全 文 ：中国水产科学 2015年 1月, 22(1): 158163
Journal of Fishery Sciences of China 研究简报
收稿日期: 2014-08-13; 修订日期: 2014-09-18.
基金项目: 广东省海洋渔业科技推广专项(A201001H04); 中央级公益性科研院所基本科研业务费(2010TS02, 2013YD05, 2014
A07XK01); 农业部东海海水健康养殖重点实验室(JNZS2013-08).
作者简介: 郭奕惠(1981−), 女, 助理研究员, 研究方向为藻类繁育与增养殖. E-mail: yihuiguoedith@163.com
通信作者: 喻达辉, 研究员, 研究方向为分子遗传育种. E-mail: pearlydh@163.com
DOI: 10.3724/SP.J.1118.2015.00343
基于 AFLP的海萝野生群体遗传多样性分析
郭奕惠, 范嗣刚, 陈素文, 喻达辉, 吴进锋, 陈利雄, 朱长波, 郭永坚
农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 中国水产科学研究院 南海水产种质资源与健康养殖重点实验室, 南海
水产研究所, 广东 广州 510300
摘要: 应用 AFLP分子标记技术对广东深圳、汕头和山东长岛的海萝(Gloiopeltis furcata)群体进行遗传多样性分析。
应用筛选出的 10对多态性丰富的 AFLP引物, 对这 3个地理群体的 90个个体进行扩增, 共得到 427个位点, 多态
性位点数为 392(91.75%), 各引物扩增位点数为 30~59。长岛群体扩增位点最多, 多态性也最高。群体内的等位基
因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、遗传多样性指数(H)和 Shannon信息指数(I)变化趋势一致, 均由高到低依次为长岛
群体、汕头群体、深圳群体, 表明长岛群体遗传多样性最高。3个海萝群体遗传变异主要来自群体间。群体间的基
因流为 0.368 9, 群体分化系数(Gst)为 0.575 4, 表明群体间有高度分化。深圳群体和汕头群体的遗传距离最小(0.110 2),
与长岛群体的遗传距离最大(0.357 7)。UPGMA聚类分析显示广东深圳和汕头群体聚为一支, 山东长岛群体为另一
支, 表明群体间的遗传差异与地理距离有关。本研究结果为海萝资源的保护与利用提供了基础数据。
关键词: AFLP; 海萝; 遗传多样性; 地理群体
中图分类号: S917 文献标志码: A 文章编号: 10058737(2015)01015806
海萝(Gloiopeltis furcata)在山东一带俗称“牛
毛”, 广东沿海俗称“赤菜”、“红菜”和“胶菜”, 隶
属于红藻门 (Rhodophyta), 内枝藻科 (Endoclad-
iaceae), 海萝属, 广泛应用于食品、药品和纺织工
业[1]。海萝清脆可口, 可制作成各式夏令清凉饮品;
海萝有许多抗氧化剂和抗菌剂成分, 可用于治疗
痢疾和结肠炎, 并有抗肿瘤功效; 海萝胶是印染上
浆的优良原料[2−5]。海萝的市场需求量很大, 其干品
价格高达 400 元/kg。在中国沿海地区, 获取海萝
主要依靠天然开采, 但已无法满足日益增长的市
场需求。近些年, 本课题组对海萝属藻类的人工繁
育和增养殖进行了一些研究, 为海萝的产业化、规
模化养殖奠定了一定基础[1, 6−7]。
AFLP(扩增片段长度多态性)是由 Vos 等[8]发
明的一项 DNA指纹技术。AFLP无需获得研究对
象的遗传背景, 对样本 DNA的用量少, 且具有稳
定性好、多态性丰富、重复性好等特点, 已被广泛用
于分析鱼、虾、贝和藻类等水产养殖物种的群体遗
传多样性研究[9−15]。目前尚未有海萝不同群体遗传多
样性的研究报道。本研究拟采用 AFLP技术对海萝 3
个不同地理群体的遗传多样性进行评价, 以期为海
萝资源的合理利用和保护提供参考资料。
1 材料与方法
1.1 实验材料
分别从深圳大亚湾(N22°32′52.51″, E114°34′1.69″)、
汕头南澳(N23°24′57.39″, E117°08′22.79″)和山东
长岛(N38°04′14.69″, E120°44′39.94″)随机采集 3
个海萝野生群体, 每个群体各采集 30 个个体, 样
本剪取后放入液氮中冷冻保存。
第 1期 郭奕惠等: 基于 AFLP的海萝野生群体遗传多样性分析 159
