全 文 ：收稿　2001-03-05　　　　修定　2001-07-09
　＊　山东省自然科学基金资助课题。
＊＊　Email:chenmclm@163.net;Tel:0535-6223671。
管藻目绿藻刺松藻 LHCII复合物的分离＊
陈　敏＊＊　李爱芬　宫宝安(烟台大学生物化学系 ,山东烟台 264005)
周百成(中国科学院海洋研究所 ,山东青岛 266071)
Isolation and Characterization of LHCII from a Siphonous Marine Green Alga ,
Codium fragile
CHEN Min , L I Ai-Fen , GONG Bao-An(Department of Biochemistry , Yantai University , Yantai , Shandong 264005)
ZHOU Bai-Cheng(Institute of Oceanology , The Chinese Academy of Sciences , Qingdao , Shandong 266071)
提要　采用 T riton X-100 增溶刺松藻类囊体膜 ,经初离心 、蔗糖密度梯度离心和 Mg2+聚集作用后再离心 , 纯化到一种只含有
分子质量为 28 000 u 脱辅基蛋白的 LHCII 复合物。证实此种多肽为同时结合有 Chl a、Chl b和管藻黄素及管藻素的色素蛋白
复合物 , Chl a/ b=0.91。吸收和荧光光谱显示分离物中各种色素之间保持着良好的能量传递关系 ,其中管藻黄素及管藻素吸
收的光能可直接传递给 Chl a , 而无需 Chl b 作为中介。
关键词　LHCI I　多肽　Triton X-100 蔗糖密度梯度离心　刺松藻
　　高等植物和多数绿藻的捕光复合物都是叶黄素
-Chl a/b-蛋白复合物 ,唯有管藻目绿藻例外 ,是特
异的管藻黄素-Chl a/b-蛋白复合物[ 1 , 2] 。尽管多
年来人们对这类复合物的结构做了不少研究 ,但了
解程度有限 ,远不及高等植物 。目前多数报道采用
SDS-PAGE 法[ 3 ～ 5] ,通常可得到 3 ～ 4个 LHCII 条
带 ,但各条带之间的关系以及多肽构成却不清楚 。
只有 Anderson[ 6]和 Nakayama等[ 7]尝试采用较为温
和的 T riton X-100和毛地黄皂苷增溶 ,并结合蔗糖
密度梯度离心法及柱层析法分离完整的 LHC II 复
合物 。但是前者报道分离的松藻(Codium sp.)
LHCII 由 27 000 ～ 35 000 u 的 5种多肽构成;而
Nakayama分离的大羽藻(Bryopsis maxima)LHCII
只含有 28 000和 32 000 u两种多肽。因此 ,确定这
些多肽哪些结合色素 ,将有助于管藻目绿藻 LHCII
结构的阐明 。本文以管藻目绿藻刺松藻为材料 ,改
变分离条件 ,得到了一种只含有 28 000 u 多肽的
LHCII ,从而证实该多肽是含有色素的LHCII组分 ,
并对其光谱及能量传递特性等做了研究 。
材料与方法
1　叶绿体及类囊体膜的制备
　　刺松藻(Codium fragile)于每年 9 ～ 11月采自
烟台海湾。参照 Anderson[ 6] 的方法制备叶绿体和
类囊体膜。
2　类囊体膜的增溶及初步离心分离
　　-70℃保存的类囊体膜化冻后 , 用含有 50
mmol · L-1山梨醇的 7.5 mmol·L-1 EDTA 溶液
(pH 8.0)洗涤 2 次 , 12 000×g 离心收集。将沉淀
重新悬浮于重蒸水中 ,用三乙醇胺调 pH 至 7.8 ,控
制叶绿素浓度为 0.8 ～ 0.9 mg·ml-1 。然后加入
20%Triton X-100至终浓度为 0.7%,于 4℃下震荡
增溶30 min。增溶后的类囊体膜于30 000×g 离心
10 min ,上清液用于蔗糖密度梯度离心 。
3　复合物的蔗糖密度梯度离心分离
　　采用不连续蔗糖梯度进行离心分离 。在 5 ml
离心管中由下至上依次为 1.5 mol·L-1(0.5 ml)、0.
