全 文 ：　 第 40卷　第 4期 　
2010年 4月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICA L OF OCEAN UNIVERS ITY OF CHINA
40(4):047～ 052
Apr., 2010
条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及
多克隆抗体制备＊
邵 　林1 , 茅云翔1＊＊ , 阎斌伦2 , 孔凡娜1 , 王 　健1
(1.中国海洋大学海洋生命学院 , 山东青岛 266003;2.淮海工学院江苏省海洋生物技术重点建设实验室 , 江苏 连云港 222005)
摘　要:　研究紫菜抗逆的分子机制 , 将本实验室克隆的条斑紫菜(Porphy ra yezoensis Ueda)锰超氧化物歧化酶(manga-
nese supe rox ide dismutase ,Mn SOD)基因全长 cDNA 克隆到质粒 pET-30c(+)中 , 构建原核表达载体 pE T-S , 转化大肠杆
菌 BL21(DE3)表达 M n SOD ,表达产物的分子量约为 30 KDa。利用不同浓度的 Mn2+诱导重组 Mn SOD的表达 ,可以检
测到比活力随 Mn2+浓度增高而上升的趋势。用重组 Mn SOD 免疫新西兰大白兔 ,制备了多克隆抗体 ,多克隆抗体的效价
为 1∶8 000。免疫印迹实验(Western Blo t)表明该多克隆抗体具有很好的特异性。
关键词:　条斑紫菜;锰超氧化物歧化酶(M n SOD);原核表达;酶活性;多克隆抗体
中图法分类号:　Q942;Q949.29+2.1　　　　　文献标志码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2010)04-047-06
　　植物细胞在正常生理代谢过程中和处于逆境胁迫
下 ,都可以产生活性氧(React ive O 2 Species , ROS),包
括超氧根阴离子(·O -2 )、过氧化氢(H 2O 2)、羟基自由
基(·OH)等。活性氧对细胞的毒性表现在脂类的过
氧化 ,DNA 和蛋白质的变性等 ,进而损伤机体的代谢
作用和正常生理功能 。在长期的进化过程中 ,植物体
形成了抵抗活性氧的保护系统 ,包括限制活性氧的产
生和活性氧的消除[ 1-2] 。在抗氧化系统中 ,超氧化物歧
化酶(Superoxide dismutase;SOD;EC1.15.1.1)保护
细胞和组织免受氧化胁迫引起的破坏作用。在 ·O -2
与 H 2O 2形成 ·OH(已知活性氧中毒性最强的 1种)
之前 ,SOD将 ·O -2 和水分子(H 2O)催化变成H 2O 2 和
氧气 O2 [ 3] 。SOD 催化产生的 H2O2 再由过氧化物酶
(POD)[ 4] 和过氧化氢酶(CAT)[ 5] 进一步催化。
根据结合的金属离子的不同 ,SOD可以分为铜锌
超氧化物歧化酶(Cu/Zn SOD)、铁超氧化物歧化酶(Fe
SOD)、锰超氧化物歧化酶(Mn SOD)和镍超氧化物歧
化酶(Ni SOD)。Cu/Zn SOD 与 Fe SOD和 Mn SOD
比较 ,具有不同的一级结构和高级结构 ,因而被认为是
独立起源的类型[ 6-7] 。目前发现的 Cu/Zn SOD广泛存
在于高等植物的质体和游离在胞质或细胞间隙中;在
原核生物中 ,Cu/Zn SOD多存在于细胞周质中。在真
核藻类中 ,Cu/Zn SOD 的报道较少[ 8] 。根据氨基酸序
列的比较 ,Fe SOD和 Mn SOD的氨基酸序列相似性接
近 50%,因而被认为具有相同的进化起源[ 7 , 9] 。Fe
SOD和 Mn SOD最重要的区别在于细胞定位 ,Fe SOD
一般存在于质体和胞质中[ 9-10] ,而 Mn SOD一般存在
于线粒体中[ 11] 。与上述 3种 SOD 的蛋白质结构完全
不同 ,Ni SOD首次报道于链霉菌 S treptomyce s中[ 12] 。
条斑紫菜(Por phy ra yezoensis Ueda)属于红藻门
(Rhodophy ta)、原红藻纲(Pro tof lo rideophyceae)、红毛
