全 文 ： Marine Sciences / Vol. 34, No. 12 / 2010 67
软骨藻酸多克隆抗体的制备
刘元嫄, 程金平, 高利利, 徐 玮, 吴浩东
(上海交通大学 环境科学与工程学院, 上海 200240)
摘要: 为建立软骨藻酸(DA)的免疫检测法, 本研究采用活泼酯法将 DA 与载体蛋白 KLH(BSA)偶联形
成完全免疫抗原(包被抗原), 并通过紫外光谱扫描证明偶联成功与否。用完全免疫抗原 DA-KLH 对新
西兰白兔进行免疫, 间接 ELISA 法测定血清效价。实验结果表明偶联成功, 经过 19 周免疫后血清效价
达到 1:1600, 纯化后获得效价为 1:800的多克隆抗体, 同时也间接证明了合成的完全抗原具有免疫原性,
为以后建立免疫分析法奠定了基础。
关键词: 软骨藻酸; 多克隆抗体; 活泼酯法
中图分类号: R392-33 文献标识码: A 文章编号: 1000-3096(2010)12-0067-03
软骨藻酸(Domoic Acid, DA)是赤潮毒素失去记
忆性贝毒(Amnesic Shellfish Poisoning, ASP)的主要
成分。中毒后可引起腹泻、呕吐、严重者可致意识
混乱、记忆丧失。DA 最早于 1958 年从树枝软骨藻
(Chondria armata) 中 分 离 , 并 于 随 后 相 继 分 离 了
A-H 八种异构体[1]。其中异构体 A、B、C 的毒性远
低于 DA 本身[2]。DA 主要通过与谷氨酸受体结合引
发一系列生化反应, 从而导致神经元损伤及细胞死
亡[3]。自加拿大爱德华王子岛爆发了因食用被 DA 污
染的紫贻贝而导致人类中毒事件后, 引起了人们对
贝类产品中 ASP 检测的重视, 各国先后制定了 DA
的安全限量为 20 µg/g 贝肉[4]。目前 DA 较为普遍的
检测方法有小白鼠生物检测法、HPLC-UVD 法及免
疫检测法。小白鼠生物法简单易行, 但其只能毒素的
整体水平、精确度低、检测限高、易受其他种类毒
素 干 扰 、 无 法 满 足 人 们 对 食 品 安 全 的 检 测 需 求 ;
HPLC-UVD 法作为水产及水产加工品专业委员会
(Codex Committee on Fish and Fishery Products,
CCFFP)推荐的方法[5]虽然具有灵敏度高、检测限低
的优点, 但因其仪器昂贵、对分析人员的要求高、前
处理繁琐而不适用于基层检测单位对大量样品的分
析。而免疫检测如 ELISA 法, 则兼具检测便利快速,
精确度较高等特点而已被广泛用于环境污染物及农
药兽药残留的检测[6-8]。由于 DA 分子量小、结构简
单无法刺激动物产生抗体, 因此目前为止还没有成
熟的商品化检测试剂盒。作者采用活泼酯法将 DA
与载体蛋白偶联, 成功制备了完全抗原并免疫新西
兰兔获得多克隆抗体, 为建立 DA 检测试剂盒奠定
了基础。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 药品
软骨藻酸(DA)购自 ALEXIS 公司, 纯度为 98%;
牛血清白蛋白(BSA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)、弗式完
全佐剂(FCA)、弗式不完全佐剂(FIA)、二甲基亚砜
(DMSO)、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基 碳化二亚胺
盐酸盐(EDC·HCl)均购自 Sigma 公司; N-羟基琥珀
酰亚胺(NHS)、Tween-20、四甲基联苯胺(TMB)、96
孔酶标板、透析袋(截留分子量 8000)均购自上海生
工; 辣根过氧化物酶标记羊抗兔 IgG 购自北京博奥
森生物技术有限公司; Millipore 超滤管(截留分子量
10000); 无水乙醇、柠檬酸、过氧化氢、磷酸氢二钠、
磷酸二氢钾、氯化钠、氯化钾、碳酸钠、碳酸氢钠、
浓硫酸等均为分析纯, 购自国药集团化学试剂有限
公司。
1.1.2 实验仪器
紫外可见分光光度计; Multiskan Mk 3 酶标仪
( 芬 兰 雷 勃 ); 隔 水 式 恒 温 培 养 箱 GNP-9050 型 ;
HANGPING FA2004 电子分析天平(上海精密科学仪
器有限公司); 单通道微量移液器(Enppendorf); 12 通
道微量移液器(MedDragon);