8 mol·L-1(0.5 ml)、0.6 mol·L-1(1 m l)、0.5 mol·
L -1(1 ml)、0.4 mol·L-1(1 ml)和0.3 mol·L-1(0.5
ml),各含 0.02%的 Tri ton X-100。将初步离心得到
的上清液加入管顶 , 上样量 0.5 ml/管。采用 Hi-
tachi-55P-72 SW-41 型水平转头 ,于 4℃、220 000×
g 离心 12 ～ 14 h。
4　LHCII的纯化
　　收集梯度离心分离出的褐绿色区带(区带 II),
加入 1 mol·L-1的 MgCl2 至终浓度约为 10 mmol·
12 植物生理学通讯　第 38 卷 第 1 期 , 2002 年 2 月
DOI :10.13592/j.cnki.ppj.2002.01.003
L-1 。于室温下搅拌 20 min ,加至铺有 0.4 mol·L-1
蔗糖的离心管中 ,用 Hitachi-52D 冰冻离心机于 4℃
下 ,以 30 000×g 离心 1 h。收集 0.4 mol·L-1蔗糖
垫中的黄褐色区带 ,为纯化的LHCII 。
5　类囊体膜复合物及离心分离物的 PAGE分离
　　用于电泳的类囊体膜的增溶与梯度离心法相
同。增溶液以 8 000×g 离心 10 min ,取上清液上
样。梯度离心所得各区带及纯化的 LHCII 复合物
不经增溶直接上样 。复合物 PAGE 分离参照李桐
柱等[ 8]的方法 。电泳后的结果立即拍照。
6　叶绿素浓度及 Chl a/b 比值的测定
　　取梯度离心得到的各区带及纯化的 LHC II 复
合物各 0.1 ml ,依 Arnon[ 9]的方法测定叶绿素浓度
和Chl a/b比值 。
7　常温吸收光谱测定及荧光光谱测定
　　将梯度离心得到的区带迅速用预冷的 50 mmol
·L-1的 Tricine-NaOH(pH 8.0)缓冲液稀释 ,用岛津
UV-3000紫外-可见分光光度计测定吸收光谱 。采
用日立-851型荧光分光光度计测定室温荧光光谱 。
8　多肽组成分析
　　将梯度离心得到的各区带及纯化的 LHC II 复
合物分别装入透析袋 ,袋外加固体蔗糖在 4℃下对
固体蔗糖透析 ,浓缩至叶绿素浓度为 0.2 ～ 0.5 mg
·ml-1 。将待测样品 20 μl与样品处理液(含 4%
SDS 、10%巯基乙醇 、20%甘油 、0.005%溴酚蓝及 0.
1 mol·L-1 Tris-HCl缓冲液 , pH 6.8)等体积混和 ,
在室温下放置 2 h 以上 ,参照 Laemmli[ 10]的方法进
行多肽分析 。堆积胶和分离胶中各含有 1 mol·L-1
和 4 mol·L-1的脲 。染色液为乙醇∶乙酸∶H2O = 50
∶7∶43 ,含有 0.25%的考马斯亮蓝 R250 ,脱色液中乙
醇∶乙酸∶H2O =25∶7∶68。
实验结果
1　色素蛋白复合物的蔗糖梯度离心分离及鉴定
　　增溶后的类囊体膜在 30 000×g 离心后进行
PAGE检测 。发现 LHCP1 在上清液中的比例明显
增加(图 2 ,左),而沉淀中则以 PSI 组分为主。若依
照以往的方法长时间高速离心 ,虽可去除大部分的
类囊体膜残余 ,但 LHCP1 损失较多(资料略),且操
作时间长 ,游离色素增加 ,因此实验采用 10 min 时
间 。
改为不连续蔗糖梯度后 ,可以有目的地调整区
带的位置 ,同时去除残余的类囊体膜 。经过摸索后 ,
分离到 5个区带 ,自上而下依次称为区带 Ⅰ 、Ⅱ 、Ⅲ、
Ⅳ、Ⅴ(图 1)。绿色的区带 I位于顶部 0.3 mol·L-1
度内 ,PAGE检测结果表明 ,该条带主要是游离色素
FP(图 2 ,右)。区带 Ⅱ为很深的褐绿色 ,占叶绿素总
量的 63%,处于 0.4 mol·L-1蔗糖梯度区的中部 ,在
PAGE中的条带主要形成LHCP1 ,及微量的 CPa、
LHCP3+3′和 CPI 条带 ,表明该区带富含 PSII 捕光
复合物 , 但仍然混合有少量分子质量与其相近的