菜目(Bangiales)、红毛菜科(Bangiaceae)、紫菜属(Por-
phyra),主要分布于中国 、日本和朝鲜半岛 ,由于其营
养丰富 ,口味鲜美 ,产品价值高 ,已成为目前最具经济
价值的栽培海藻之一 ,且又是潮间带藻类的代表性模
式物种。条斑紫菜的生活史为异型世代交替类型 ,由
大型的单倍体的叶状体阶段和微型的二倍体的丝状体
阶段组成[ 13] 。条斑紫菜叶状体生长在潮间带的岩石
上 ,随涨潮和落潮经受着失水与复水等逆境因子胁迫 ,
具有特殊而典型的抗逆机制。目前 ,有关紫菜属物种
的抗逆机制及抗氧化机制的研究尚未见报道。
在红藻门中 , 对于 SOD 的研究 , 有紫球藻属的
Porphy ridium cruentum 的 MnSOD 的纯化和性质研
究[ 14] ,有可见光对江篱属中的 Graci laria tenui frons
的 SOD活性的影响的研究[ 15] ,以及本实验室克隆的条
斑紫菜 Mn SOD cDNA 和基因组序列全长[ 16] 。为了
深入研究条斑紫菜抗逆性的分子基础 ,了解其抗逆机
制 ,本研究利用条斑紫菜 Mn SOD cDNA 构建重组质
粒进行原核表达 ,获得了重组 Mn SOD ,并制备了多克
隆抗体 ,为深入分析其细胞定位 、表达调控以及 Mn
SOD与条斑紫菜抗逆的相关性研究奠定基础 。
＊
＊＊
基金项目:国家高技术研究发展计划项目(2006AA10A402 , 2006AA10A413);国家自然科学基金项目(30972247)教育部新世纪人才支持计划
(NCET-06-0596);教育部科学技术研究重点项目(107070);江苏省海洋生物技术重点建设实验室开放课题资助
收稿日期:2008-05-07;修订日期:2008-06-02
作者简介:邵　林(1982-),男,硕士生。 E-mail:sou lshao@yah oo.com .cn
通讯作者:E-mail:yxmao@ouc.edu.cn
中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
1　材料与方法
1.1 材料
条斑紫菜孢子体(丝状体)由江苏省海洋水产研究
所国家紫菜种质库提供 ,培养条件为:光照强度 30.5 ～
33.5 μmol/L · m-2 ·S-1 ,光照周期 12L ∶12D ,培养
温度(18±1)℃。培养基为 PES 培养基 ,每 3天更换
75%。新鲜的条斑紫菜配子体(叶状体)采自青岛市八
大关风景区 ,清洗干净 ,晾干后保存于液氮中 。
PCR所用试剂 、DNA 凝胶回收 、连接所用试剂盒
和载体 pMD-18T 均购自大连宝生物(TaKaRa)生物技
术有限公司。E.col i DH5α为实验室保藏菌株;原核
表达载体 pET-30c(+)、宿主菌 E.col i BL21(DE3)和
T7通用引物购自 Novagen 公司。新西兰大白兔购自
山东省青岛市药品检验所动物中心 。预染蛋白质
Marker Ⅲ(蓝色)购自北京天根生物技术有限公司。
Weste rn Blo t Ki t购自武汉博士德生物技术公司。 LB
培养基所用酵母提取物和胰蛋白胨购自 O xoid 公司;
其它药品均为进口分装或国产分析纯。序列测定和引
物合成委托上海英骏生物技术有限公司完成 ,测序引
物为 M13通用引物 ,使用 ABI3730型自动测序仪。
1.2 表达载体构建策略
根据本实验室已克隆的条斑紫菜 Mn SOD cDNA
序列(GenBank登录号:DQ146477),在读码框的两端
设计 1 对引物:引物 1 为 5′-TCACCA TGGCGT TT-
GCTCTGCCCCCCCTG-3′(含 Nco I 位点),引物 2 为
5′-CCCTCGAGCACCAGCGGCGTGTCAAAGGC-3′
(含 Xho I 位点)。PCR的反应参数为:94 ℃预变性
5 min ,94 ℃变性 1 min , 60 ℃复性 1 min , 72 ℃延伸
1 min ,共进行 35 个循环 ,最后于 72 ℃延伸 5 min。
PCR反应结束后 ,1%的琼脂糖凝胶电泳检测产物。将
目的条带切胶回收 ,并与载体 pMD-18T 连接 。
测序后的阳性克隆 ,按照上述参数进行 PCR扩增