收稿日期: 2010-02-22; 修回日期: 2010-06-13
基金项目: 上海科委科技攻关项目(08DZ1206302)
作者简介: 刘元　(1985-), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为环境健
康 , Email: yy_liu@sjtu.edu.cn; 程 金 平 , 通 信 作者 , 博 士 , 副 教 授 ,
电话: 021-54742823, 13916873206, E-mail: jpcheng@sjtu.edu.cn
68 海洋科学 / 2010 年 / 第 34 卷 / 第 12 期
1.1.3 实验动物
新西兰大白兔数只, 雌性, 体质量 1.8~2 kg, 购
自上海陈行实验用兔有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 完全免疫抗原与包被抗原的合成
1 mg DA 溶于少量溶剂中(DMSO:水=1:9), 加入
0.8 mg EDC·HCl(10 mg/mL)、1.2 mg NHS(20 mg/mL)
及少量反应缓冲液(0.1 mol/L PBS, pH7.0), 置于 25 ℃
反应 2 h 后转移至 4 ℃冰箱内反应过夜。加入用稀释
缓冲液(0.01 mol/L PBS, pH7.0)溶解的 KLH 或 BSA 2
mg, 并补加少量反应缓冲液, 置于 25 ℃反应 3 h 后,
转移入超滤管 4500 r/min 离心 15 min, 除去未反应完
的小分子。适度稀释后, 取少量反应物用紫外分光光
度计检测、剩余药品分装后于−20℃保存。
1.2.2 抗体的制备
新西兰白兔在动物房内适应性驯养一周后, 选择
身体健康的白兔, 从耳静脉抽取 2~4 mL 血, 分离阴性
血清, −20 ℃冻存备用。一周后进行免疫, 首免用 200
µg DA-KLH, 同时分别用 KLH 和生理盐水作为免疫原
作为对照。将偶联物稀释至 0.5 mL, 采用注射器双推
法, 与等体积弗式完全佐剂充分乳化, 颈背部多点皮
内注射。三周后进行二免, 剂量方法同首免, 与弗式不
完全佐剂混合乳化。以后以相同剂量与方法每隔两周
免疫一次。从三免开始, 每次免疫一周后, 耳静脉取血
2 mL, 测定效价。待效价达到一定程度后, 用等体积的
稀释缓冲液稀释后, 耳静脉注射加强免疫。一周后心脏
取血, 37 ℃放置 1 h, 4 000 r/min、4 ℃离心 15 min 分离
血清。采用辛酸-硫酸铵法对抗血清纯化, 用 0.01 mol/L
PBS(pH7.4)透析 3 天除盐, 用少量 0.01 mol/L PBS 稀释
后分装, −20 ℃冻存备用。
1.2.3 抗体效价的测定
采用间接酶联免疫吸附法测定抗体效价。用
DA-BSA 作包被抗原, 以碳酸盐缓冲液(pH 9.6)做梯
度稀释, 每孔 100 µL, 4 ℃包被过夜; 弃去残液后,
每孔加 200 µL PBS-T(含 0.05% Tween-20 的 0.01
mol/L PBS 溶液, pH 7.4), 振荡洗涤 3 次, 每次 3 min;
每孔加 200 µL 封闭液(含 0.05% BSA 的 0.01 mol/L
PBS), 37 ℃封闭 2 h; 拍干板内液体后, 加梯度稀释
的血清, 每孔 100 µL, 37 ℃孵育 1 h; 洗板 3 次; 加入
辣根过氧化酶标记的二抗, 每孔 100 µL, 37 ℃孵育 1
h; 洗板 5 次; 每孔加 100 µL TMB-H2O2 显色液( pH
5.0), 显色 10 分钟后, 每孔加 50 µL 2 mol/L H2SO4
终止液, 用酶标仪测定波长 450 nm 及 630 nm 处的光
吸收值。
2 结果
2.1 完全抗原的偶联与鉴定
采用活泼酯法[7,9,10]将 DA 上的羧基先与 NHS 及
EDC 反应, 先生成酯类中间产物, 然后与载体蛋白
上的自由氨基反应形成由酰胺键相连的偶联物。反
应方程式如图 1。
将合成完的偶联物、DA、KLH、BSA 稀释, 用
紫外光谱进行特征扫描。如图 2、图 3 可见 DA 的特
征吸收峰在 242 nm 处, 载体蛋白 KLH 及 BSA 的特

图 1 DA 与载体蛋白的偶联
Fig. 1 Reactions between DA and carrier protein

征吸收峰在 280 nm 处, 而合成的偶联物的紫外光谱
扫描的特征谱线与 DA、KLH 及 BSA 的谱线的峰型
及最大吸收峰有较大的区别, 可定性证明活泼酯法
能成功地将载体蛋白和 DA 进行偶联。
2.2 抗体效价的测定
以 DA-BSA 为包被抗原, 用棋盘法测定血清效
价。P / N≥2.1 为阳性判断终点, 以判为阳性的最高
稀释倍数为终点效价, 免疫 8 次后, 效价变化如图
4。在八次免疫过后, 注射 DA-KLH 的白兔血清中抗
体效不再增加 , 滴度为 1:1600, 间接证明了合成的
完全免疫抗原具有一定的免疫原性。经辛酸-硫酸铵
二步法纯化后抗体各个滴度的吸光度值如表 1 所示。
纯化后抗体效价为 1:800, 比纯化前下降一个滴度。
3 讨论
本研究采用了活泼酯法将 DA 与载体蛋白偶联,
通过紫外光谱扫描发现偶联物与单体的谱图有较大
地差异 , 故而定性地证明了成功合成了免疫抗原
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图 2 完全免疫抗原 DA-KLH 紫外光谱扫描图
Fig. 2 UV absorption of DA-KLH

