全 文 ：　 第 40卷　第 10期 　
2010年 10月　
中 国 海 洋 大 学 学 报
PERIODICAL OF OCEAN UNIVERS ITY OF CHINA
40(10):075～ 078
Oct., 2010
青岛石老人海域石花菜遗传多样性分析＊
孔凡娜 , 茅云翔＊＊ , 高 　珍 , 王　莉 , 孙佩佩 , 石晓莎
(中国海洋大学海洋生命学院 , 海洋生物遗传学与基因资源利用教育部重点实验室 , 山东青岛 266003)
摘　要:　石花菜(Ge li dium amansii)是 1 种重要的大型经济海藻 , 本研究采用 AFLP 技术对青岛石老人海域石花菜的遗
传结构进行了分析 , 7 对引物组合共扩增出 346 个位点 ,多态性比例为 47.8%。不同个体间的遗传距离分布范围在 0.029
～ 0.390 之间。群体内 Na(观测等位基因数)为 1.504 3 , Ne(有效等位基因数)为 1.298 5 , Neis 基因多样性指数为 0.175 5 ,
Shannon 信息指数达到 0.263 3。 UPGMA聚类分析将 30 个个体分为 2个大的类群 ,在一定程度上反映了石老人海域石花菜
群体遗传多样性不高的现状。
关键词:　石花菜;AFLP;遗传多样性;种质资源
中图法分类号:　Q344+.4　　　　　文献标志码:　A　　　　　文章编号:　1672-5174(2010)10-075-04
　　石花菜(Gelidium amansi i)是 1种重要的大型经
济海藻 ,属于红藻门石花菜目 Gelidiales石花菜科 Ge-
lidiaceae石花菜属 Gelidium 。石花菜是制造琼胶的优
质原料 ,同时也是海参 、鲍鱼的优良饵料 ,自然海区生
长的石花菜 ,可构成鱼虾及各种海珍品良好的产卵场
和索饵场 。但是由于石花菜的人工养殖尚未形成规
模 ,目前我国的石花菜产量主要靠采集野生资源 ,过度
采集使得野生资源量逐年衰退 ,而世界范围对琼胶及
其原料的需求却与日增加 ,供需矛盾突出 ,导致了目前
石花菜资源的紧缺 ,石花菜已被列为国际紧俏原料 。
种质资源面临严重的问题 ,使得对石花菜遗传结
构的了解受到了极大限制 ,同时目前对石花菜种群的
空间分布和遗传结构也所知甚少 ,因此对遗传结构的
研究是探讨生物适应意义 、物种形成过程及其进化机
制的基础 ,也是保护生物学的核心。分子标记技术为
研究个体的遗传特性 、种群遗传结构 、不同种群多样性
和亲缘关系 ,进而评价种质资源提供了有利的工具。
本研究采用 AFLP 技术对青岛石老人海域石花菜的遗
传结构进行了分析 ,为制定石花菜资源的保护策略提
供一定的理论依据。
1　材料和方法
1.1 材料及来源
30株野生石花菜孢子体采自青岛石老人海域 ,洗
净后液氮冷冻置于-80 ℃保存。
1.2 DNA 的提取
DNA 的提取采用 TIANGEN 公司植物基因组提
取试剂盒并略作改动。DNA 经紫外分光光度计定量
后于-20 ℃保存备用 。
1.3 AFLP分析
AFLP 反应基本按 Vos等[ 1]发表的方法进行并稍
加改进 ,对反应程序进行了优化。400 ng 基因组 DNA
经 EcoR I 和Mse I在 37 ℃双酶切 6 h ,酶切产物与接
头于 16 ℃连接 12 h ,预扩增采用 EcoR I+N/Mse I+
C引物组合 ,扩增23个循环 ,选择性扩增采用 EcoR I+
NNN/Mse I+CNN 引物组合 ,扩增 26个循环。内切酶
EcoR I(No.R0101)、Mse I(No.R0525)和 T4连接酶
(No.M0202)均购自 NEB(New England Biolab , USA)。
1.4 数据分析
6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物 ,银染
显色 ,获得 AFLP 图谱 。将相同迁移位置上的条带视
为一个遗传位点 ,有带记为 1 ,无带记为 0 ,获得 0-1矩
阵。采用 POPGENE软件计算群体内任意两个体间的
遗传距离和遗传相似性 ,采用 MEGA 软件构建 UPG-
MA 聚类图。
2　结果
2.1 扩增结果
实验用了 16对引物组合 ,经过筛选其中 7对组合
(M-CAT /E-AG , M-CAA/E-AT , M-CAC/E-AG , M-
CAT/E-AA , M-CAG/E-AC , M-CAA/E-AG , M-CAC/E-
AC)能扩增出清晰的带型(见图 1),共分析了 346个位
点 ,其中 166个位点在 30个个体中存在多态 ,多态性比
例为 47.8%。平均每个引物组合检测 49.7个位点 。
＊
＊＊
基金项目:青岛市科技计划项目(07-2-3-5-jch))资助。
收稿日期:2009-11-11;修订日期:2009-12-22
作者简介:孔凡娜(1978-),女 ,博士 ,讲师。
通讯作者:E-mail:yxmao@ouc.edu.cn
