全 文 ：生 物 技 术 2012 年 22(3)
青杄 FKBP12 基因原核表达和多克隆抗体的制备
黄桂雪，王雨涵，张凌云*
(北京林业大学森林培育与保护教育部重点实验室，北京 100083)
摘要:目的:制备青杄 FKBP12 基因的多克隆抗体，为进一步分析 FKBP12 的蛋白定位、表达等提供基础。方法:采用 PCR方
法扩增 FKBP12 基因得到其全长 cDNA序列，并将其克隆至原核表达载体 pET － 48b 中，转化入 BL21 菌株。经 IPTG 诱导，表达
了分子量约为 33kD的重组蛋白，SDS － PAGE和 Western blotting检测鉴定表达产物。此蛋白经亲和纯化后，作为抗原注射新西
兰兔，进行抗体制备。结果:成功获取了多克隆抗体，制备的 FKBP12 兔抗血清效价在 1∶ 729 000 以上，ELISA结果表明融合蛋白
具良好的免疫原性。间接 ELISA法检测纯化后抗体效价，表明纯化后抗 FKBP 蛋白兔多克隆抗体效价高，检测灵敏度为 16ng /
mL。结论:所制备的抗体能满足后续试验要求的效价值，为进一步研究提供基础。
关键词:青杄;FKBP12 基因;原核表达;蛋白纯化;多克隆抗体
中图分类号:Q786 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 62
Prokaryotic Expression of the Picea wilsonii
FKBP12 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibodies
HUANG Gui － xue，WANG Yu － han，ZHANG Ling － yun*
(Key Laboratory of Forest Silviculture and Conservation of the Ministry of Education，Beijing Forestry University，Beijing 100083)
Abstract:Objective:The polyclonal antibodies can be used for further investigation，which establish the foundation for investigating the
function of the FKBP12 gene in protein level. Method:The cDNA encoding full － length of FKBP12 was amplified by PCR and was insert-
ed into vector pET － 48b. The recombinant plasmid FKBP12 － pET48b was then transformed into E. coli BL21 and the FKBP12 recombi-
nant protein of 33kD was expressed by induction with IPTG. The expression product was indentified by SDS － PAGE and Western blotting
analysis. The fusion protein was purified by affinity chromatography and then was used to immunize rabbits to generate polyclonal
antibody. Result:Successfully acquired the polyclonal antibody，preparation of FKBP12 rabbit antiserum titer in 1:729 000，ELISA results
show that the fusion protein with good immunogenicity. Indirect ELISA method for the detection and purification of antibody titer after that，
after purification of FKBP protein of rabbit polyclonal antibody titer high，detection sensitivity for 16ng /mL. Conclusion:The polyclonal an-
