全 文 ：海洋管藻目绿藻刺松藻光系统 Ⅰ复合物的分离
陈　敏＊ 　李爱芬 周百成
(烟台大学生物化学系 , 烟台 264005) (中国科学院海洋研究所 , 青岛 266071)
摘要　采用 T riton X-100 蔗糖密度梯度离心法 , 从管藻目绿藻刺松藻中分离到三种不同形式的光系统Ⅰ (PS Ⅰ)
复合物.区带Ⅲ富含 PSⅠ核心复合物 (CCⅠ), 叶绿素 (Chl) a/ b>20 , 在温和的聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)
中只显示一条 PSⅠ中心复合物 CPⅠ条带.区带Ⅳ和 Ⅴ在436 和674 nm 、 467 和 650 nm 以及 540 nm 的吸收表
明 , 含有 Chl a、 b 及管藻黄素和管藻素 , Chl a/ b比值分别为 3.23 和 2.4.经 PAGE 检测 , 有 CP Ⅰ和 CP Ⅰ a两
种 PSⅠ色素蛋白复合物带 , 因此区带Ⅳ和Ⅴ是由 CCⅠ和含量不等的捕光复合物 LHCⅠ构成的 PSⅠ 颗粒.区带
Ⅲ只有66 和56 ku 两种核心多肽;区带Ⅳ和Ⅴ除了66 、 56 ku多肽以外 , 还有 4 种分子质量为 25 , 26 , 26.2 和
27.5 ku 的 LHCⅠ多肽.室温荧光光谱显示 , 分离物中的各种光合色素之间保持着良好的能量传递关系 , 由 Chl
b 及管藻黄素和管藻素吸收的能量都可以传递给 Chl a.
关键词　光系统Ⅰ复合物 , 蔗糖密度梯度离心 , 多肽 , 刺松藻
学科分类号　Q946
　　管藻目藻类是绿藻中较为原始的一类 , 因兼有
绿色植物和杂色植物的特点 , 在系统进化中占有特
殊的地位.Anderson[ 1]和曾呈奎等[ 2]曾报道 , 某些
管藻目绿藻的叶绿体或类囊体膜没有高等植物作为
光系统Ⅰ (PS Ⅰ)标志的 730 nm 长波荧光 , 说明
其 PSⅠ的结构及能量传递方式可能具有特异性.
因此 , 对管藻目绿藻 PS Ⅰ的分离和研究对于探讨
光合系统结构多样性以及光合生物的进化将具有重
要意义.目前 , 大多数报道都采用温和的十二烷基
硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE), 可分
离到 2 ～ 6种解离程度不同的 PS Ⅰ复合物 , 但是除
了 Itagaki[ 3] 和 Benson[ 4]之外未涉及多肽组成的研
究.由于 SDS 的作用剧烈 , 而电泳分离过程本身
对色素蛋白复合物也会产生一定的影响 , 因此
Anderson[ 5] 采用了较为温和的非离子型去污剂
T riton X-100增溶 , 并结合蔗糖密度梯度离心法从
一种未定名的松藻 (Codium sp.)中分离到一种
PS Ⅰ复合物.分离物的光谱特性及多肽构成与
PAGE法得到的结果有所差异[ 3 , 6] .因此管藻目绿
藻 PS Ⅰ的结构还有待于进一步的比较和确定.本
文以管藻目绿藻刺松藻 (Codium fragi le)为材
料 , 改变分离方法 , 得到了包括核心复合物在内的
三种不同形式的 PS Ⅰ颗粒 , 并对其多肽及光谱特
性等进行了研究.
1　材料与方法
1.1　叶绿体及类囊体膜的制备
刺松藻 (Codium fragile)于每年 9 ～ 11 月采
自青岛汇泉湾.参照 Anderson[ 1]的方法制备叶绿
体和类囊体膜.