并切胶回收 ,将产物和表达载体 pET-30c(+)经限制
性内切酶 Nco I和 Xho I双酶切 、连接 、转化 ,相关操作
均按照分子克隆常规操作进行[ 17] 。
1.3 重组蛋白的表达
转化子 pET-S在 50 mL LB培养基(含卡那霉素
30 μg/mL)中 37 ℃、220 r/min培养至 OD600到 0.6 ～
0.8之间 ,加入0.8 mmol/ L IPTG 诱导 ,继续培养3 h 。
4 000 r/min离心10 min收集菌体沉淀 ,加入50 mmol/ L
磷酸缓冲液(PBS ,pH =7.4)重悬菌体沉淀 ,超声破碎菌
体(300 W ,工作 5 s ,间歇 10 s ,共 5 min), 12 000 r/min
离心 10 min。上清和沉淀分别保存备用。
1.4 SDS-PAGE与 SOD活性检测
本实验室培养的条斑紫菜孢子体(丝状体)和配子
体(叶状体)吸干表面水分 ,各取 0.1 g ,分别用液氮研
磨至粉末 , 各加入预冷的 50 mmol/L 磷酸缓冲液
(PBS ,pH=7.4)后 ,于 4 ℃、12 000 r/min离心10 min ,
弃沉淀 ,上清置于 4 ℃短期备用。
SDS-PAG E的参数:浓缩胶浓度为 5%,分离胶浓
度为 12%,配置方法按分子克隆常规操作进行[ 22] 。蛋
白含量测定方法参照 Low ry 等进行[ 23] 。SOD活性检
测参照 McCo rd和 Fridovich的方法进行[ 24] 。
1.5 多克隆抗体的制备与效价检测
多克隆抗体的制备按照 Sally Ann Amero 等[ 25] 的
方法进行 。共使用 3 只新西兰兔 , 1只作为空白对照
组 ,另 2只作为样品组 。第一次注射使用完全弗氏佐
剂 ,注射的蛋白量为 100 μg ,采取耳缘和背部静脉注
射;后 3 次注射使用不完全弗氏佐剂 ,分别间隔 7 d 。
第 4次免疫后第 7 d ,采取颈总动脉放血 ,血液在无菌
容器内置室温下 2 h ,然后置 4 ℃冰箱中过夜 ,次日于
4 ℃、2 000 r/min 离心 10 min ,去掉红细胞 ,上层血清
分装于灭菌小瓶内 ,置-20 ℃备用 ,分别为空白血清
和样品血清。
多克隆抗体采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)
的方法检测制备的多克隆抗体(一抗)的效价 ,抗原为
重组 PyM n SOD ,二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗
兔 IgG ,显色底物为邻苯二胺(OPD)。设定空白血清
为阴性对照 ,样品血清为待测样品 ,分别按1∶1 000 ,
1∶2 000 ,1∶4 000 , 1∶8 000 ,1∶16 000 和 1∶32 000
稀释 ,测定 492 nm 处的光吸收值(OD值)。根据同一
稀释度样品血清与空白血清的 OD492的比值确定最佳
稀释度 ,比值 >2.1 即为阳性 , >2.1<1.5 即为假阳
性 , <1.5即为阴性。
1.6 Western Blot
抗原使用条斑紫菜孢子体(丝状体)粗酶液和条斑
紫菜配子体(叶状体)粗酶液 ,变性蛋白上样 5 μg ,一抗
为制备的兔血清 ,二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记
的羊抗兔 IgG ,显色底物为 DAB 。实验操作流程按照
Western Blot Kit说明书进行 。
2　结果
2.1 条斑紫菜 MnSOD的氨基酸序列分析
在王荣等[ 16] 对条斑紫菜 Mn SOD 的氨基酸序列
分析的基础上 ,根据 Parker和 Blake[ 21] 的统计数据 ,在
预测的 Mn SOD 的氨基酸序列中找到了对应的 Mn
SOD特征氨基酸残基 ,确定这种SOD属于 Mn型 SOD
(见图 1)。
48
4期 邵　林 ,等:条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备
(阴影部分的 79-G , 80G , 82-W , 87-F , 154-Q 和 155-D表示 M n SOD 的特征氨基酸残基.)
