全 文 ：植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 841
褐藻裙带菜中PSII复合物及其亚复合物的分离和特性研究
陈敏1,* 邢克克2 李爱芬2 周百成3
1 山东烟台大学生物化学系，山东烟台 264005；2 暨南大学水生生物研究中心，广州 510632；3 中国科学院海洋研究
所，山东青岛 266071
提要 用不连续梯度蔗糖密度超离心，从经 Triton X-100 增溶的褐藻裙带菜类囊体膜中分离到 3 种色素蛋白复合物条带，
分别是捕光复合物、具有光氧化活性的 PSII 复合物颗粒(区带 II)以及 PSI (区带 III)。PSII 颗粒经毛地黄皂苷增溶后，再次
超离心分离得到 3 条 PSII 的亚复合物条带。吸收和荧光激发谱显示其中的区带 II-1 为墨角藻黄素 -Chl a/c- 蛋白复合物, 区
带 II-2 为 Chl a/c- 蛋白复合物，两者都只含 20 kDa 多肽；而鲜绿色的区带 II-3 为不含捕光复合物的活性 PSII 核心。
关键词 裙带菜；蔗糖密度梯度离心；PSII；PSII 核心；捕光复合物；多肽
Study on Isolation and Characterization of PSII Pigment-protein Complex and
Subcomplexes from a Brown Alga [Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar]
CHEN Min1,*, XING Ke-Ke2, LI Ai-Fen2, ZHOU Bai-Cheng3
1Department of Biochemistry, Yantai University, Yantai, Shandong 264005, China; 2Research Center of Hydrobiology, Jinan
University, Guangzhou 510632, China; 3Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao, Shandong 266071,
China
Abstract Three pigment-protein complexes which were light-harvesting complex and active PSII (zone II)
and PSI (zone III) particles were isolated from a brown alga Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar by Triton
X-100 sucrose gradient centrifugation. The three subcomplexes were separated by further density gradient
after digitonin solubilization of PSII particle. Zone II-1 was a fucoxanthin-Chl a/c-protein complex, and zone II-
2 was a Chl a/c-protein complex according to their absorption and fluorescence spectra. They all presented a
major peptide component at 20 kDa. The fresh green fraction zone II-3 was a active PSII core complex
depleting light-harvesting complexes.
Key words Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar; sucrose gradient centrifugation; PSII; PSII core; light-
harvesting complex; peptide
收稿 2006-03-06 修定 　2006-07-03
*E-mail: chenmclm@163.com, Tel: 0535-6637167
褐藻属于含有叶绿素a (Chl a)和叶绿素c (Chl
c)的杂色藻类，它在进化上比含有Chl a、b的绿
色植物相对原始，没有基粒，类囊体膜成束排列
(Berkaloff等1983); 缺少高等植物作为PSI标志的
730 nm长波荧光(Berkaloff等1990); 其捕光复合物
为特殊的墨角藻黄素-Chl a/c-蛋白复合物，并且
没有PSI和PSII的分化(De Martino等2000)。褐
藻色素蛋白复合物的结构和组成的特殊性，可以
反映出光合系统结构在进化上的多样性，是比较