中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
图 1　应用 M-CAC/ E-AG 引物组合对青岛石老人海域
石花菜 30 个个体的 AFLP 分析
Fig.1　AFLP analy sis of 30 individuals o f G.amanaii
fr om the Shilao ren sea ar ea in Qingdao using
primer-pairs M-CAC/ E-AG
2.2 AFLP分析
利用 POPGENE软件构建居群内个体间遗传距离矩
阵 ,由表1可见 ,不同个体间的遗传距离分布范围在0.029～
0.390之间。其中 ,29号和30号个体间的遗传距离最小 ,为
0.029;6号和10号个体间的遗传距离最大 ,为 0.39。
图 2　30 个个体的 UPGMA 聚类图
F ig.2　The UPGM A dendrog ram of 30 individuals
表 1　群体内 30 个个体间的遗传距离
Table 1　Genetic distance s between 30 individuals in the popula tion
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
[ 1]
[ 2] 0.281
[ 3] 0.173 0.142
[ 4] 0.186 0.218 0.142
[ 5] 0.176 0.159 0.132 0.139
[ 6] 0.173 0.340 0.204 0.292 0.251
[ 7] 0.176 0.273 0.166 0.251 0.197 0.100
[ 8] 0.183 0.266 0.126 0.214 0.247 0.145 0.078
[ 9] 0.233 0.179 0.193 0.200 0.197 0.312 0.204 0.162
[ 10] 0.243 0.129 0.225 0.211 0.193 0.390 0.304 0.296 0.145
[ 11] 0.176 0.251 0.139 0.166 0.190 0.186 0.176 0.149 0.197 0.222
[ 12] 0.173 0.218 0.169 0.211 0.200 0.285 0.236 0.236 0.166 0.116 0.159
[ 13] 0.243 0.292 0.233 0.156 0.222 0.292 0.289 0.289 0.266 0.247 0.166 0.136
[ 14] 0.233 0.328 0.214 0.179 0.247 0.207 0.233 0.211 0.218 0.304 0.129 0.200 0.087
[ 15] 0.251 0.324 0.225 0.176 0.258 0.176 0.200 0.193 0.222 0.308 0.152 0.225 0.149 0.087
[ 16] 0.255 0.273 0.186 0.145 0.218 0.214 0.240 0.204 0.211 0.289 0.142 0.243 0.132 0.097 0.119
[ 17] 0.296 0.292 0.211 0.176 0.229 0.233 0.266 0.222 0.251 0.308 0.159 0.277 0.149 0.132 0.142 0.100
[ 18] 0.218 0.243 0.126 0.152 0.197 0.222 0.218 0.190 0.211 0.258 0.116 0.207 0.152 0.136 0.186 0.090 0.081
[ 19] 0.222 0.277 0.136 0.176 0.200 0.225 0.222 0.193 0.251 0.247 0.119 0.162 0.162 0.173 0.211 0.159 0.149 0.075
[ 20] 0.240 0.236 0.159 0.193 0.190 0.273 0.270 0.247 0.233 0.207 0.169 0.159 0.200 0.211 0.222 0.204 0.200 0.149 0.075
[ 21] 0.296 0.218 0.262 0.211 0.251 0.373 0.352 0.352 0.236 0.136 0.289 0.162 0.190 0.273 0.285 0.222 0.285 0.273 0.218 0.200
[ 22] 0.211 0.243 0.145 0.145 0.197 0.236 0.218 0.197 0.176 0.229 0.149 0.207 0.186 0.149 0.159 0.129 0.166 0.176 0.207 0.169 0.222