图 1　条斑紫菜 Mn SOD氨基酸序列分析
F ig.1　Analy sis about Amino acid sequence o f PyMn SOD
2.2 条斑紫菜 Mn SOD 重组子 pET-S 的 PCR鉴定与
测序
Mn SOD重组子 pET-S构建策略如图 2所示。用
特异性引物和 T7通用引物检测重组子 pET-S 鉴定结
果见图 3。由图 3可见重组子 pET-S经特异性引物扩
增片段大小约为 670 bp 左右 ,经 T7通用引物扩增片
段大小约为 1 kb 。经上海英骏生物技术有限公司测序
鉴定 ,重组子 pET-S的外源插入片段正确 ,并且表达框
架准确。
( 表示Mn SOD插入片段 Indicated the insertion DNA fragment of Mn SOD.)
图 2　Mn SOD重组子 pET-S 的结构图
Fig.2　Pla smid construction map of Mn SOD
recombinant pET-S
2.3 重组融合蛋白 Mn SOD的诱导表达
重组子 pET-S 转化 E.coli BL21(DE3)后 , 用
IPTG 诱导融合蛋白表达 ,SDS-PAGE 结果表明 ,在未
经诱导条件下不表达 ,在诱导条件下高效表达 ,其相对
分子量为 30 KDa 左右 ,与预期大小相符(见图 4)。
2.4 M n2+对重组融合蛋白 Mn SOD比活力的影响以
及孢子体 Mn SOD和配子体 Mn SOD的活性比较
测定 E.coli BL21(DE3)粗酶液(对照组)、诱导的
pET-S/ BL21(DE3)粗酶液(实验组)、条斑紫菜孢子体
粗酶液和条斑紫菜配子体粗酶液中的蛋白含量和 SOD
活力单位 ,设定 3 个平行样 ,并重复 1次 ,计算出比活
力(见图 5)。结果表明 ,在菌体经超声破碎和离心后的
菌体上清中 ,对照组 SOD 的比活力不随 Mn2+的浓度
的升高而变化 ,重组 Mn SOD 的比活力是对照组的
2.04倍 ,并随着培养基中添加 Mn2+的浓度的升高(分
别为300 、600和900μmo l/L)而升高;条斑紫菜配子体
Mn SOD比活力(826.2±39)U/mg是条斑紫菜孢子
体 Mn SOD比活力(308.1±3.1)U/mg 的 2.68倍。
(M:DNA 分子量标准 , 1.特异性引物扩增片段 , 2.T7通用引物扩
增片段 M:DNA Marker , 1.Amplicon generated wi th specif ic prim-
ers , 2.Am plicon generated wi th T7 universal prim ers.)
图 3　Mn SOD重组子 pET-S 的 PCR鉴定结果
Fig.3　PCR amplication result of Mn SOD recombinant pET-S
(M:蛋白质分子量标准 , 1.E.col i BL21(DE3), 2.诱导的 pET-S/
BL21(DE3), 3.未诱导的 pET-S/ BL21(DE3)M:Protein Marker ,
1.SDS-PAGE of E.col i BL21(DE3);2.SDS-PAGE of pE T-S/ BL21
(DE3), induced;3.SDS-PAGE of pET-S/ BL21(DE3), non-induced.)
图 4　重组融合蛋白 Mn SOD 的诱导表达
Fig.4　I nduced expression of recombinant M n SOD
49
中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
左侧(Lef t)为 E.coli BL21(DE3), 右侧(Right)为 pET-S/ BL21(DE3).)