tibodies can be used for further investigation，provides a theoretical basis for further research.
Key words:Picea wilsonii;FKBP12 gene;prokaryotic expression;protein purification;polyclonal antibody
收稿日期:2012 － 01 － 14;修回日期:2012 － 03 － 16
作者简介:黄桂雪(1986 －) ，女，山东临沂人，硕士生，研究方向:植物
抗逆基因克隆和功能研究，Email:huangguixue2008@ sina. com;* 通讯
作者:张凌云(1973 －) ，女，副教授，研究方向:果实发育的细胞及分子
生物学、植物抗逆分子生物学，Email:lyzhang73@ sohu. com。
0 引言
FKBPs 是一个高度同源的伴侣分子蛋白家族，它可以和
免疫抑制剂结合从而起到免疫抑制的作用。自 1989 年首次
在《Nature》报道以来，已经陆续找到了多种 FKBPs［1］。FKBPs
广泛分布于不同种属的各类细胞中，含量丰富，分子大小从
12kD到 35kD不等。FKBPs 是一个很大的家族，其中含量最
丰富、最先被确定的成员是 FKBP12［2］。目前为止已经在哺乳
动物中发现了 15 种 FKBP，它们绝大多数在脑中高浓度表达，
特别是 FKBP12［3］。FKBP12 基因在植物中具有肽基 －脯氨酰
顺反异构酶活性和分子伴侣功能，在受到逆境胁迫时，植物
FKBP12 基因能起到调控作用。有研究表明 FKBP12 能够与
NF － YC相互作用，在青杄花粉管的生长发育中发挥重要作
用［4］。
本研究将青杄 FKBP12 基因克隆到原核表达载体 pET －
48b中，利用大肠杆菌系统表达并纯化获得 FKBP12 融合蛋
白。将获得的融合蛋白免疫兔子，制备青杄 FKBP 克隆抗体，
并对多克隆抗体的效价和特异性进行分析，为研究 FKBP12 基
因在植物组织中的定位及响应逆境胁迫过程中的功能等奠定
了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验材料
表达菌株 BL21 为北京天根生化科技有限公司产品;pET
－ 48b表达载体由清华大学生命科学学院张大鹏实验室惠赠;
2 只健康的 SPF级成年新西兰大白兔(每只体重约 2kg)。
1. 1. 2 试剂
限制性内切酶、T4 DNA 连接酶、蛋白 marker、反转录试剂
盒均为 Fermentas公司产品;RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、
Tag酶、质粒小量提取试剂盒、DNA marker 都由北京天根生化
科技有限公司提供;溶菌酶购自 amresco 公司;Ni － NTA － His
－ Bind Resin 为 Novagen 产品;PVDF(聚偏二氟乙烯膜)转印
膜、AP标记的羊抗兔抗体、His标签抗体均购自北京亚太恒信
生物技术有限公司;其他常规化学药品均为进口或国产分析
纯。
1. 2 方法
1. 2. 1 FKBP12 基因的克隆
根据 Genebank 数据库中的 PwFKBP12 基因的 cDNA 用
RNA提取试剂盒提取青杄的 RNA，反转录成 cDNA(登录号
GQ140630. 1) ，用 Primer 5. 0 设计扩增其全长引物 P1，P2。
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上游引物 P1:5’CCGGAATTCTATGGGAGTGGAGAAG-
GAGAT 3’(划线部分为 EcoRⅠ酶切位点) ，
下游引物 P2:5’CCCAAGCTTCTAGTTTACACTCAGAACT-
TCAATC 3’(划线部分为 HindⅢ酶切位点)。
以上述 cDNA为模板，PCR 反应体系为:模板 1 × 10 －6 L，
引物各 0. 5 × 10 －6 L(0. 00002mol /L) ，2 × Taq 酶 1 × 10 －5 L，去
离子水补充体积至 2 × 10 －5 L。PCR 反应的条件是:95℃预变
性 5 min;95℃变 30s;55℃退火 30s;72℃延伸 45s;循环 30 次;
72℃延伸 10 min［5］。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，以
确定目的条带是否在合适位置，并切胶回收(参照说明书)。
1. 2. 2 原核表达载体 FKBP12 － Pet48b的构建
取 10μL Pet48b大肠杆菌接种到含卡那霉素(50μg /mL)
