全 文 ：文章编号:1001 － 4829(2015)06 － 2649 － 06 DOI:10． 16213 / j． cnki． scjas． 2015． 06． 055
收稿日期:2014 － 11 － 29
基金项目:福建省菌草生态产业协同创新中心(K80ND8002) ;
国家菌草工程技术研究中心组建项目(2011FU125X12)
作者简介:李 晶(1985 －) ，女，博士研究生，主要从事食药用
菌生物技术研究，E-mail:13959197195@ 163． com，* 为通讯作
者。
牛樟芝 ITS序列分析及液体发酵菌丝体总三萜含量测定
李 晶1，2，林雄杰3，童金华1，刘朋虎1，林占熺1*
(1． 福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002;2． 国家菌草工程技术研究中心，福建 福州 350002;3． 福建省农业科学研究院
果树研究所，福建 福州 350013)
摘 要:为筛选富萜牛樟芝(Antrodia cinnamomea)菌株，对收集的 3 株牛樟芝菌株(AC620，AC1404，AC001)进行 ITS序列分析，通
过香草醛 －冰醋酸法对牛樟芝液体发酵菌丝体总三萜含量进行分析。ITS序列分析结果表明菌株 AC1404 和 AC001 的 ITS序列完
全相同，长度均为 593 bp，AC 620 菌株的长度为 581 bp。供试菌株 AC001、AC1404 和 AC620 菌丝体中的三萜含量分别为 34． 30、
18． 47 和 16． 68 mg·g － 1(DW) ，菌株 AC001 与 AC1404 和 AC620 间菌丝三萜含量差异极显著(P ＜ 0． 01)。
关键词:牛樟芝;ITS序列;菌丝体;三萜含量
中图分类号:