光合作用研究不可缺少的环节。
但由于褐藻含有大量的藻胶，色素蛋白复合
物尤其是PSII复合物的稳定性差，因此人们对其
了解程度远不及高等植物。目前只有李爱芬等
(2000a)报道用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，分离
到一个类似于高等植物的PSII 中心复合物(core
complex of PSII, CPa); Berkaloof等(1984)用蔗糖密
度梯度离心从锯齿形墨角藻(Fucus serratus)中得到
有活性的PSII颗粒；Douady等(1993)和De Martino
等(2000)进一步以十二烷基麦芽糖苷增溶PSII颗
粒，再用 DEAE 离子交换层析和等电点聚焦电泳
各分离到2种 PSII的亚复合物。但是分离物的组
成、特性、色素比率则由于使用的去污剂种类以
及分离方法不同而存在差异。因此，褐藻PSII系
统结构还待进一步比较和分析。
本文以褐藻裙带菜[Undaria pinnatifida (Harvey)
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月842
Suringar]为材料，用Triton X-100蔗糖密度超离
心分离得到具有明显光氧化活性的PSII复合物颗
粒，以毛地黄皂苷增溶后，经 2 次超离心得到了
3条PSII亚复合物条带，并对PSII复合物和亚复
合物的性质、多肽组成进行了研究。
材料与方法
裙带菜[Undaria pinnatifida (Harvey) Suringar]
于 3月采自山东烟台海滨。参照李爱芬等(2000b)
的方法制备叶绿体和类囊体膜，按 Jeffery 和
Humphrey (1975)的方法测定叶绿素浓度、计算含
量和Chl a/c比值。
依照陈敏等(2001)的方法增溶类囊体膜并铺设
不连续蔗糖梯度，用日立-55P-72SW-41型水平转
头，于4℃下以220 000×g 离心14~16 h。梯度离
心结果立即拍照。
将超离心所得的区带II﹑III用5 mmol·L-1的
麦黄酮(Tricine)-NaOH缓冲液(pH 8.0)透析过夜，
去除游离的Triton X-100，以 100 000×g离心1 h
后，收集沉淀。用适量甘油悬浮液溶解，测定
叶绿素含量、光氧化活性等。
以DCIPH2 作为电子供体，用分光光度法(华
东师范大学生物系植物生理教研组1980)测定超离
心所得各条带的 PSI 光氧化活性。
以K3Fe (CN)6为电子受体，将含有20~50 mg
叶绿素复合物条带加入到反应液中，参照范淑琴
和梁淑文(2004)方法测定PSII光氧化活性。
用毛地黄皂苷:Chl (W/W)=25:1的比例向收集到
的 PSII 颗粒悬浮液中加入去污剂，室温下增溶
7~8 h后，以 30 000×g 离心10 min，取上清液上
样。所用的蔗糖梯度为：0.4 mol·L-1 (0.6 mL)、
0.6 mol·L-1 (0.6 mL)、0.8 mol·L-1 (0.6 mL)、1.0
mol·L-1 (0.6 mL)和1.5 mol·L-1 (0.4 mL)。于4℃
下，以220 000×g 超速离心16 h，梯度结果立即
拍照或测定吸收光谱、荧光光谱、PSI 和 PSII 光
氧化活性。
将梯度离心得到的区带迅速用预冷的 5 0
mmol·L-1的Tricine-NaOH (pH 8.0)缓冲液稀释，以
岛津UV-3000 紫外 - 可见分光光度计测定吸收光
谱，用日立-851型荧光分光光度计测定室温荧光
光 谱 。
SDS-PAGE 电泳分析时，收集梯度离心得到
的PSII复合物及其亚复合物条带，对固体蔗糖浓
缩，控制叶绿素浓度为 0.2~0.6 mg·mL-1，参照
Laemmli (1970)的方法分析多肽。堆积胶和分离胶
中各含有1和 4 mol·L-1 的脲。
实验结果
1 色素蛋白复合物的蔗糖梯度离心分离和鉴定
用温和的非离子型去污剂Triton X-100增溶后
的类囊体膜，经蔗糖梯度离心后得到 3 个区带，
自上而下依次称为区带I、II、III (图 1)。
区带I位于0.3~0.5 mol·L-1梯度内，占总叶绿
素浓度的56.1% (表 1)，上部分偏绿色，中部褐
色，下部偏橘红色，除了Chl a (435和 670~672
nm)外，还富含Chl c (460~465和630 nm )和墨角
藻黄素(540 nm) (图 2)，没有光氧化活性，是墨
角藻黄素-Chl a/c-捕光蛋白复合物(LHC)。绿色
的区带II处于0.8 mol·L-1蔗糖梯度区，是3条带
中含量最少的，占叶绿素总量的 17.9%，具有明
显的PSII 光氧化活性，主要呈现Chl a (435 和
670~672 nm)、胡萝卜素(490 nm)和Chl c (630 nm)
的吸收，墨角藻黄素较少，是附有部分天线复合
物的天然PSII颗粒。区带III则呈褐色，处于1.