的 LB液体培养基中，37℃、260r /min 过夜培养，离心去上清，
进行质粒回收(参照说明书)。琼脂糖凝胶电泳检测，质粒和
目的片段 DNA分别进行双酶切，消化 12h，回收酶切产物。在
T4 连接酶的作用下连接，然后转入 BL21 感受态细胞中，将其
涂布在 Kan +(50mg /L)抗性平板上，37℃过夜，挑取单菌落。
一部分进行菌落 PCR，另一部分接入液体 Kan +(50mg /L)LB
培养基中培养，提质粒，用 EcoRⅠ和 HandⅢ双酶切，琼脂糖凝
胶电泳检测目的基因是否转入，并送上海英俊生物技术公司
测序，最终得到正向插入的 FKBP12 － Pet48b 的原核表达载
体。
1. 2. 3 探索不同条件中融合蛋白的表达量
将上述菌液按 1:10 的比例，接入 Kan +(50mg /L)LB培养
基中培养 OD600值达到 0. 7 左右时，加入 IPTG(异丙基硫代半
乳糖苷)至终浓度为 0. 5 × 10 －3 mol /L，分别在 4h、6h、8h、10h
的时候取样，SDS － PAGE检测，在不同的转速温度组合下重复
上述实验。
1. 2. 4 融合蛋白 FKBP12 的诱导表达及可溶性分析
含有重组表达质粒的菌种在 0. 5L 的 Kan +(50mg /L)LB
培养基中培养，至 OD600值 0. 5 ～ 1. 0 时加入 IPTG 至终浓度为
0. 5 × 10 －3mol /L，37℃、260r /min 8h后 13 000r /min离心，收集
菌体。加入蛋白酶抑制剂和溶菌酶用 30mL 清洗缓冲液
(2. 5mol /L NaCl，0. 25mol /L NaH2PO4，0. 01mol /L 咪唑，pH
8. 0)重悬。超声破碎仪破碎菌体，释放蛋白，加 TritonX － 100，
冰上震荡 0. 5h后 4℃下分离上清和沉淀。
包涵体的处理:100mL的清洗缓冲液重悬上步沉淀，离心
后去上清，去除可溶性蛋白，剩余沉淀用 30mL含 8mol /L尿素
的裂解缓冲液溶解，冰浴孵育 1h，彻底溶解包涵体，离心去除
不溶成分。
SDS － PAGE检测融合蛋白的可溶性:经 IPTG诱导后的表
达产物经 12%的 SDS － PAGE电泳后转移硝酸纤维膜上，以抗
His标签兔多克隆抗体为一抗，山羊抗兔 IgG AP 标记抗体作
为二抗，用 NBT /BCIP显色，检测分析 Western blotting结果。
1. 2. 5 融合蛋白的纯化
将目的蛋白载入 Ni － NTA 琼脂糖亲和层析柱中，冰上结
合 2 ～ 4h，用 4 倍体积的漂洗缓冲液(2. 5mol /L NaCl，0. 25mol /
L NaH2PO4，0. 01mol /L咪唑，pH 8. 0)洗 3 次，以彻底去除杂蛋
白和分特异性结合蛋白，用 1 倍体积的洗脱缓冲液(2. 5mol /L
NaCl，0. 25mol /L NaH2PO4，0. 01mol /L咪唑，pH 8. 0)洗脱目的
蛋白 3 ～ 5 次，分别收集组分。
1. 2. 6 抗体的制备及效价的检测
在免疫前，对多只兔子进行血清背景检测，在每只兔子耳
缘静脉处取血 0. 5 ～ 1ml，分离抗血清，以目的蛋白为抗原，免
疫前血清为一抗，山羊抗兔 IgG AP 标记抗体作为二抗，进行
Western blotting分析。
首次免疫 600μg /只，在抗原溶液中加等体积弗氏完全佐
剂乳化，在皮下多点注射。第 2 d 时进行第二次免疫，400μg /
只，在抗原溶液中加等体积弗氏不完全佐剂乳化，皮下多点注
射。在第 35 d 和第 49 d 时分别进行三免和四免，方法同二
免。
免疫 10d之后，在每只兔子耳缘静脉处取血 0. 5 ～ 1 ml，并
分离抗血清，然后进行间接 ELISA 检测免疫后血清效价。各
以 2μg /ml的浓度将目的蛋白包被到酶标板中，100μl /孔，在
4℃过夜;PBST洗涤(3 次，每次振板 5 s，下面的洗涤步骤条件
均同此)。5% 脱脂奶粉封闭，300μl /孔，在 37℃ 封闭 2h。
PBST洗涤，将待检测抗血清按照不同的倍数的浓度进行稀
释，加入酶标板中，100μl /孔，在 37℃孵育 2h。PBST 洗涤，用
HRP标记的山羊抗兔 IgG(1:10 000)稀释后，加入酶标板中，
100μl /孔，在 37℃孵育 50min。PBST 洗涤，加入配好的 TMB
底物显色工作液，100μl /孔，显色 10min。加入 2mol /L H2SO4
终止显色，50μl /孔。用 ddH2O 洗 3 次，酶标仪测 450nm 波长
的 OD值。如效价达到指标要求，则在检测效价后的第 2d 采