1.2 基因组 DNA提取
采用传统 CTAB 法提取海萝 DNA[16], 用 1%
琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测
DNA的完整性和浓度, –20℃低温保存备用。
1.3 AFLP分析
试验所用接头和引物由上海生工生物工程技
术服务有限公司合成, 其序列参照 Vos 等[8], 具体
见表 1。
表 1 AFLP 分析中用到的接头和引物序列
Tab.1 Adaptor and primer sequences used for AFLP analysis
编号
code
名称
name
序列(5–3)
sequence(5–3)
E-F EcorRI-F(adapter) CTCGTAGACTGCGTACC
E-R EcorRI-R(adapter) AATTGGTACGCAGTCTAC
M-F MseI-F(adapter) GACGATGAGTCCTGAG
M-R MseI-R(adapter) TACTCAGGACTCAT
E 预扩增引物 primer
for preamplification
GACTGCGTACCAATTC
M 预扩增引物 primer
for preamplification
GATGAGTCCTGAGTAA
E39 E+ATG (primer) GACTGCGTACCAATTCATG
E40 E+AGC (primer) GACTGCGTACCAATTCAGC
E41 E+AGG (prime) GACTGCGTACCAATTCAGG
E42 E+AGT (prime) GACTGCGTACCAATTCAGT
E47 E+CAA(prime) GACTGCGTACCAATTCCAA
M57 M+CGG (prime) GATGAGTCCTGAGTAACGG
M56 M+CGC (prime) GATGAGTCCTGAGTAACGC
M58 M+CGT (prime) GATGAGTCCTGAGTAACGT
M62 M+CTT (prime) GATGAGTCCTGAGTAACTT
(1) 用 EcoR /Ⅰ MseⅠ双酶切样品 DNA, 同时
进行连接。酶切与连接体系(20 μL)为: 10×AFLP
digest-ligation Buffer 2 μL, AFLP digest-ligation En-
zyme Mix 1.8 μL, EcoR I Adaptor 1 μL(10 μmol/L),
Mse I Adaptor 1 μL(10 μmol/L), 模板 DNA 5 μL,
补 ddH2O至 20 μL, 反应条件为 25 5℃ h, 1%琼脂
糖电泳检测。
(2) 用引物E和M预扩增, 反应体系为2× PCR
Mix 10 μL, 1 μL E(20 μmol/L), 1 μL M(20 μmol/L),
酶切-连接模板 DNA 4 μL, 加 ddH2O至 20 μL。
PCR扩增程序为: 94℃预变性 3 min; 94℃变性 30 s,
50℃复性 30 s, 72℃延伸 1 min; 30个循环。
(3) 选择性扩增反应体系: 2× PCR Mix 10 μL,
Eprimer 1 μL(20 μmol/L), Mprimer 1 μL(20 μmol/L),
模板 DNA 5 μL (预扩产物稀释 20倍); 加 ddH2O
至 20 μL。PCR 扩增程序为: 95℃预变性 5 min;
95℃变性 35 s, 65℃复性 35 s(每循环降低 0.7 )℃ ,
72℃延伸 1 min, 12个循环; 94℃变性 30 s, 56℃复
性 30 s, 72℃延伸 1 min, 23个循环。
(4) 选扩产物变性后以 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离, 先在 90 W恒功率条件下预电泳 30 min, 随后
点样 7.5 μL, 90 W恒功率电泳 1.5 h。参照 Sambrook
等[17]的方法进行银染检测, 扫描仪记录凝胶图谱。
1.4 数据统计分析
选取 AFLP 扩增图谱清晰、重复性高且分子
量在 100~700 bp 范围内的扩增条带进行统计分
析。相同迁移位置上有电泳条带的个体记为“1”,
无条带的记为 “0”, 建立数据矩阵。采用软件
POPGENE1.32[18]计算各群体多态位点比率(P)、