0 mol·L-1 蔗糖梯度处，可以还原 DCIPH2，含有
长波长Chl a (436和 675~676 nm)，是有活性的
图1 裙带菜色素蛋白复合物的蔗糖密度梯度离心
Fig.1 Pigment-protein complexes of U. pinnatifida
separated by sucrose gradient centrifugation
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 843
PS I 颗粒。
2 PSII亚复合物的分离和鉴定
收集活性PSII颗粒去除游离的Triton X-100
后，用自行摸索的毛地黄皂苷增溶及超离心分离
方法，得到 3 个亚复合物条带，分别命名为区带
II-1、2、3 (图 3)。
最上层的区带II-1含量最高，占PSII颗粒中
叶绿素总量的63% (表 2)，呈褐绿色，含有Chl a
(434~436和670~671 nm)、Chl c (461和626~628
nm)和墨角藻黄素(540 nm) (图4)，是一个与PSII
相结合的墨角藻黄素-Chl a/c-捕光复合物，没有
表1 裙带菜色素蛋白复合物的性质
Table 1 Characteristics of pigment-protein complexes of U. pinnatifida
区带 蔗糖梯度/mol·L-1 颜色 叶绿素相对含量/% 吸收峰/nm 光氧化活性
I 0.3~0.5 褐绿色 + 橘红色 56.1 Chl a：435, 670~672 无
Chl c：460~465, 630
胡萝卜素：4 9 0
墨角藻黄素：5 4 0
II 0.8 绿色 17.9 Chl a：435, 670~672 有PSII光氧化活性
Chl c：630
胡萝卜素：4 9 0
III 1.0 褐色 26.0 Chl a：435, 675~676 有 PSI光氧化活性
Chl c：630
胡萝卜素：4 9 0
光氧化活性，该条带与Douady等(1993)用离子交
换层析得到的 IE1 类似。
区带II-2为浅黄褐色，与区带II-1相比含有
较少的Chl c，尤其是500~550 nm之间吸收明显
降低，说明该条带基本不含墨角藻黄素，是一个
Chl a/c-蛋白复合物，约占PSII颗粒中叶绿素总
量的 13.5%。在以往的文献中，用十二烷基麦芽
糖苷增溶、离子交换(Douady等1993)或IEF分离(De
Martino等2000)都没有报道有此PSII亚复合物。
区带II-3为鲜绿色，基本不含Chl c和墨角
藻黄素，只含有Chl a (435和671nm)和少量的胡
萝卜素(492 nm)，并且仍然保持着一定的光氧化
活性，是一个纯化了的活性PSII 核心复合物。
图3 2次蔗糖密度梯度离心得到的PSII亚复合物
Fig.3 Subcomplexes of PSII particles isolated by
sucrose density gradient for two times图2 蔗糖密度梯度离心分离的裙带菜
色素蛋白复合物的吸收光谱
Fig.2 Absorption spectra of pigment-protein complexes of
U. pinnatifida isolated by sucrose-density centrifugation
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月844
3 PSII复合物及其亚复合物的荧光光谱
区带II及其3种亚复合物的Chl a激发峰都在
436~439和670~672 nm (图5)。区带II和区带II-
1中还有明显的Chl c (462~465和632~635 nm)和
墨角藻黄素的激发峰(500~550 nm)，是墨角藻黄
素-Chl a/c-蛋白复合物的特征，采用435、460
和540 nm激发时，两者均发射680~681 nm的Chl a
的荧光。而区带 II-2除了Chl a外只有Chl c的激
发峰(462、632 nm)，以 435、460 nm 激发时，
发射峰在 680 nm，这再次证实区带 II-2 是一个
Chl a/c-蛋白复合物。在区带II-3中则发现只有
Chl a 的激发峰，位于436 和 671 nm，说明区带
II-3是不含捕光复合物的PSII核心复合物。
以上结果清楚表明，复合物中各种色素之间
表2 裙带菜PSII色素蛋白亚复合物的性质
Table 2 Characteristics of subcomplexes of PSII particles of U. pinnatifida
区带 蔗糖梯度/mol·L-1 颜色 叶绿素相对含量/% 吸收峰/nm 荧光激发峰/nm 荧光发射峰/nm
II-1 0.4 褐绿色 63 Chl a: 434~436, 670~671 Chl a: 436~439, 670~672 680~681
Chl c: 461, 626~628 Chl c: 462~465, 632~635