[ 23] 0.236 0.218 0.190 0.169 0.229 0.277 0.251 0.229 0.152 0.204 0.207 0.211 0.204 0.139 0.169 0.139 0.211 0.193 0.247 0.200 0.225 0.081
[ 24] 0.270 0.152 0.251 0.166 0.211 0.360 0.316 0.308 0.156 0.094 0.247 0.179 0.179 0.233 0.251 0.204 0.251 0.247 0.281 0.277 0.106 0.183 0.152
[ 25] 0.200 0.211 0.149 0.169 0.200 0.233 0.207 0.173 0.132 0.204 0.132 0.197 0.197 0.159 0.176 0.145 0.183 0.152 0.197 0.200 0.255 0.113 0.097 0.145
[ 26] 0.176 0.200 0.139 0.159 0.204 0.258 0.211 0.176 0.149 0.207 0.149 0.179 0.200 0.162 0.193 0.136 0.207 0.142 0.200 0.183 0.258 0.136 0.094 0.190 0.069
[ 27] 0.289 0.183 0.262 0.255 0.243 0.373 0.352 0.360 0.222 0.116 0.304 0.156 0.233 0.328 0.348 0.289 0.348 0.304 0.270 0.214 0.084 0.243 0.225 0.132 0.240 0.243
[ 28] 0.211 0.266 0.186 0.193 0.255 0.186 0.204 0.176 0.176 0.258 0.149 0.236 0.200 0.136 0.166 0.136 0.200 0.149 0.200 0.225 0.273 0.136 0.100 0.190 0.081 0.103 0.222
[ 29] 0.218 0.207 0.132 0.159 0.156 0.281 0.225 0.233 0.162 0.166 0.176 0.139 0.193 0.233 0.243 0.211 0.258 0.169 0.152 0.142 0.179 0.169 0.173 0.190 0.173 0.156 0.126 0.149
[ 30] 0.218 0.193 0.152 0.179 0.149 0.304 0.247 0.255 0.183 0.152 0.197 0.159 0.214 0.255 0.266 0.233 0.281 0.190 0.173 0.156 0.173 0.190 0.193 0.183 0.193 0.176 0.119 0.176 0.029
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10期 孔凡娜 ,等:青岛石老人海域石花菜遗传多样性分析
　　根据 POPGENE 软件获得该群体内 Na(观测等位
基因数)为 1.504 3 , Ne(有效等位基因数)为 1.298 5 ,
Neis基因多样性指数为 0.175 5 , Shannon 信息指数
达到 0.263 3。
根据个体间的遗传距离 ,利用 MEGA 软件对 30
个个体进行聚类分析(见图 2),结果显示 ,2 ,10 , 24 , 21 ,
27等 5个个体和其他 25个个体相距较远 ,聚为 1个类
群;其它 25个个体聚为 2个类群 ,1 ,6 ,7 ,8聚为 1个小
的类群 ,另 21个个体聚为 1个类群 ,该类群中包含 2
个小的类群 。
3　讨论
石花菜作为 1种重要的工业原料 ,具有较高的经
济价值。但目前石花菜的产量主要依靠有限的自然资
源 ,远远不能满足人们的需要。加强石花菜的人工养
殖是解决这一问题的关键 ,我国多位研究人员对石花
菜养殖苗种的育苗方法进行了探讨[ 2-6] ,为石花菜的人
工养殖提供了一定的技术支持。但种质的选育是养殖
的首要因素 ,然而近年来 ,在世界范围内潮间带和潮下
带的大型经济海藻种群数量不断减少 ,遗传多样性不
断下降。在日本[ 6] 和我国黄渤海及台湾地区 ,石花菜
已被列为濒危物种。因此开展石花菜资源遗传多样性
的调查 ,不仅具有重要的生物学意义 ,也为石花菜产业
的长远发展提供种质资源 。
目前 ,国内外对石花菜属资源遗传多样性的研究
远落后于红藻中的其它藻类 , Bouza[ 8] 采用 RAPD技术
分析了西班牙加纳利岛 G.canariense 不同群体的遗
传结构 ,分析表明群体间遗传多样性较高 ,群体内遗传
多样性范围从 0.156 ～ 0.264。Alber to[ 9] 采用 RAPD