观测等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、Nei’s
基因多样性指数(H)、Shannon’s 信息指数(I)、3
个群体的总遗传多样性(Ht)、群体间的遗传多样性
(Dst)、基因流(Nm)、群体分化系数(Gst)以及群体间
的相对遗传距离(D)和遗传相似性系数(F)。用类
平均聚类法(UPGMA)构建系统聚类图。
2 结果与分析
2.1 AFLP结果分析
从 30 对引物组合中筛选出 10 对条带丰富且
多态性比较高的引物组合 E40/M57、E40/M58、
E48/M56、E39/M56、E39/M57、E41/M56、E39/
M62、E40/M62、E41/M57、E47/M56用于 3个海
萝群体的遗传多样性研究(表 3)。在片段长 100~
700 之间, 共得到 427 个位点, 平均每组引物为
42.7 个位点 , 每组引物组合扩增的条带数从
30~59 不等, 其中 E39/M56 引物扩增的条带数最
多, 为 59 条, 平均多态性为 91.75%, 引物 E39/
M62扩增的多态比例最高, 为 100%。
2.2 群体遗传多样性分析
3 个海萝地理群体的遗传多样性等参数如表 3
所示。深圳群体、汕头群体和长岛群体的多态性
位点比例依次为 42.62%、43.79%和 54.80%, 长岛
160 中国水产科学 第 22卷
表 2 AFLP 引物组合的检测结果
Tab.2 The results of amplification by AFLP primer combinations
引物组合
primer pair
总条带数
total of
bands
多态性条带
数
polymorphic
bands
多态带百分数
percentage of poly-
morphic bands
E40/M57 46 40 86.96
E40/M58 32 30 93.75
E48/M56 44 40 90.91
E39/M56 59 55 93.22
E39/M57 30 28 93.33
E41/M56 36 32 88.89
E39/M62 45 45 100
E40/M62 44 43 97.72
E41/M57 40 33 82.50
E47/M56 51 46 90.20
平均 mean 42.7 39.2 91.75
总和 total 427 392
群体的多态位点高于其他两个群体。3 个海萝群
体的观测等位基因数为 1.426 2~1.548 0, 有效等
位基因数为 1.124 1~1.190 6, 遗传多样性指数为
0.082 8~0.123 4, Shannon 信息指数为 0.137 3~
0.199 4。Na、Ne、H 和 I 等 4 个参数的变化趋势
一致, 均由高到低依次为长岛群体、汕头群体、
深圳群体, 长岛群体的遗传多样性最高, 汕头群
体和深圳群体的遗传多样性比较接近。
2.3 遗传分化和遗传距离
3个海萝群体总的遗传多样性(Ht)为 0.232 2,
群体内的遗传多样性(Hs)为 0.098 6, 群体间的遗
传多样性(Dst)为 0.133 6, 表明海萝群体内的遗传
多样性小于群体间的, 群体间的基因流为 0.368 9。
群体分化系数(Gst)为 0.575 4。
表 3 海萝 3 个群体的遗传多样性
Tab.3 The genetic structure and genetic diversity for three Gloiopeltis furcata populations
群体
population
多态位点数
Pb
多态位点比例/
% Pp
观测等位基因
Na
有效等位基因
Ne
基因多样性指数
H
香农指数
I
深圳 Shenzhen 182 42.62 1.4262 1.1241 0.0828 0.1373
汕头 Shantou 187 43.79 1.4379 1.1365 0.0895 0.1470
长岛 Changdao 234 54.80 1.5480 1.1906 0.1234 0.1994
Note: Pb: number of polymorphic bands; Pp: percentage of polymorphic bands; Na: observed numbe of alleles; Ne: effetive number of alleles;
H: gene diversity index; I: Shannons Information index.