用心脏穿刺的方法采全血，分离抗血清。
1. 2. 7 ProteinA纯化后抗血清
用结合缓冲液平衡 protein A 亲和柱至基线平稳，将用结
合缓冲液稀释的血清样品负载上柱，收集流穿液，将流穿液再
次上柱，继续平衡至基线平稳。加入洗脱缓冲液洗脱，收集洗
脱峰，用 SDS － PAGE检测抗血清的纯度。用浓度为 0. 01mol /
L、pH 7. 2 的 PBS 透析收集的洗脱峰，纯化后的 IgG 保存在
0. 01mol /L、pH 7. 2 的 PBS环境中。蛋白定量检测仪测定纯化
后总 IgG的浓度，SDS － PAGE检测纯化后抗体纯度。
1. 2. 8 抗体的 Western blotting检测
Western blotting:12%的 SDS － PAGE 电泳后将凝胶转移
至硝酸纤维膜上，在转移电泳缓冲液中转膜，电压 100V，电流
400A，时间为 80min，然后将硝酸纤维膜置于含 5% BSA 的
TBST溶液中室温封闭 2h，TBST 溶液洗膜，1∶ 3 000 稀释一抗
于含 5%BSA的 TBST 溶液中 4℃过夜，洗膜，1∶ 5 000 稀释山
羊抗兔 IgG AP二抗于含 5% BSA 的 TBST 溶液中室温摇动孵
育 2h，洗膜，NBT /BCIP室温下显色。
2 结果分析
2. 1 FKBP12 基因全长的扩增
以青杄 cDNA模板，用设计好的引物在合适的条件下进行
PCR，扩增全长，得到一个长约 339bp的条带，检测到的条带大
小与目的片段的大小相符。
2. 2 重组表达载体 FKBP12 － pET48b的鉴定
FKBP12 基因与原核表达载体质粒分别双酶切，连接后转
入 BL21 中，在固体的 Kan + LB培养基中培养，挑取单菌落，与
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图 1 FKBP12 基因的 PCR产物电泳图谱
1. FKBP12 基因的 PCR产物;2. DL2000 分子质量标准。
Fig. 1 PCR products of FKBP12
1. PCR products of FKBP12;2. DL2000 marker.
之前设计的引物进行菌落 PCR，琼脂糖凝胶电泳显示的条带
位置与预期相同。将重组质粒 FKBP12 － pET48b 用 EcoRⅠ
和 HandⅢ酶切，琼脂糖凝胶电泳检测，发现有一大一小两个条
带，大条带是 pET48b 质粒被酶切后剩余的片段，小的条带位
置与目的片段大小相符，证明了原核表达载体 FKBP12 －
pET48b构建成功。
图 2 重组质粒 FKBP12 － pET48b的酶切鉴定
1. 重组质粒 FKBP12 － pET48b经 EcoRⅠ和 HandⅢ双酶切;2. DL2000
分子质量标准。
Fig. 2 Identification of the recombinant plasmid FKBP12 － Pet48b
1. The recombinant plasmid FKBP12 － pET48b digested with EcoRⅠ and
HandⅢ;2. DL2000 marker.
2. 3 融合蛋白的表达量及可溶性分析
融合蛋白大量表达时，设置对照组，对照组不加 IPTG 诱
导。取诱导之后的菌，超声破碎后，分离上清和沉淀，SDS －
PAGE检测，对照组中融合蛋白表达不明显，实验组中上清里
融合蛋白很少，表明该诱导表达蛋白大部分以包涵体的形式
存在或是超声波破碎不彻底。
2. 4 融合蛋白的亲和层析纯化
由于融合蛋白中带有 His 标签，所以采用 Ni － NTA
HiS. Bind Resin纯化，将收集到的洗脱缓冲液洗脱的组份进行
图 3 融合蛋白的可溶性分析
1. 蛋白分子量标准;2. 没加 IPTG诱导的重组菌 FKBP12 － pET48b;3.
加 IPTG诱导的重组菌 FKBP12 － pET48b;4. 重组菌 FKBP12 － pET48b
裂解沉淀物;5. 重组菌 FKBP12 － pET48b裂解上清。
Fig. 3 Solubility analysis of fusion protein
1. Protein molecular weight marker;2. FKBP12 － pET48b without IPTG in-
duction;3. FKBP12 － pET48b induced with IPTG;4. The lysate precipitant
of FKBP12 － pET48b;5. The lysate supernatant of FKBP12 － pET48b.