分析了法国北部到摩洛哥 14个不同地理群体的遗传
多样性 ,群体内平均遗传距离为 0.065 ,群体间遗传距
离为 0.241。Sosa[ 10]采用 RAPD技术分析了西班牙加
纳利岛 G.arbuscula 3个不同地理群体孢子体和配子
体的遗传多样性 ,其中 Ne(有效等位基因数)在 1.04 ～
1.32之间 , Neis基因多样性指数在 0.015 ～ 0.074 之
间。本研究首次采用采用分子标记技术对我国石花菜
种质资源遗传多样性的现状进行评估 ,利用 AFLP 技
术分析了青岛石老人海域的 1 个自然群体 ,群体内遗
传距离为 0.029 ～ 0.390 , Ne(有效等位基因数)为
1.298 5 , Neis基因多样性指数为 0.175 5 ,Shannon信
息指数达到 0.263 3。石媛嫄[ 11] 对我国海带和长海带
的多态性进行了比较分析 , Neis 基因多样性指数范围
为 0.21 ～ 0.75 , Shannon 信息指数在 0.37 ～ 1.55 之
间。以上数据表明 ,与海带资源相比 ,目前世界范围内
不同种的石花菜资源遗传多样性程度较低 。对于青岛
海域 ,研究者在石老人海域采集到大量研究材料 ,但在
八大关和团岛海域未采到 ,这些都进一步说明青岛海
域石花菜资源的枯竭 ,因此加强石花菜种质资源的保
护势在必行。
Frankel
[ 12] 提出了“核心种质”的概念 ,为种质资源
的高效利用提供了 1条有效途径。核心种质是用一定
的方法选择整个种质资源的一部分 ,以最小的资源数
量和遗传重复最大程度的保存整个资源群体的遗传多
样性 。到目前为止 ,全球核心种质构建工作主要集中
在对人类密切相关的经济植物方面 ,在海洋生物中 ,因
缺少技术与材料的支撑 ,尚未开展有关核心种质研究
工作 。海洋环境变化以及人类过度开发 ,导致我国现
存石花菜自然资源量急剧减少 、急需加强种质资源的
保护 、评价工作 。研究者的后续工作将进一步加强对
我国不同海域石花菜资源遗传多样性的评价 ,从而为
建立石花菜的核心种质库和制定石花菜资源的保护策
略提供一定的理论支持 。
参考文献:
[ 1] 　Vos P , H ogers R , Bleeker M , et al.AFLP:a new tech nique for
DNA fin ger p rin ting [ J] .Nucleic Acids Res , 1995 , 23:4407-
4414.
[ 2] 　席振乐 , 黄礼娟 , 王立超 , 等.石花菜孢子萌发及幼苗生长的研究
初报 [ J] .齐鲁渔业 , 1987(3):44.
[ 3] 　李宏基 , 戚以满.石花菜人工育苗的试验 [ J] .海洋湖沼通报 ,
1990 , 2:72-79.
[ 4] 　骆其君 , 裴鲁青.不同世代大石花菜切段育苗的生态试验 [ J] .东
海海洋, 1993 , 11(2):62-66.
[ 5] 　裴鲁青 , 骆其君.温度—辐照度对大石花菜切段育苗的影响 [ J] .
浙江水产学院学报 , 1994 , 13(2):73-78.
[ 6] 　李美真 , 詹冬梅, 丁刚 , 等.石花菜生产性孢子育苗技术试验
[ J] .齐鲁渔业 , 2006 , 23(9):46-48.
[ 7] 　Bouza N , Cau jape-Cas tells J , Gonzalez-Perez M , et al.Genetic
st ructu re of natu ral populations in th e red algae Gel id ium canar-
iense (Gelidiales , Rhod ophyta)invest igated by random ampli fied
polymorphic DNA (RAPD)markers [ J] .Journal of Phy cology ,
2006 , 42(2):304-311.
[ 8] 　Alberto F , Santos R , Leitao J M , et al.Asses sing pat tern s of ge-
og raphic dispersal of Gel id ium sesquipeda le (Rhodophyta)
through RAPD dif feren tiat ion of population s [ J] .Marine E cology
Prog ress Series , 1999 , 191:101-108.
[ 9] 　Fuji ta D , Ishikaw a T , Kodam a S , et al.Dist ribut ion and recent
reduction of Gel id ium beds in Toyama Bay , J apan[ J] .Journal of
Applied Phycology , 2006 , 18:3-5.
