨酸 Ile* 7. 59 3. 44 9. 18 3. 82 9. 16 4. 09 9. 32 3. 91 7. 10 3. 47
亮氨酸 Leu * 19. 78 8. 96 22. 27 9. 26 15. 45 6. 91 21. 25 8. 91 18. 98 9. 28
苯丙氨酸 Phe* 15. 32 6. 94 16. 64 6. 92 16. 37 7. 32 16. 42 6. 89 12. 02 5. 88
总必需氨基
酸∑EAA 99. 04 44. 88 106. 54 44. 30 97. 38 43. 53 109. 22 45. 80 92. 30 45. 14
总氨基酸 TAA 220. 68 100. 00 240. 47 100. 00 223. 69 100. 00 238. 45 100. 00 204. 48 100. 00
　1)*:必需氨基酸 EAA;2)One t imes concent rat ion of NaNO3 ;3)T w o tim es concent ration of NaNO 3;4)One t imes concen tration of urea;
5)Tw o times concent ration of u rea;6)Wastew ater of monosodium glutamate;7)Con ten;8)Percentage
　　不同尿素浓度下绿球藻干物质及蛋白质含量的
测定结果表明(表 2),当培养基中的氮素浓度加倍
时 ,绿球藻细胞干物质的增加不显著 ,但粗蛋白质含
量增加达到极显著水平。将不同尿素水平下培养的
藻液离心后去掉藻体 ,测得它们上清液的含 N 量分
别为60. 5和89 . 4mg / L ,培养基中总N的去除率
表 2　不同尿素浓度下绿球藻干物质及蛋白质含量1)
Table 2　 The biomass and protein contents of Chlorococcus sp.
cul tured with different urea concentrations
项目 Item s 1倍尿素
1 t imes of urea
2倍尿素
2 tim es of u rea
培养基总氮 T otal nit rogen
of cultu re /(mg L - 1) 164. 7±2. 0 Aa 329. 4±2. 2 Bb
上清液总氮 Total ni trogen
of the upper liquid /(mg L - 1) 60. 5±1. 6 Aa 89. 4±1. 9 Bb
干重 Dry w eigh t of alagae /
(g L- 1) 1. 7495±0. 02 Aa 1. 853 5±0. 03 Aa
粗蛋白含量 Crude p rotein /% 30. 80±0. 73 Aa 36. 60±0. 79 Bb
　1)表中同行数字标有不同小写字母表示差异显著(P< 0. 05),不
同大写字母表示差异极显著(P<0. 01) The figu res in table m ark ed
w i th the di fferent low er case means thei r di ff erences are signi ficant
(P <0. 05),w hi le dif feren t capital s m eans thei r dif ferences are very
signifi cant(P <0. 01)
分别达到 63. 3%和 72. 9%。此结果表明 ,在氮源充
足的情况下 ,异养培养时绿球藻的生物量主要取决
于培养基中的糖浓度。当培养基含有过量的 N 素
时 ,绿球藻可以非蛋白氮吸收进入叶绿体中加以贮
藏 ,故上清液含氮量明显降低 ,该结果与本文“2. 5”
中的结果相一致。
3　讨　论
本研究从 1种高含氮量的棉浆黑液处理好氧活
性污泥中分离到 1株能够进行异养生长的单细胞的
绿球藻 ,根据藻细胞的形态初步鉴定为绿球藻属 。
对所分离的异养绿球藻的生长特性试验结果表明 ,
绿球藻异养培养的最佳碳源和氮源分别为葡萄糖和
尿素 。当葡萄糖浓度为 5 ～ 10 g /L ,尿素浓度为 0. 1
mol /L 时 ,藻细胞密度及藻细胞中的叶绿素含量均
达到最大 ,藻液呈深绿色 ,这与已报道的异养小球藻
的营养条件相似[ 12] , 但本文所报道的异养绿球藻
能够在 pH 8. 0的偏碱的环境中生长良好 ,比有关
研究所报道的异养小球藻的最适 pH 5. 5 ～ 6. 5
高[ 13] 。目前 ,国内有关异养型的单细胞真核藻类的
536 　　 华 中 农 业 大 学 学 报 第 26 卷　
研究报道主要集中在小球藻属 ,尚未见到有关绿球
藻属异养型藻种的分离和培养方面的报道。对于本
研究所分离到的异养型绿球藻如何定种有待进一步
研究 。
绿球藻正常生长的 N 浓度范围为 0. 015 ～
0. 150 g /L ,并可耐受高 N 环境[ 6] 。在高氮环境中 ,
绿球藻细胞可以大量吸收环境中的氮素 ,但主要不
是以蛋白氮的形式存在 ,而是以非蛋白氮如叶绿素
的形式存在。本研究所分离的绿球藻在异养条件下
生长迅速 ,同时可以吸收超过自身需要的氮素 。对
所分离的绿球藻的氨基酸分析结果表明 ,该藻种与
已报道的作为鱼类饵料的自养型微绿球藻在氨基酸
组成和含量方面很接近[ 14] ,具有较好的营养价值 。
因此 ,该藻种对高含氮量的污水 ,如味精废水的处理
可能具有一定的应用价值 。
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Heterotrophic Growth Characteristics and the Nutritional
Value of Chlorococcus sp.
M IAO Li-hong　WEN Jin-li　ZOU You-hong　WANG Chen
(Biological and Pharmaceut ical Engineering Department , Wuhan Polytechnic Univ ersity ,
Wuhan 430023 , China)
Abstract　The ef fect of carbon sources , nit rogen source s , and o ther cultural characteristics for the
heterot rophic Chlorococcus sp. isolated in this study w ere researched. T he amino acid contents and com-
posi tions of Chlorococcus sp. cultured w ith dif ferent nit rogen sources and concentrat ions were analysis.
The results indicated that the optimal carbon sources and nit rogen sources w ere gluco se and urea , the
optimal tempe rature is about 30 ℃ and pH is 7. 0 ～ 8. 0 g row ing under heterot rophic condit ion. The dou-
bling time is about 5 h when it is cul tured under the optimal condi tions. The crude pro tein contents go t
30. 8% and 36. 6%when alag ae cul tured in low nit rogen level and high nit rogen level. There we re no
dif ferences betw een dif ferent nit rogen sources effecting on acid contents and compositions.
Key words　Chlorococcus sp. ;heterct rophic g row th;amino acid
(责任编辑:边书京)
537　第 4 期 缪礼鸿等:1 株异养型绿球藻的生长特性及营养价值评价