图 4 FKBP12 － Pet48b诱导表达产物的 SDS － PAGE分析
1. 重组菌 FKBP12 － pET48b不加 IPTG诱导;2 ～ 4. 重组菌 FKBP12 －
pET － 48b加 IPTG分别诱导 4、6、8h。
Fig. 4 SDS － PAGE of the product from recombinant plasmid FKBP12 －
pET48b
1. FKBP12 － pET48b /BL21 without IPTG induction;2 － 4. FKBP12 －
pET48b /BL21 induced with IPTG for 4h，6h and 8h，respectively.
SDS － PAGE分析，发现过柱子后，第 1、第 2 次的洗脱产物杂
蛋白较多，第 3 次的杂蛋白占得比重较小，为了保证抗体的效
价，一般都要求目的蛋白的纯度尽可能高，而且浓度不低于
1mg /mL，所以综合考虑，第 3 次洗脱的蛋白符合要求。
2. 5 本底反应
采集多只兔子的血清进行本底反应，以兔血清为一抗，山
羊抗兔 IgG AP标记抗体作为二抗，进行Western blotting分析，
筛选出在目的条带(34kD 左右)位置无明显特异结合的 2 只
兔子，排除兔子自身抗原对实验的干扰。
2. 6 FKBP12 多克隆抗体的间接 ELISA检测
以纯化后的融合蛋白 FKBP12 包被酶标板，免疫后抗血清
稀释比例分别采用 1:1 000、1:3 000、1:9 000、1:27 000、1:81
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图 5 Ni － NTA纯化融合蛋白
1. 破碎处理后的总蛋白;2 ～ 4. 第 1、2、3 次洗脱的杂蛋白;5 ～ 7. 第
1、2、3 次洗脱的目的蛋白。
Fig. 5 SDS － PAGE analysis of purified protein with Ni － NTA
1. The total protein;2 － 4. The elution of unnecessary protein for three
times，respectively;5 － 7. The elution of necessary protein for three times，
respectively.
图 6 免疫前兔血清的本底反应
1. 蛋白分子量标准;2. 兔血清免疫印记检测条带。
Fig. 6 Western blotting assay
1. Protein molecular weight marker;2. Western blotting assay of rabbit ser-
um.
000、1:243 000，1:729 000，进行间接 ELISA测定多克隆抗血清
的效价。对照组为免疫前的抗血清。结果如图所示，OD阳 /
OD阴 ＞ 2. 1，且 OD 值 ＞ 0. 1。以 A450 阳 /A450 阴 ＞ 2. 1 为标
准［6］，当血清稀释到 729 000 倍数时，A450值为 0. 701，而阴性
对照 A450为 0. 055，呈阳性。表明制备的 FKBP12 兔抗血清效
价在 1∶ 729 000 以上。ELISA 结果表明融合蛋白具良好的免
疫原性。
2. 7 Protein A纯化后抗血清的检测
经 Protein A纯化后抗血清获得总 IgG的量为 181. 4mg，体
积为 20ml，纯化后抗体浓度为 9. 07mg /mL。用 SDS － PAGE检
测纯化后抗体纯度，如图 8 所示。间接 ELISA 法检测纯化后
抗体效价，表明纯化后抗 FKBP 蛋白兔多克隆抗体效价高，检
测灵敏度为 16ng /mL。
2. 8 免疫印记检测抗体特性
为了验证抗体对抗原的特异反应，进行 Western blotting
分析。抗体与 AP标记的羊抗兔二抗杂交显色在膜上出现条
图 7 ELISA检测多克隆抗体效价
Fig. 7 Polyclonal anibody titer by ELISA
图 8 ELISA检测纯化后的多克隆抗体效价
Fig. 8 Purified polyclonal anibody titer by ELISA
带，条带位置与目的蛋白大小相符。而没有诱导的菌体没出
现条带，说明制备的抗体识别融合蛋白。
图 9 融合蛋白的 Western blotting检测结果
1. 纯化后的 FKBP12 融合蛋白;2. 未经诱导的 FKBP12 融合蛋白;3.