[ 10] 　石媛嫄 , 杨官品 , 廖梅杰, 等.海带和长海带配子体无性繁殖系
微卫星DNA 多态性比较分析 [ J] .中国海洋大学学报:自然科
学版 , 2008 , 38(1):303-308.
[ 11] 　Sosa A , Garcia-Reina , G.Genet ic variabilit y and differen tiation
of sporophytes and gametophy tes in p opu lation s of Gel id ium ar-
buscu la(Gelidiaceae:Rhodophyta)determined by isozyme elec-
t roph oresi s [ J] .Marine biology , 1992 , 113:679-688.
[ 12] 　Fran kel O H.Genet ic perspectives of germplasm con servation
77
中　国　海　洋　大　学　学　报 2 0 1 0 年
[ M ] .∥ Genetic Manipu lat ion:Im pact on Man and Society.Ar-
ber W et al , ed s.Cambridge , UK:Cam bridge University Press ,
1984:161-170.
Genetic Polymorphic Analysis from the Shilaoren Sea Area of Qingdao
KONG Fan-Na , MAO Yun-Xiang , GAO Zhen , WANG Li , SUN Pei-Pei , SHI Xiao-Sha
(Colleg e o f Ma rine Life Sciences , Ocean Univer sity of China , Key Labo rato ry of Marine Genetics and Gene Resource Explo ita-
tion of M inistry o f Education , Ocean Univ ersity of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　Gelidium amansi i is an important economical sea alga.In this research , 30 individuals from
the Shilaoren sea area of Qingdao w ere analy zed using amplif ied f ragment leng th polymorphism (AFLP).
In to tal , 346 loci w ere obtained using seven combina tions o f selectiv e primer s.Of these loci , 166 were
polymo rphic , accounting fo r 47.8% of the to tal.The genetic distances betw een the individuals ranged
from 0.029 to 0.390.Observed number of alleles is 1.504 3 , ef fective number of alleles is 1.298 5 , Neis
(1973)gene diversity is 0.175 5 and Shannons info rmation index is 0.263 3.The 30 individuals w ere clus-
tered into tw o groups using UPGMA analy sis , which show ed that the genetic polymorphism of the popu-
lat ion f rom the Shilaoren sea area of Qingdao w as low er.
Key words:　Gelidium amansii;AFLP;genet ic polymo rphism;ge rmplasm re source
责任编辑　于　卫
(上接 68页)
Trampling Effects on Sandy Beach Meiofauna:
Preliminary Results of Field Experiments
HUA Er , LIN Jia-Ning , FENG Song , WANG Nan , LI Guang-Fu , LI Hua-Long , ZHANG Zhi-N an
(Co lleg e of Ma rine Life Science , Ocean Unive rsity of China , Qingdao 266003 , China)
Abstract:　We carried out f ield experiments o f t rampling ef fects on meiofauna in sandy beach of Taiping
Bay , Qingdao in June , 2008.Trampling w as undertaken in a manner to simulate the tourism activities.
Meiofauna w as col lected 0 h , 12 h , 24 h , and 144 h after t rampling t reatment.The results show ed that
meio fauna vertical distribution changed significant ly in 12 hour s.Results suggest that the predominant
ef fect of t rampling disturbance may cause meiofauna to bury deeper into the sediment.At the same t ime ,
comparative studies of meiofauna abundance and dist ribution w ere conducted on the studied sandy beach
separately in tourism season (July)and of f-season (October).It aimed to understand the ef fects of
tourism activit ie s on meiofauna abundance and dist ribution.In tourism season meiofauna abundance , f ree-
living marine nematode in particular , was significantly lowe r than that in of f-season.And this w as out-
standing in the middle intertidal zone.Besides seasonal ef fect , tourism activi ties , including w alking , run-
ning , playing on the beach and swimming in the surf zone , had a marked ef fect on the sediment structure.
Tourism induced sedimentary variations may have contributed to the main reasons fo r changes in meiofau-
nal abundance , composit ion and dist ribut ion.Meiofaunal responses to tourism act ivities need to be studied
in a broader and deeper ex tent.
Key words:　intertidal sandy beach;meiofauna;field experiments;trampling;tourism-induced disturbance
责任编辑　于　卫
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