全 文 ：正交实验法优选孔石莼(Ulvan Pertusa)多糖的提取工艺
于鹏展1 , 2 , 　张　虹1 , 　牛锡珍1 , 　徐祖洪1 , 　李智恩1＊
(1.中国科学院海洋研究所 ,山东 青岛 266071;2.中国科学院过程工程研究所 ,北京 100000)
收稿日期:2003-04-20
基金项目:由中国科学院前沿 、方向性创新项目与青岛市科委基金支持 ,编号分别为 KZCX3-SW-215.02-2-kj-hh-71。
作者简介:于鹏展(1978～ ),男 ,内蒙古赤峰市人 ,中国科学院海洋研究所硕士生 ,中国科学院过程工程研究所博士研究生.主要从事海藻
水溶多糖生理活性的研究。电话:86-532-2898703 , E-mail:xzh@ms.qdio.ac.cn;＊李智恩 ,通讯联系人。
关键词:绿藻;孔石莼;孔石莼多糖;薄层层析;正交实验
摘要:目的:优选并确立孔石莼多糖的最佳提取工艺;检测多糖中中性糖的组分。方法:以孔石莼多糖的溶出率及总糖含
量为指标 ,采用正交实验法对提取过程中水用量(A), 提取温度(B), 提取时间(C)及 pH 值(D)4因素进行优选研究 ,并以
优选出的提取方案做平行实验。薄层层析法检测多糖中主要中性糖成分。结果:影响多糖溶出率的显著因素是提取温
度与提取时间 ,而影响总糖含量的显著因素仅为提取温度。多糖中主要的中性糖包括鼠李糖 , 木糖和葡萄糖。 结论:以
多糖溶出率及总糖含量为考察指标的最优提取工艺为 A1B3C3D3 。
中图分类号:R284.2　　　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1001-1528(2004)01-0016-03
Optimum extraction of polysaccharides from Ulva pertusa established by orthogo-
nal test
YU Peng-zhan , 　ZHANG Hong , 　N IU Xi-zhen , 　XU Zu-hong , 　LI Zhi-en＊
(Inst itute of Oceanology , Chinese Academy of S ciences , Qingdao , Shangdong 226071 , Ch ina)
KEYWORDS:chlorophy rta , Ulvan pertusa , Ulvan TLC , orthogonal test
ABSTRACT:AIM:To optimize and establish the ext raction technology of w ater-soluble polysaccharides f rom
Ulva pertusa.TLC was employed to determine the mainly neutral sugars in the Ulvan.METHODS:The or-
thogonal test w as employed to test the ef fects of the four facto rs including volume of w ater , temperature of ex-
traction , time of ext ract ion and pH of water on the yield and to tal carbohydrate contents of w ater-soluble
polysaccharides f rom Ulva pertusa and optimize the ext raction technology.Five groups of parallel tests w ere
carried out by the opt imum parameters established and the sugar constituents of products were analyzed by T LC.
RESULTS:Temperature of ext ract ion and time of ex traction have significant ef fects on the ex t raction yield of
w ater-soluble polysaccharides f rom Ulva pertusa , but , for total carbohydrate content , only temperature of ex-
traction w as a significant factor.The mainly neutral sugars w ere composed of rhamnose , xy lose and glucose.
CONCLUSION:The opt imum ex traction technology was A1B3C3D3 when the yield and total carbohydrate con-
tent were considered as preferential parameters.
　　孔石莼(Ulva Pertusa)屈绿藻门(Chlorophy ta)
石莼科(Ulvaceae)石莼属(Ulva),是黄渤海区最常
见的一种大型绿藻 ,广为分布在辽宁 ,河北 ,山东 ,江
苏等沿海地区。它幼体呈绿色 ,成体颜色加深而为
碧绿色 ,生长于中潮带及低潮带和大干潮线附近的
岩石或石沼中[ 1] 。孔石莼含有丰富的可食用纤维 ,
作为一种重要的中草药 ,其“清热解毒 ,软坚散结 ,利
水减压”之功效 ,在《海藻本草》 , 《本草纲目》中皆有
记载 。这些海藻生长于高盐的海洋环境中 ,有着不
同于陆地植物纤维的生理学性质 ,对人体有独特的
生理效用 , 其煎剂可用来治疗中暑 , 高血脂等病
症[ 2～ 4] 。本文以孔石莼多糖的溶出率和总糖含量
为考察指标 ,采用 L 9(34)正交实验法对提取过程中
水用量 ,水 pH 值提取温度及提取时间 4因素进行
了优选研究 ,并采用薄层层析法检测多糖中中性糖
组分。
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Chinese T raditional Patent Medicine
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1　仪器和材料
仪器:722S 紫外可见分光光度计(上海精密科
学仪器有限公司):高压釜(山东新华医疗器械股份
有限公司);旋转蒸发仪(Buchi ,德国);硅胶 G254板
(青岛海洋化工厂)。
材料:鼠李糖 ,木糖(中国药品生物制品检定所
提供):苯酚(重蒸);三氟乙酸(Merck ,美国),其余
试剂皆为国产分析纯试剂。孔石莼于 2001年 9 月
采自青岛太平角 ,除去泥沙与杂藻 ,自来水冲洗干
净 ,风干 ,密封于塑料袋中于阴凉干燥处放置 。海藻
经中国科学院海洋研究所陆保仁研究员鉴定为 Ul-
va Pertusa.