不含融合蛋白的凝胶为抗原，免疫后兔抗血清孵育。
Fig. 9 Western blotting assay
1. Purified FKBP12 fusion protein;2. Unpurified FKBP12 fusion protein;
3. Negative control(gel without protien).
3 讨论
在水稻、玉米、蚕豆、拟南芥、番茄上已陆续找到了 FK-
BP12 基因，但是关于其在植物体内具体功能的研究还很少。
一些研究表明植物的 FKBP12 具有两个相对独立的功能:一个
是肽基 － 脯氨酰顺反异构酶活性，其可以被免疫抑制剂
FK506 和纳巴霉素所抑制;另一个是分子伴侣功能，能够参与
73
生 物 技 术 2012 年 22(3)
蛋白质的折叠，这种功能不受免疫抑制剂的影响。Luan［7］等
在植物保卫细胞中所做的实验结果表明 FK506 必须在 FK-
BP12 存在的情况下，才能阻断保卫细胞中钙信号的传递。
Qiang Xu［8］等发现，植物 FKBP12 基因序列与动物、菌类中的
序列相似，但在免疫抑制剂存在的条件下，并不能发挥免疫抑
制的作用，还发现高等植物 FKBP12 具有氧化还原的调控作
用，这一点和酵母、人类的 FKBP12 并不相同。
在植物中，FKBP12 在细胞中参与的信号转导还可能与诸
多环境因子有关，如光、胁迫因子、病毒侵害等。在受到逆境
胁迫的情况下，FKBP12 基因可以起到调控作用。Esther［9］等
研究表明水稻中的 3 种 FKBPs(rFKBP64、rFKBP65 、rFKBP75)
都包含有三个类似 FKBP12 的结构和一个 TPR区域。在植物
中研究最多的是拟南芥 FKBPs，据研究表明拟南芥中的 FKBPs
有些是受外界伤害、NaCl、丙二醛等诱导表达的［10］。早期研究
结果［11］表明，当斑茅受到干旱胁迫的时候，FKBPs 被明显激
活，实时荧光定量 PCR结果表明，FKBP12 基因明显参与了植
物的抗旱调节。
近年来在植物中关于 FKBP12 的研究较少，但在动物和人
类中的研究较多［12 － 14］。FKBP12 基因在植物特别是裸子植物
中的定位尚不清楚，有待进一步研究，青杄作为典型的裸子植
物，在我国分布较广，适应力强，同时具有较强的观赏性价值，
是北方地区防护林和林木生产的优良树种，此后可以利用本
实验制得的 FKBP12 多克隆抗体，进行间接免疫荧光实验和
Western blotting实验，研究 FKBP12 基因在青杄组织中的准确
定位，为其功能的进一步研究提供理论依据，有望改良植物特
性。
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10844 － 10850.
黑曲霉外源表达系统对 Dactylellina cionopaga基因 PrDⅠ的表达
于寒颖1，薛伟2，段俊欣3
(1. 东北石油大学石油工程学院，黑龙江 大庆 163318;2. 中国科学院微生物研究所真菌地衣系统学重点实验室，北京 100101;
3. 诺维信(中国)投资有限公司，北京 100085)
摘要:目的:Dactylellina cionopaga是产生黏性分枝的捕食线虫真菌，进行其基因外源表达是鉴定该菌侵染相关因子的途径之
一。方法:该文构建了含有组氨酸标签的黑曲霉表达载体 pGT21M － HIS，对 D. cionopaga中与侵染机制相关的丝氨酸蛋白酶基因
PrDⅠ进行了外源表达。结果:RT － PCR鉴定结果显示，PrDⅠ在黑曲霉 201 中获得了转录。SDS － PAGE和酶活分析结果表明，
经亲和层析纯化的重组蛋白分子量约为 45kDa，在 pH 5. 0 的条件下具有蛋白水解活性。纯酶液的蛋白浓度为 30μg /ml。结论:
构建的带有组氨酸标签的表达载体 pGT21M － HIS能够用于基因在黑曲霉表达系统中的外源表达，并为目的蛋白的纯化和鉴定
提供了极大便利。黑曲霉外源表达系统在表达丝状真菌基因方面相对其他表达系统具有优势。
关键词:食线虫真菌;Dactylellina cionopaga;丝氨酸蛋白酶;外源表达;黑曲霉;表达载体
中图分类号:Q933 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1004 － 311X． 2012． 03． 63
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