PSI组分 。区带 III 则呈鲜绿色 ,处于 0.5 ～ 0.6
mol·L-1蔗糖梯度交界处 , PAGE 结果只有 CPI 一
条带 ,推测主要为 PSI 核心 。区带 IV 和区带 V 都
呈黄褐色 ,分别在 0.6 mol·L-1梯度底部和 0.8 ～
1.5 mol·L-1梯度界面处 ,PAGE结果除了 CPI 条带
以外 ,还有含量不等的 CPIa 条带 ,因此判定两者是
解离程度不同的 PSI 颗粒 。而在离心管底部的少量
沉淀 ,为未去除的类囊体膜碎片 。
图 1　刺松藻类囊体膜蔗糖密度梯度
离心区带分布图谱
2　LHCII的纯化
　　收集褐绿色富含 LHCP 1的区带 I I ,加入 Mg2+
使 LHC II聚集[ 2] ,离心后 ,部分黄褐色组分进入0.4
mol·L-1蔗糖垫中甚至形成沉淀 。取黄褐色组分及
沉淀进行温和的 PAGE ,都只形成迁移率与 LHCP1
相近的一条褐色条带(图 2),说明两者都是纯化的
LHCI I复合物。
13植物生理学通讯　第 38 卷 第 1 期 , 2002 年 2 月
图 2　刺松藻类囊体膜初步离心(左)及蔗糖密度梯度离心(右)各区带的 PAGE 图谱
3　LHCII的吸收光谱
　　将蔗糖梯度离心后的区带及纯化的 LHC II 复
合物用预冷的 50 mmol·L-1的 Tricine-NaOH(pH
8.0)缓冲液稀释后测定吸收光谱 。LHCII 复合物
的Chl a和 Chl b的吸收峰分别位于 436和 672 nm 、
473和 653 nm(图 3)。Chl b 的吸收峰明显高于区
带 II ,Chl a/b 比值也由 1.25降低为 0.91。与高等
植物和多数绿藻不同的是 ,刺松藻 LHCII在 540 nm
附近有一个非常明显的吸收肩峰 ,这是管藻黄素和
管藻素的特征峰 。
图 3　刺松藻 LHCI I吸收光谱
4　室温荧光光谱
　　无论采用 Chl a(436 nm)、Chl b(480 nm)或管
藻黄素和管藻素(540 nm)的吸收波长进行激发 ,
图 4　LHCII 荧光发射光谱
上:立即测定;下:4℃放置 4 h或过夜后测定。
14 植物生理学通讯　第 38 卷 第 1 期 , 2002 年 2 月
纯化的 LHCII复合物在室温(15℃)下都发射682 ～
683 nm 的荧光(图 4)。480 nm 激发波长下的发射
峰比 436 nm时略高一些 ,而 540 nm 激发时的荧光
峰较低 。由于 683 nm 荧光是由 LHCII 中的 Chl a
发射的 ,因此说明 ,分离出的 LHCII 复合物保持了
良好的能量传递特性 ,由 Chl b或管藻黄素吸收的
激发能都可传递给 Chl a 。
值得注意的是 , LHCII 复合物在 4℃下放置一
段时间后测定荧光光谱 ,由于部分色基与蛋白的结
合状态的改变 ,主发射峰移至 678 ～ 680 nm 。以
480 nm 光激发时 ,在 650 nm 附近还可观察到一个
逐渐增高的小发射峰 ,此峰发自 LHCI I 中的 Chl
b
[ 10] ,说明有少量 Chl b与 Chl a 之间的能量传递中
断。但以 540 nm 和 436 nm 光激发时却没有 650
nm峰 。说明 LHCII 复合物中 ,管藻黄素和管藻素
吸收的光能可能直接传递给了 Chl a ,而不经过 Chl
b的中介 。
5　多肽组成分析
　　蔗糖密度梯度离心得到的区带 II 经 SDS-
PAGE后 ,主要呈现 7条蛋白带 , 分子质量分别为
66 000 、55 000 、46 800 、35 000 、32 400 、28 000 和
26 500 u(图 5)。其中 28 000 u蛋白带含量最高 ,
图 5　蔗糖密度梯度离心各区带多肽分析图谱
分布较宽 。其次是66 000 、55 000和35 000 u多肽 ,
但没有观察到刺松藻 LHCP 1(陈敏 ,中国科学院海
洋研究所博士论文 , 1998)和松藻 LHCII 中的