3 个海萝群体的遗传相似性和遗传距离结果
见表 4。各群体间的遗传距离为 0.110 2~0.357 7,
其中深圳群体和汕头群体的遗传距离最小 , 为
0.110 2, 遗传相似性最高, 为 0.895 6; 深圳群体
和长岛群体的遗传距离最大, 为 0.357 7, 遗传相
似性最低。
表 4 3 个海萝群体之间的遗传相似系数(对角线上方)和
遗传距离(对角线下方)
Tab.4 Genetic identities index(above diagonal) and genetic
distance(below diagonal) among three Gloiopeltis furcata
populations
群体
population
深圳
Shenzhen
汕头
Shantou
长岛
Changdao
深圳 Shenzhen — 0.8956 0.6993
汕头 Shantou 0.1102 — 0.7405
长岛 Changdao 0.3577 0.3004 —
2.4 聚类分析
用 UPGMA 构建 3 个海萝群体的系统聚类图
(图 1)。深圳群体和汕头群体聚在一起, 长岛群体
单列一支。
图 1 3个海萝群体的 UPGMA聚类图
SZ: 深圳群体, ST: 汕头群体, CD: 长岛群体.
Fig.1 The UPGMA dendrogram of the three populations of
Gloiopeltis furcate
SZ: Shenzhen population, ST: Shanntou population, CD:
Changdao population.
3 讨论
海萝广泛分布于中国沿海地区。吴进锋等[19]
曾对广东沿海海萝藻类生态和分布进行调查, 海
萝主要分布在粤东至珠江口西侧的川山群岛。遗
第 1期 郭奕惠等: 基于 AFLP的海萝野生群体遗传多样性分析 161
传多样性是评价物种资源状况的一个重要指标 ,
是物种适应多变的环境、维持长期生存和进化的
遗传基础。虽然海萝的经济价值很高, 但基因组
方面的研究非常落后。AFLP 技术不需知晓遗传
背景, 可以快速准确获得大量可重复位点。本研
究从 30 对 AFLP 引物中筛选出 10 对多态性高的
AFLP 引物, 首次对来自深圳大亚湾、汕头南澳平
屿岛和山东长岛的海萝群体进行遗传多样性分析。
Bonin 等[20]认为至少要 200 个 AFLP 位点才
能准确估计遗传多样性, 本研究扩增得到 427 个
位点, 因此能准确反映海萝的遗传多样性。在本
研究中, 多态位点有 392 个, 占 91.80%, 多态性
高, 在DNA水平上显示海萝的遗传多样性非常丰
富, 基于 AFLP分析条斑紫菜多态位点有 98.38%[14],
坛紫菜有 96.97%[21], 与本研究结果相似。说明
AFLP技术适用于海萝的群体遗传学分析。
Na、Ne、H 和 I 是反映群体内遗传多样性的
重要参数。种群中每个位点观测到的等位基因数
(Na)和有效等位基因数(Ne)越高, 说明种群的遗传
变异水平越高; 基因多样性指数(H)和 Shannon多
样性信息指数(I)越高, 表明种群的遗传多样性越
高。本研究得到 3 个海萝群体的观测等位基因数
为 1.426 2~1.548 0, 有效等位基因数为 1.124 1~
1.190 6, 遗传多样性指数为 0.082 8~0.123 4,
Shannon信息指数为 0.137 3~0.199 4。在其他红藻
中, 逄巧巧等[22]用 8对AFLP引物, 对 4个不同地
理群体 40 个个体的龙须菜样品进行遗传多样性
分析, 发现各群体 Ne 为 1.047 7~1.113 0, H 为
0.029 2~0.071 5, I为 0.045 7~0.115 1。孔凡娜等[23]
用 7 对 AFLP 引物对青岛石老人海域石花菜的遗
传结构进行了分析, 结果表明其 Na为 1.504 3, Ne
为 1.298 5, Shannon信息指数为 0.263 3。可见海
萝野生群体的遗传多样性比龙须菜野生群体高 ,
比石花菜群体低。
海萝长岛群体的 Na、Ne、H 和 I 均大于汕头
群体和深圳群体, 这表明长岛群体的遗传变异和
遗传多样性均高于汕头群体和深圳群体。汕头群
体和深圳群体各参数之间比较接近, 通过遗传相
似系数和遗传距离分析, 汕头群体和深圳群体的
遗传相似性高(0.895 6), 遗传距离小(0.110 2), 而
长岛群体与汕头或深圳群体的遗传距离均大于
0.3, 这可能与地理距离远近有关[24−25]。深圳大亚
湾和汕头南澳地理位置相近, 海萝产生的孢子能
随海水流动而迁移位置, 基因交流较多。山东长
岛与深圳/汕头相距很远, 孢子无法靠海水流动完
成迁移交流。在聚类分析中, 长岛海萝群体独成
一支, 深圳群体和汕头群体聚为一支, 也进一步
印证了上述结论。
3 个海萝群体内的遗传多样性比群体间的小,
说明遗传变异主要存在于群体之间。基因分化系
数 Gst用于分析种群间的遗传分化。本研究中, 海
萝的 Gst为 0.575 4, 为高度分化的种群。基因流
Nm<1, 群体高度分化, Nm>1 时, 存在一定的基因
流动[26], 本研究得到 Nm为 0.368 9, 进一步证实
海萝群体分化程度高。
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第 1期 郭奕惠等: 基于 AFLP的海萝野生群体遗传多样性分析 163