图 5　不同 Mn2+浓度下 SOD 比活力(U/ mg)比较
Fig.5　Com parison of SOD specific activity(U/ mg)unde r
different concentration o f Mn2+
图 6　条斑紫菜不同世代 SOD比活力比较
F ig.6　Compa rison of SOD specific activity be tw een
sporophy te and game tophy te
2.5 多克隆抗体的效价检测
将空白血清做为阴性对照 ,以横坐标为稀释度 ,纵
坐标为 OD492值 ,绘制曲线如图 7 。由此可以算出 ,在
1∶16 000的稀释度时 ,比值大于 2.1 ,则抗体效价为阳
性稀释度的一半 ,为 1∶8 000。
图 7　间接 ELISA 检测抗体效价曲线图
Fig.7　Graph o f po ly clonal antibody assay by indirect ELISA
2.6 重组融合蛋白 Mn SOD的免疫印迹分析(Western
Blot)
结果表明 , Mn SOD 单亚 基的分子 量约为
24 KDa ,与王荣等[ 16]预测的分子量大小相符 ,并且在 2
个世代中没有分子量上的差异;表达蛋白的分子量为
30 KDa ,比 2种世代 Mn SOD单亚基的分子量24 KDa
大 ,因为表达的蛋白是融合蛋白 , N 端有 His · Tag ,
thrombin ,S ·Tag 等标签;在孢子体(丝状体)和配子
体(叶状体)中 2个样品中都只有 1条清晰的条带 ,说
明多克隆抗体特异性好 ,灵敏度高 ,见图 8。
(M :预染Protein M arker , 1.条斑紫菜配子体粗酶液 , 2.条斑紫菜
孢子体粗酶液 M , Prestained Protein Marker , 1.Th e impuif ied en-
zy me of P.yezoensis gametophy te , 2.T he impuif ied enzy me of
P.yezoensis sp oroph yte.)
图 8　Mn SOD的免疫印迹分析
Fig.8　Weste rn blot o f Mn SOD
3　讨论
3.1 PyM n SOD可利用原核表达载体实现高效表达
本研究利用条斑紫菜 Mn SOD 的 cDNA 片段构
建原核表达载体 pET-S ,转化 E.col i BL21(DE3)后 ,
经 IPTG诱导后获得重组融合 Mn SOD ,占菌体总蛋
白的 60.29%。作者以前报道的 mnsod密码子第三位
碱基的 GC含量高达 84.9%[ 21] ,体现出了密码子的偏
爱性 ,而本实验的结果表明 , 原核表达载体 pET-30c
(+)、宿主菌 E.coli BL21(DE3)和诱导物 IPTG 组成
的原核表达体系适合 Mn SOD的高效表达 。
3.2 M n2+能够诱导提高重组 Mn SOD的活性
酶活力测定结果表明重组融合 Mn SOD的活性受
到其结合金属离子 Mn2+的诱导 ,这与氨基酸序列分析
中列出的 Mn SOD应具备的特征氨基酸分析结果相
符 ,充分说明此 cDNA 片段编码的是 Mn型 SOD 。有
研究表明 ,Mn2+在翻译后水平上调控 SOD的蛋白质
折叠并在其催化活性中发挥关键的激发作用[ 22] 。本研
究中 ,随着 Mn2+浓度的提高 ,重组融合 Mn SOD 的比
50
4期 邵　林 ,等:条斑紫菜锰超氧化物歧化酶原核表达及多克隆抗体制备
活力呈现增强趋势(比活力最终提高了 64.76%),说明
Mn2+是提高 SOD活性的重要因素 。
3.3 配子体Mn SOD和孢子体 Mn SOD分别表现出对
环境的适应
条斑紫菜配子体 Mn SOD的比活力是孢子体 Mn
SOD的 2.68倍 ,这与配子体自身的生理状态和所处环
境有密切联系。研究表明 ,随着植物细胞内水分的不
断流失 ,光合速率降低 ,细胞启动自身的光保护机制 ,
在氧气的光还原过程和电子传递过程中 ,产生了大量
的超氧根阴离子(·O -2 ),引起了脂类的过氧化反应和
蛋白质变性 。在非致命的失水过程中 ,SOD 、谷胱甘肽
还原酶(GR)与单脱氢抗坏血酸还原酶(MDR)的活性
升高[ 1] 。条斑紫菜的叶状配子体生长在潮间带的岩石
上 ,经受涨潮与落潮的失水与复水的逆境胁迫 ,表现出
比丝状配子体 Mn SOD比活力高的特性 。
3.4 凝胶回收目的蛋白制备多克隆抗体获得良好的特
异性结果
目前 ,在多克隆抗体制备过程中 ,主要使用的抗原
是纯化的蛋白。为了获得高纯度且足够量的抗原 ,必
须提高纯化效率 ,优化纯化条件 。在本实验中 ,由于表
达目的蛋白大量形成包涵体而给纯化带来了困难 ,文
中只获得了少量的变性的重组蛋白 ,也为下一步多克
隆抗体的制备带来不便。于是本文实验中利用凝胶中
直接回收目的蛋白免疫新西兰大白兔的方法制备的多
克隆抗体 ,经过间接酶联免疫吸附试验(ELISA)测定
效价为 1∶8 000 。该方法适用于目的蛋白不易获得或
者含量低的情况 ,并且聚丙烯酰胺有助于增强免疫应
答作用[ 23] 。
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SHAO Lin1 , MAO Yun-Xiang 1 , YAN Bin-Lun2 , KONG Fan-Na1 , WANG Jian1
(1.College of Marine Life Science , Ocean Univer sity of China , Qingdao 266003 , China;2.Jiang su Key Labor atory of M arine