29 000 u多肽[ 2] 。与区带 II 相邻的区带 I II(富含
CPI)只有 66 000 、55 000 u两条带 ,是 PSI 的核心多
肽 。而分子质量最大的区带 V 除了 66 000 、55 000
u两条带外 ,还有 4条 25 000 ～ 28 500 u多肽 ,属于
PSI 的捕光复合物LHCI(资料略)。
　　在纯化的 LHCII 中只检测到一条 28 000 u蛋
白带 ,说明在我们的实验条件下 ,加入 Mg2+之后 ,
参与聚集作用并形成了较大的颗粒的主要是分子质
量在 28 000 u附近的多肽。
讨　　论
　　高等植物 LHCII 在温和的 PAGE 中极易解离
为单体形式 ,而管藻目绿藻 PSII 捕光复合物的小分
子质量形式(包括 LHCP2 、LHCP3 ,和 LHCP3′),不
仅含量少而且都不稳定[ 4 , 5] 。大部分的捕光复合物
存在于一条迁移率与 PSI 中心复合物 CPI 十分接
近的 LHCP1条带中 。因此 ,在离心分离时因分子质
量接近而难于将 PSI 组分完全去除。加入 Mg2+之
后 ,属于 LHCI I的组分聚集形成较大的颗粒 ,而 PSI
组分不参与聚集作用[ 6] ,从而将两者分开 。同时 ,
由于在底部蔗糖垫中没有 Triton X-100 ,因此得到
的 LHC II颗粒排除了残余去污剂的影响 ,接近天然
状态。
与高等植物相比 , 刺松藻的 PSII 核心部分
(CPa)在温和的 PAGE 中的含量较少 ,并且不稳定。
Anderson[ 6]采用连续蔗糖梯度分离松藻类囊体膜
时 ,得到了 3个条带 ,分别为 LHCII 、PSII-LHCII 和
PSI 。在本文的梯度离心条件下 , PSII 未形成独立
的条带 ,而是混和在区带 II 中 。加入 Mg2+之后未
进入蔗糖垫的溶液经 PAGE 检测 ,含有 CPa 组分
(图 2)。
Nakayama[ 4]分离的大羽藻的两种 LHCII 形式
P4和 P5 ,在脲浓度为 2 ～ 5 mol·L-1时呈现 32 000
和 28 000 u 两条蛋白带 ,而松藻的 LHCII 在 SDS-
PAGE中共有66 000 、63 000 和 35 500 ～ 27 000 u
的 7条蛋白带[ 6] 。他们认为 35 500 ～ 27 000 u的 5
种多肽属于 LHCII ,而 66 000和 63 000 u条带是由
上述小分子质量的蛋白聚集而成 。从我们分离的区
15植物生理学通讯　第 38 卷 第 1 期 , 2002 年 2 月
带 II和区带 III的比较结果来看 ,区带 II中也有 66
000 、55 000 u两条带。此外还有 46 800 u 多肽 ,它
在区带 III和 LHCII中都没有 ,可能是 PS II的内周
天线蛋白。由于在大羽藻 LHCII 和刺松藻 LHCP1
中都报道含有 32 000 u多肽 ,它们与 PSII核心多肽
的迁移位置有所不同 ,因此区带 II中的 32 400 u多
肽可能也属于 PSII 捕光复合物。从纯化的 LHCII
中只检测到一种 28 000 u多肽 ,该条带是区带 II 中
含量最高的 ,由于它受镁离子浓度的调节 ,因此可能
是 LHCII的最主要的构成成分。而其它的 35 000
和26 500 u多肽可能是刺松藻中的少量捕光复合物
组分 。至于它们是否结合色素还需要进一步地加以
证实 。
分离出的刺松藻 LHCII只含有 28 000 u多肽 ,
其吸收光谱和荧光光谱充分说明该多肽同时结合着
Chl a、大量的 Chl b以及管藻黄素和管藻素 ,是管藻
目绿藻特有的管藻黄素 -Chl a/b-蛋白复合物 。
各种色素之间保持着良好的能量传递关系。并且由
管藻黄素及管藻素吸收的光能可直接传递给 Chl a ,
无需 Chl b作为中介。
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