墨角藻黄素: 540 墨角藻黄素: 540
II-2 0.6 浅黄褐色 13.5 Chl a: 436, 671 Chl a: 436, 671 680
Chl c: 460, 628 Chl c: 462, 632
胡萝卜素: 490 胡萝卜素: 490
II-3 0.9~1.0 鲜绿色 23.5 Chl a: 435, 671 Chl a: 436, 671 680
胡萝卜素: 492 胡萝卜素: 492
保持着良好的能量传递关系，Chl c或墨角藻黄素
吸收的光能都可以传递给Chl a。
4 多肽组成分析
SDS-PAGE 的结果显示，PSII 颗粒(图 6，第
3 泳道)中主要含有 52、47、41、37、34、20
以及13 kDa等多肽。这些多肽成分在亚复合物区
带II-3 (图 6，第 4泳道)中大部分存在，只缺少
20 kDa 多肽，而 51 kDa 多肽含量有所增加。捕
光复合物区带II-1、2只含20 kDa多肽，区带II-
2 在 30~50 kDa 处有微量的蛋白组分。显然，20
kDa 多肽是褐藻主要的捕光复合物成分，而 52、
47和41 kDa多肽应属于PSII的内周天线(Douady
等1993)，37、34 kDa多肽为PSII反应中心多肽，
图4 2次蔗糖密度梯度离心得到的PSII亚复合物吸收光谱
Fig.4 Absorptinon spectra of subcomplexes of PSII particles
isolated by sucrose density gradient for two times
图5 PSII复合物及其亚复合物的室温荧光光谱
Fig.5 Fluorescence spectra of PSII complex and
subcomplexes at room temperature
Em=700 nm (激发谱); Ex=436 nm (发射谱)。
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月 845
13 kDa多肽可能属于Cyt b-559 (Douady等1993)。
讨 论
褐藻的光合系统结构特殊性之一在于，它的
捕光系统是由分子量单一的多肽成分聚合而成的超
分子复合体(Katoh等1989；Katoh和Ehara 1990)，
均衡地为2个光合系统供能(De Martino等2000)。
尽管目前已经知道，这一捕光复合物多肽均来自
一个保守的基因家族(Passaquet等1991) ，但是褐
藻捕光系统结构是以怎样的方式和关系连接在一起
的，与高等植物有何不同，目前还不清楚。
本文以褐藻裙带菜为材料，用Triton X-100
蔗糖密度超离心后得到具有明显光氧化活性的
PSII复合物颗粒，在了解复合物多肽组成、光谱
特性以及复合物性质的基础上，进一步以毛地黄
皂苷增溶PSII颗粒，经2次超离心分离后成功地
得到了3条PSII的亚复合物条带。其中区带II-3
为依然保持着光氧化活性PSII核心，是一个Chl a-
蛋白复合物，从多肽组成来看，含有 5 2、4 7、
41 kDa内周天线组分和与高等植物类似的2个反
应中心多肽，但分子量更大一些。亚复合物区带
II-1与第1次离心得到的捕光复合物(区带 I)在多肽
组成和光谱性质上基本相同，都只含有20 kDa多
肽，为墨角藻黄素-Chl a/c-蛋白复合物，但由于
亚复合物区带II-1是从活性的PSII颗粒上增溶而
来，因此在结构关系上显然比第 1 次离心得到的
捕光复合物区带I更接近PSII反应中心。分离到
浅黄褐色的区带 II-2 是一个不含墨角藻黄素的
Chl a/c-蛋白亚复合物，并且多肽分析除了20 kDa
捕光复合物多肽外，还有微量的内周天线成分，
说明区带II-2不是由于区带II-1中墨角藻黄素脱落
形成的，而是更靠近PSII 反应中心、包含内周天
线的不同的捕光复合物形式。因此，经毛地黄皂
苷增溶后所得到的 3 种亚复合物的结构关系为：
区带II-3为PSII核心，区带II-2为中间部分，区
带II-1在最外侧，它们共同构成了PSII颗粒。而
第1次超离心得到的捕光复合物(区带I)则可能联
系着PSI (区带III)和PSII颗粒。
上述结果显示，褐藻的PSII核心与高等植物
相似，是只含有 Chl a 的蛋白复合物，外部结合
着内周天线成分，靠近核心部分的捕光复合物除
了含有 Chl a 外，还含有 Chl c，而最外部的捕
光复合物为墨角藻黄素-Chl a/c-蛋白复合物。本
文分离到的不含墨角藻黄素的Chl a/c-蛋白亚复合
物的存在，说明褐藻的20 kDa主要捕光复合物多
肽成分，在结合色素时并非均一。今后，与褐
藻PSII结构相关的多肽以及色素分子计量仍需做
进一步的分析。
参考文献
陈敏, 李爱芬, 周百成(2001). 海洋管藻目绿藻刺松藻光系统I复
合物的分离. 生物化学与生物物理进展, 28 (6): 858~861
范淑琴, 梁淑文(2004). 现代植物生理学实验指南. 北京: 科学出