1.2　类囊体膜的增溶及初步离心分离
类囊体膜的处理参照 Anderson[ 5] 方法稍加改
变.将类囊体膜用含有 50 mmol/L 山梨醇的
7.5 mmol/L EDTA 溶液 (pH 8.0)洗涤两次 ,
12 000×g 离心收集.将沉淀重新悬浮于重蒸水
中 , 用 Tricine-三乙醇胺调 pH至 7.8 , 控制叶绿素
浓度为 0.8 g/ L.然后加入 20% Triton X-100至终
浓度为 0.7%, 于 4℃震荡增溶 30 min.增溶后的
类囊体膜于30 000×g 离心 10 min , 上清液用于蔗
糖密度梯度离心.
1.3　复合物的蔗糖密度梯度离心分离
在5 ml离心管中由下至上铺设不连续蔗糖梯
度 , 依次为 1.5 mol/ L (0.5 ml)、 0.8 mol/L
(0.5 ml)、 0.6 mol/L (1 ml)、 0.5 mol/ L (1 ml)、
0.4 mol/L (1 ml)和 0.3 mol/L (0.5 ml), 各含
　＊通讯联系人.
　Tel:0535-6223671 , E-mail:chenmclm@public.ytpt t.sd.cn
　收稿日期:2001-01-17 , 接受日期:2001-04-27
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0.02%的 Triton X-100.将初步离心得到的上清液
加入管顶 , 上样量0.5 ml/管.采用Hitachi-55P-72
SW-41型水平转头 , 于 4℃、 220 000×g 离心 12
～ 14 h.
1.4　类囊体膜复合物及离心分离物的分离检测
类囊体膜的增溶与梯度离心法相同 , 增溶液于
8 000×g 离心 10 min , 取上清液上样.梯度离心
得到的各区带不需增溶 , 直接上样.复合物的分离
参照李桐柱等[ 7] 的方法稍加改进.分离胶浓度为
10%.电泳后的结果立即照相.
1.5　叶绿素浓度及 Chl a/b 比值的测定
取梯度离心得到的含有色素的区带各 0.1 ml ,
依 Arnon[ 8]的方法测定叶绿素 (Chl)的浓度和 Chl
a/b比值.
1.6　常温吸收光谱及荧光光谱测定
将梯度离 心得 到的区 带迅 速用预 冷的
50 mmol/L的 Tricine-NaOH (pH 8.0)缓冲液稀
释 , 在岛津 UV-3000紫外-可见分光光度计上测定
吸收光谱.
采用日立-851 型荧光分光光度计测定室温荧
光光谱.
1.7　多肽组成分析
将梯度离心得到的各区带在 4℃对固体蔗糖透
析 , 浓缩至叶绿素浓度为 0.2 ～ 0.6 mol/L.将待
测样品与样品处理液 (含 4% SDS 、 10%巯基乙
醇 、 20%甘油 、 0.005%溴酚蓝及 0.1 mol/L Tris-
HCl缓冲液 , pH 6.8)等体积混和 , 在室温下放置
2 h以上 , 参照 Laemmli[ 9] 的方法进行多肽分析.
堆积胶和分离胶中各含有 1 mol/ L 和 4 mol/L 的
脲.染色液中乙醇∶乙酸∶H2O =50∶7∶43 , 含有
0.25%的考马斯亮蓝 R250 , 脱色液中乙醇∶乙酸∶
H2O=25∶7∶68.