Bio technolog y , Huaihai Institute of Technology , Lianyungang 222005 , China)
Abstract:　A cDNA co rresponding to manganese superox ide dismutase(SOD;EC 1.15.1.1.)f rom Por-
phyra yezoensis Ueda w as overexpressed in the Escherichia coli BL21(DE3)using the expression vector
pET-30c(+)and the mo lecular weight o f the recombinant M nSOD is about 30 KDa.With the concentra-
tion o f M n
2+
increasing , the activity of the recombinant M nSOD is enhanced by inducement of M n2+.The
recombinant M n SOD was used to generate a polyclonal antibody in New Zealand white rabbi ts that recog-
nized Mn SOD and the value is 1∶8 000.The w estern blot show s the polyclonal antibody can be used ef-
fect ively.
Key words:　Porphy ra yezoensis Ueda;manganese supe roxide dismutase(Mn SOD);prokaryo tic expre s-
sion;enzymatic activity;po lyclonal antibody
责任编辑　于　卫
(上接 46页)
Studies on the Antihypertensive Activity of Squid(Dosidicus
eschrichitii Steenstrup)Skin Gelatin Hydrolysates
LIN Lin
1 , LI Ba-Fang2 , LV Shun1 , ZHAO Xue2 , ZHUANG Yong-Liang 2 , LU Jian-Feng 1
(1.Schoo l of Bio techno lo gy and Food Eng ineering , Hefei Univ ersity of Technolog y , Hefei 230009 , China;2.The Faculty of
Food Science and Technolog y , Ocean Univer sity of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　The aim o f this study w as to invest igate the A ngio tensinⅠ conve rting enzyme(ACE)inhibi to ry
activi ty and the antihype rtensive effects of squid(Dosidicus eschrichi ti i Steenst rup)skin gelatin hydroly-
sates.The gelatin hydroly sates w ere f ractionated by ult raf ilt ration.The ACE inhibi to ry activity of the
hydro ly sates w as assessed by the colo rimetric method.Renovascular hypertensive rats(RH R)models
were made w ith tw o-kidney one clip assay , and antihypertensive effects w ere studied in RHR treated wi th
gelatin hydroly sates for 30 day s by oral administrat ion.Ar terial blood pressure and plasma angiorensinⅡ
(AngⅡ)were measured respectively.The squid gelatin hydrolysates markedly inhibited the act ivity of
ACE in v it ro with IC50 of UC-2(0.71 mg/mL)and UF-2(0.79 mg/mL).The fraction of UF-2 remarkably
reduced the arterial blood pressure of RHR.Plasma A ng Ⅱo f RHR great ly decreased af ter treated wi th
the gelatin hydroly sates.The hydroly sates f rom squid skin gelatin show ed st rong antihyper tensive ef fects
in RHR.
Key words:　squid skin;gelatin hydro ly sates;ACE;antihypertension
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