版社, 108~109
华东师范大学生物系植物生理教研组(1980). 植物生理学实验指
导. 北京: 人民教育出版社, 116~117
李爱芬, 陈敏, 周百成(2000a). 褐藻裙带菜色素-蛋白质复合物
分离与命名. 植物学报, 42 (2): 153~157
李爱芬, 陈敏, 周百成(2000b). 褐藻叶绿体的制备. 生物化学与
生物物理进展, 27 (5): 551~553
Berkaloof C, Caron L, Rousseau B (1990). Subunit organization
of PSI particles from brown algae and diatoms: polypeptide
and pigment analysis. Photosynth Res, 23: 181~193
Berkaloff C, Duval JC, Hauswirth N, Rousseau B (1983). Freeze
fracture study of thylakoids of Fucus serratus. J Phycol, 19:
96~100
Berkaloof C, Duval JC, Rousseau B (1984). Active PSII particles
图6 PSII复合物及其亚复合物多肽的电泳图谱
Fig.6 Electrophoretograms of peptides analysis
of PSII complex and subcomplexes
1: 区带II-1; 2: 标准蛋白; 3: 区带II; 4: 区带II-3; 5: 区带II-2。
植物生理学通讯 第42卷 第5期，2006年10月846
from a brown algae: spectral and electrophoretic characteri-
zation. Adv Photosynth Res, 1 (4): 449~452
De Martino A, Douady D, Quinet-Szely M, Rousseau B, Crépineau
F, Apt K, Caron L (2000). The light-harvesting antenna of
brown algae: highly homologous proteins encoded by a
multigene family. Eur J Biochem, 267: 5540~5549
Douady D, Rousseau B, Berkaloff C (1993). Isolation and charac-
terization of PSII core complexes from a brown alga, Lami-
naria saccharina. FEBS Lett, 324 (1): 22~26
Jeffrey S, Humphrey G (1975). New spectrophotometric equa-
tions for determining chlorophylls a, b, c1 and c2 in higher
plants, algae and natural phytophankton. Biochem Physiol
Pflanzen, 167: 191~194
Katoh T, Ehara T (1990). Supramolecular assembly of fucoxan-
thin-chlorophyll-protein complexes isolated from a brown
alga, Petalonia fascia. Plant Cell Physiol, 31: 439~447
Katoh T, Mimuro M, Takaichi S (1989). Light-harvesting
particles isolated from a brown alga, Dictyota dichotoma. A
supramolecular assembly of fucoxanthin-chlorophyll-
protein complexes. Biochim Biophys Acta, 976: 233~
240
Laemmli U (1970). Cleavage of structural proteins during the
assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 227:
680~685
Passaquet C, Thomas JC, Caron L, Hauswirth N, Puel F, Berkaloff
C (1991). Light-harvesting complexes of brown algae. Bio-
chemical characterization and immunological relationships.
FEBS Lett, 280: 21~26