2　结　　果
2.1　色素蛋白复合物的蔗糖梯度离心分离及鉴定
经 T riton X-100增溶后的类囊体膜 , 在 30 000
×g 初步离心 , 上清液经过蔗糖梯度离心后得到了
5个区带 , 自上而下依次称为区带 Ⅰ 、 Ⅱ 、 Ⅲ、
Ⅳ、 Ⅴ (图 1).绿色的区带Ⅰ位于顶部0.3 mol/L
梯度内 , 主要是游离色素 (FP).深褐绿色的区带
Ⅱ处于0.4 mol/ L蔗糖梯度区的中部 , PAGE检测
结果显示该条带富含 PS Ⅱ捕光复合物 LHCP 1 及
LHCP3+3′, 此外还杂有少量的 PS Ⅱ和 PS Ⅰ中心复
合物 CPa 和 CP Ⅰ.区带 Ⅲ则呈鲜绿色 , 处于 0.5
～ 0.6 mol/L 蔗糖梯度交界处 , PAGE 结果只有
CPⅠ一条带 , 因此是 PS Ⅰ核心组分.区带Ⅳ和区
带Ⅴ都呈浅黄褐色 , 分别在 0.6 mol/L 梯度底部和
0.8 ～ 1.5 mol/L 梯度界面处 , PAGE 结果除了
CPⅠ条带以外 , 还有含量不同的 CP Ⅰ a 条带 , 因
此两者是解离程度不同的 PS Ⅰ颗粒.此外 , 在离
心管底部的少量沉淀为未去除的类囊体膜碎片.
Fig.1　Mild PAGE prof iles of zones isolated
by sucrose gradient centrifugation
2.2　PSⅠ复合物室温吸收光谱及荧光光谱
区带 Ⅲ (CC Ⅰ)基本只有叶绿素 a (Chl a)的
吸收峰 , 在 436和 673 nm (图 2), Chl a/b比值大
于 20.而区带Ⅳ和区带Ⅴ的蓝区明显增加了 Chl b
的吸收 , 在467 ～ 469 nm , 红区的650 nm肩峰也
Fig.2　Absorption spectra of PSⅠ complexes of C.f ragile
———:Ⅲ;— — —:Ⅳ;-·-·-:Ⅴ.
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很明显.Chl a/b比值分别为 3.23和 2.4.区带Ⅴ
的 Chl b峰高于区带Ⅳ, 说明结合着更多的 PS Ⅰ捕
光复合物 (LHC Ⅰ).两区带在 540 nm 处的肩峰 ,
对应于管藻黄素和管藻素的吸收.
　　CC Ⅰ和两种 PS Ⅰ颗粒在室温下分别发射 685
和 683 nm的荧光 (图 3), 在此发射波长下测定的
激发光谱中 , Chl a 、 Chl b及管藻黄素和管藻素的
激发峰分别在 440 、 472 ～ 475 nm 和 538 ～ 540 nm
(图 3).表明分离出的 PS Ⅰ复合物中 , 各种色素
对该荧光都有贡献.
Fig.3　Fluorescence spectra of PSⅠ complexes of C.fragile at
room temperature
Left:excitation spectra(The emission wavelength was at 683 nm);Right:
emission spectra(The excitation w avelength was at 436 nm).———:Ⅲ;
— — — —:Ⅳ;-·-·-:Ⅴ.
2.3　多肽组成分析
SDS-PAGE 的结果显示 , 区带 Ⅲ中只有 66 、
56 ku两种多肽 (图 4).而区带Ⅳ和区带Ⅴ含有
66 、 56及4种小分子质量LHCⅠ多肽 ,分别为25 ,
26 , 26.2和 27.5 ku.区带 Ⅴ中的 LHC Ⅰ 多肽的
Fig.4　Peptides analysis of PSⅠ complexes of C.f ragile
含量明显高于区带Ⅳ.这一结果与 PAGE 分离的
大羽藻PS Ⅰ复合物CPIa1 ～ 6的多肽组成相似[ 3] .但
没有检测到松藻 LHC Ⅰ的 19 ku多肽[ 10] .