图 3 包被抗原 DA-BSA 紫外光谱特征扫描图
Fig. 3 UV absorption of DA-BSA

图 4 血清中抗体效价的变化
Fig. 4 Rabit serum titers determined by indirect ELISA

DA-KLH 及包被抗原 DA-BSA, 并使用 DA-KLH 对
新西兰白兔进行免疫。经过八次共 19 周的免疫, 用
间接 ELISA 法测定效价, 效价达到 1:1600, 纯化后
获得效价为 1:800 的抗体。
在诱导动物产生特异性抗体的过程中影响因素颇
多, 除了外部环境、动物自身的免疫应答能力等因素外,
抗原本身的免疫原性及免疫特性最为重要。小分子半
抗原的免疫特性的好坏主要取决于基团结构的复杂
性、结构中环的数目、杂原子的数目和结构的不均一
性[11]。而半抗原本身又不具备免疫原性, 必须与载体蛋
白偶联后才可刺激动物产生抗体。DA 上带有 3 个羧基
均可与载体蛋白偶联, 故偶联的时候具有较大的随机
性, 易将杂环包裹从而降低特性。但由于 DA 价格昂贵,
不适于对其进行基团修饰, 因此根据文献报道[10], 进
行直接偶联, 同时对其方法做了适当改进, 使反应中
尽可能得不损失抗原。免疫后结果如图 4 及表 1, 实验
表明, 选择了免疫原性较好的 KLH 作为免疫抗原的载
体蛋白, 对实验动物进行常规免疫, 能够刺激动物产
生针对 DA 的抗体, 利用间接 ELISA 法检测的效价也
尚可, 纯化后得到可以使用的抗体, 为今后进一步建
立 ELISA 检测方法奠定了基础。

表 1 纯化后抗体效价测定结果
Tab. 1 Titers of purified serum by different immunogens
抗体稀释
倍数
KLH 组
A450~630
DA-KLH 组
A450~630
生理盐水组
A450~630
1:400 0.375 0.878 0.351
1:800 0.215 0.557 0.252
1:1600 0.117 0.255 0.198
1:3200 0.111 0.160 0.151
1:6400 0.061 0.097 0.117
阴性
血清 0.166 0.194 0.322
空白 0.024 0.074 0.149
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(下转第 74 页)
74 海洋科学 / 2010 年 / 第 34 卷 / 第 12 期
Survival and growth performance of zygotes/embryos of the
brown alga Hizikia fusiformis after low temperature
treatments
ZHANG Yu-rong1, PANG Shao-jun2
(1. Marine Fishery Institute of Zhejiang Province, Zhoushan, 316100, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese
Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)
Received: Nov., 25, 2008
Key words: Hizikia fusiformis; zygotes; low temperature; cultivation

Abstract: Hizikia fusiformis has been an important export-orientated brown alga in China. Large-scale cultivation
relies on the supply of seedlings that are derived from sexual reproduction. With the development of the technique
of synchronized fertilization, more and more seedlings are now produced via sexual reproduction. In this investiga-
tion, we performed a series of experiments to understand how zygotes of this alga develop and grow after short-term
treatments at low temperature. Multi-celled embryos or two-cell zygotes of H. fusiformi were preserved at 5℃, for
varied durations. The development of rhizoids, survivals of individuals, and growth performances were investigated.
The results showed that the death rate of the two-cell zygote was conspicuously higher than that of the multi-cell
zygote under the same conservation and recovering culture condition. The mortality of the multi-cell embryos was
10% after 60 h at 5℃, while that of the two-celled zygotes reached 75% after being preserved under the same con-
dition. Discoveries in this investigation paved the way for transporting zygotes or embryos of this alga for comple-
tion of seedlings production over distance along the coast.
(本文编辑: 张培新)



(上接第 69 页)
Preparation of polyclonal antibodies against domoic acid
LIU Yuan-yuan, CHENG Jin-ping, GAO Li-li, XU-Wei, WU Hao-dong
(School of Environmental Science and Engineering, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)
Received: Feb., 22, 2010
Key words: domoic acid; polyclonal antibody; activation ester method

Abstract: To develop an immunoassay of domoic acid (DA), DA was coupled to keyhole limpet hemocyanin (KLH)
or bovine serum albumin (BSA) by the activation ester method. The conjugates were characterized by UV absorp-
tion. Polyclonal antibodies for domoic acid were generated from rabbits after the animals had been immunized by
DA-KLH for 19 weeks. The titer of antiserum was 1:1600, detected by an indirect ELISA. After purification, the
titer of antiserum became 1:800. DA-KLH was proved to be a suitable immunogen to prepare antibodies against
DA.
(本文编辑:梁德海)