2　实验方法
2.1　影响提取效果主要因素的选择
水用量 ,提取时间 ,提取温度及 pH 值作为考察
因素 ,每个因素拟订 3个水平(见表 1),选用 L9(34)
正交表 ,实验安排见表 2。
Table 1　 The orthogonal table of factors
levels tested
Level
A
Amount of
w ater
(f old)
B
Temperature
of ext raction
(℃)
C
Time of
ext ract ion
(h)
D
pH value
of water
1 30 105 2 5
2 40 115 3 7
3 50 125 4 9
Table 2　 Designment and results of
orthogonal experiment
Number A B C D
Yields
(%)
Content of
total
sugars(%)
1 1 1 1 1 7.44 42.40
2 1 2 2 2 16.14 47.22
3 1 3 3 3 21.89 51.47
4 2 1 2 3 10.77 43.42
5 2 2 3 1 24.73 47.19
6 2 3 1 2 20.87 48.39
7 3 1 3 2 16.59 45.85
8 3 2 1 3 15.50 47.64
9 3 3 2 1 23.32 49.27
K1j
45.47
(141.09)
34.80
(131.67)
43.81
(138.43)
55.49
(138.86)
K2j
56.37
(139.00)
56.37
(142.05)
50.23
(139.91)
53.60
(141.46)
K3j
55.41
(142.76)
66.08
(149.13)
63.21
(144.51)
48.16
(142.53)
r
10.90
(3.76)
13.28
(17.46)
19.40
(6.08)
7.33
(3.67)
2.2　多糖的提取
称取孔石莼干藻 150 g ,加适量水 ,按照正交实
验设计条件在高压釜内提取多糖 ,一定时间后 ,绢网
过滤 ,初滤液用硅藻土助滤 ,流动水透析48h , 70℃下
减压浓缩至原体积的 1/4左右 , 4倍 95%的乙醇沉
淀过夜 ,分离沉淀 ,沉淀用 95%乙醇脱水 2 次 ,于
80℃下红外灯烘干 ,置于 P2O5 干燥器中干燥保存 。
2.3　供试液的制备
精密称取多糖样品 0.500g ,加适量蒸馏水溶
解 ,并定容至100.0 mL ,用于测定总糖含量。
2.4　含量测定
2.4.1　总糖含量标准曲线
精密称取于 P2O5 干燥器中干燥保存的鼠李糖
标准品0.100g ,置于100.0mL量瓶中 ,加适量水溶解
并定容至刻度 , 配制成1.0mg·mL-1的标准溶液。
分别移取标准溶液 20 ,40 、80 , 120 , 160 , 200μl ,依次
加水使最终体积为1.0mL。以蒸馏水为空白 ,各试
管分别加入 5%的苯酚溶液 1.0mL , 迅速加入
5.0mL浓硫酸 ,充分振摇 ,使反应完全 ,室温下放置
30min后 ,随行空白 ,在485nm波长处测定吸光度 ,得
线性回归方程为:
y =0.0182 x +0.0686 , r =0.9991
2.4.2　供试液中总糖含量的测定
精密量取供试液 1.0mL ,按总糖含量标准曲线
项下操作 ,代入回归方程计算 ,结果见表 2。
2.5　薄层层析法测定多糖中主要中性单糖
精密称取多糖样品 0.020g 于安瓿瓶中 ,加入
2mol·L-1三氟乙酸10mL ,密封 ,于沸水浴中水解4h
后 ,蒸去三氟乙酸 ,样品再加少量水溶解 ,配制浓度
约为5mg·mL-1的糖溶液 ,在硅胶 G254板展开。用
毛细管在距薄层板下端1.5cm ,相距1.2cm处分次点
加标准品及样品溶液 ,吹风机吹干。将薄板置于展
开剂为正丁醇-乙酸乙酯-异丙醇-醋酸-水-吡啶(35∶