3　讨　　论
管藻目绿藻的 PS Ⅰ由核心复合物 CC Ⅰ和捕光
复合物 LHC Ⅰ构成[ 10] , 由于 LHC Ⅰ的解离程度不
同而呈现出不同的颗粒形式.本文采用 Triton X-
100蔗糖密度梯度离心法分离出三种形式的 PS Ⅰ
复合物 , 经 PAGE 检测 , 没有 PS Ⅱ组分.其中区
带Ⅲ不含 Chl b , 由表观分子质量为 66和 56 ku的
两种多肽构成 , 是 PS Ⅰ的核心复合物 CC Ⅰ.其色
素及多肽组成与高等植物相似 , 都是 P700-Chl a-
蛋白复合物.
区带Ⅳ和Ⅴ为 PS Ⅰ复合物 , 至少含有 6 种多
肽成分 , 除了两种核心多肽以外 , 还有 4种LHC Ⅰ
多肽.吸收光谱和荧光激发光谱表明 , 它们具有与
高等植物完全不同的色素组成 , 除了 Chl a以外 ,
还有更多的Chl b以及特殊的类胡萝卜素 ———管藻
黄素及管藻素 , 为管藻黄素-Chl a/b 蛋白复合物.
分离物中各种色素之间保持着良好的能量传递关
系 , 其中 Chl b和管藻黄素及管藻素吸收的光能都
可传递给 Chl a.
参　考　文　献
1 　Anderson J M.Chlorophyll protein complexes of a Cod ium species
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5 　Anderson J M.Chlorophyll-protein complexes of a marine green
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文] .青岛:中国科学院海洋研究所 , 1998
Chen M.St ructu ral characterizat ion of PS I and PS II in siphonous
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The Chinese Academy of Sciences , 1998
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Li T Z , Lin S Q.Acta Bot Sin , 1995 , 37 (1):34～ 40
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siphonaxanthin-chlorophyll a/ b-protein com plex of photosystem I
f rom a Codium species (Siphonales).Biochim Biophys Acta ,
1985 , 806 (1):154～ 160
Isolation of PSⅠ from a Siphonous Marine Green Alga , Codium fragile
CHEN Min＊ , LI Ai-Fen
(Depar tmen t of Biochem istry , Y antai Un iversity , Y antai , 264005 , China)
ZHOU Bai-Cheng
(Inst itute of Oceanology , The Chinese Academy of S ciences , Qingdao , 266071 , China)
Abstract　Three dif ferent fo rms of PS Ⅰ complexes w ere isolated f rom a siphonous marine g reen alga , Codium
fragile , by Triton X-100 sucrose gradient cent rifugation.Zone Ⅲ had a Chl a/b>20 , and designated as PS Ⅰ
core complex CC Ⅰ because it created only CPⅠ band in mild PAGE.Zone Ⅳ and Ⅴ had absorption at 436 and
674 nm , 467 and 650 nm , and 540 nm , suggesting the presence of Chl a , Chl b , siphonaxanthin and siphonein ,
Chl a/b w ere 3.23 and 2.4 , respectively.Both CP Ⅰ and CPⅠ a bands w ere observed when they were subjected
to mild PAGE.Therefore , Zone Ⅳ and Ⅴ were dif ferent forms of PS Ⅰ complexes that consisted of CC Ⅰ and
different amount of lig ht-harvesting complex LHC Ⅰ .Zone Ⅲ contained only 66 and 56 ku peptides in SDS-
PAGE , while Zone Ⅳ and Ⅴ had 4 different LHC Ⅰ peptides of 25 , 26 , 26.2 and 27.5 ku in addit ion to 66 ,
56 ku peptides.Fluorescence emission spectra show ed that eff icient energy t ransfer were kept among pigments in
isolated PS Ⅰ complexes.Exci tation energy absorbed by Chl b , siphonaxanthin and siphonein can be transferred
to Chl a.
Key words　PS Ⅰ , CC Ⅰ , sucrose g radient cent rifugation , peptide , Codium fragi le
　＊Corresponding author.Tel:86-535-6223671 , E-mail:chenmclm@public.y tpt t.sd.cn
　Received:January 17 , 2001　　Accepted:April 27 , 2001
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