Analysis of genetic diversity in wild populations of Gloiopeltis furcata
based on amplified fragment length polymorphism methodology
GUO Yihui, FAN Sigang, CHEN Suwen, YU Dahui, WU Jinfeng, CHEN Lixiong, ZHU Changbo, GUO Yongjian
Key Laboratory of South China Sea Fishery Resources Exploitation & Utilization, Ministry of Agriculture; Key
Laboratory of Fisheries Genetic Resources and Aquaculture, South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese
Academy of Fisheries Sciences, Guangzhou 510300, China
Abstract: Gloiopeltis furcata is a perennial red alga (Rhodophyta) commonly used as a source of food, drugs, or textile
industry raw materials. Recently, G. furcata has been used for artificial breeding experiments and aquaculture research.
However, limited genetic information about this species has hindered progress in artificial culture of it. In this study, we
estimated genetic diversity in G. furcata using amplified fragment length polymorphism markers with three populations
of 90 individuals from Shenzhen, Shantou, and Changdao, China. Ten pairs of polymorphic primers were screened,
generating 427 loci, of which 392 (91.75 %) were polymorphic. Loci obtained from each pair of primers ranged from
30 to 59. The Changdao population possessed the highest number of amplified loci and the highest polymorphism level.
The observed number of alleles (Na), effective number of alleles (Ne), Nei′s gene diversity (H), and Shannon′s informa-
tion index (I) showed the same trend in the three populations (i.e., Changdao>Shantou>Shenzhen), suggesting that the
Changdao population had the highest genetic diversity. Major genetic variation existed among the populations. Nm was
0.368 9 and Gst was 0.575 4, indicating high genetic differentiation among the populations. The smallest genetic dis-
tance was found between the Shenzhen and Shantou populations (0.110 2), while the largest was between the Shenzhen
and Changdao populations (0.357 7). The Shenzhen and Shantou populations clustered together and then grouped with
the Changdao population, suggesting that the genetic divergence observed was related to geographical distance. Our
results could be beneficial to the conservation and use of G. furcata resources.
Key words: amplified fragment length polymorphism (AFLP); Gloiopeltis furcata; genetic diversity; geographical
populations
Corresponding author: YU Dahui. E-mail: pearlydh@163.com