100∶60∶35∶30∶30 , v/v)的薄层层析缸中密闭式展
开 。溶剂距薄层上端约1cm时取出 ,室温下晾干 ,喷
以苯胺-邻苯二甲酸显色剂 ,于110℃下烘烤10min显
色 。
3　结果与讨论
3.1　正交实验
经方差分析 ,可以看出提取温度对提高孔石莼
多糖的溶出率及总糖含量有显著影响(P <0.05),
提取时间对多糖的溶出率和总糖含量有一定影响
(0.25

意义上对多糖溶出率及总糖含量无显著影响。但经
直观分析 ,多糖溶出率的最优工艺为 A2B3C3D1 ,总
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糖含量的最优工艺为 A3B3C3D3 。从节约能耗方面
考虑 ,我们应选取加水量为 A2 ,即 40 倍量的水提
取。当提取溶剂为酸性时 ,孔石莼的细胞壁受酸影
响 ,由多糖组成的胞间溶出物较碱性提取液多 ,应选
D1;当提取溶剂为碱性时 ,多糖中含有的木聚糖主
链间氢键被破坏 ,能促使多糖中木糖单糖组分增多
而升高其总糖含量 ,以此衡量 ,我们更宜选择 pH 为
D3 。
Table 3　 The square variance table of
polysdaccharides yields
Resource Sum of square f Square variance F P
A 0.24 2 0.12 2.67
B 1.71 2 0.86 19.00 ＊
C 0.65 2 0.33 7.22 (＊)
Error S E=SD=0.09 2 0.05
∑ 2.69 8
　　F1-0.01(2 , 2)=99 , F1-0.05(2 , 2)=19 , F1-0.10(2 , 2)=9 , F1-0.25
(2 , 3)=3。
Table 4　 The square variance table of
content of total sugars
Resource Sum of square f Square variance F P
B 0.51 2 0.26 25.5 ＊
C 0.07 2 0.04 3.5 (＊)
Error S E=SD+SD=0.04 4 0.02
∑ 0.62 8
　　F1-0.01(2 , 2)=99 , F1-0.05(2 , 2)=19 , F1-0.10(2 , 2)=9 , F1-0.25
(2 , 3)=3。
3.2　平行实验及多糖成分分析
以正交实验优选出的提取方案 A2B3C3D3 做 5
次平行实验 ,多糖溶出率为(21.90±0.6)%,产品的
总糖含量为(51.45±0.2)%。
水溶性多糖经酸溶液水解 ,其薄层层析的结果
见Fig 1。孔石莼水溶多糖主要含有鼠李糖(rham-
nose),木糖(xylose)和葡萄糖(glucose)。
图 1　孔石莼水溶多解组分的 TLC图谱
1:葡萄糖　2:鼠李糖　3:样品　4:木糖
4　讨论
人们已对海洋中三大巨藻中红藻及褐藻多糖的
提取 ,分离和分析做了大量的研究工作。其中 ,红藻
以琼胶(Agar)和卡拉胶(Carrageenan)为代表 ,褐藻
以褐藻胶(Algin)和褐藻多糖硫酸酯(Fucoidan)为代
表 ,但对绿藻多糖的研究还很少。孔石莼多糖为藻
体细胞间物质 ,我们选择其有效成分总糖含量为指
标 ,具有一定的代表性 。方差分析表明 ,提取温度为
关键因素 ,提取时间次之 ,而溶剂的 pH 及溶剂用量
对提高多糖的溶出率及总糖含量在统计学意义上无
显著差异。本文为孔石莼多糖提取条件的选择提供
了一个有益的参考 。
薄层层析法表明孔石莼水溶性多糖的中性糖组
分主要有鼠李糖 ,木糖和葡萄糖。薄层层析法还能
利用荧光 G254硅胶板检测出另一种主要组分—葡萄
糖醛酸 ,即水解处理的样品在相同条件下层析 ,取
出 ,室温下晾干 ,置于紫外灯下在365nm波长下 ,可
观察到葡萄糖醛酸的荧光吸收。
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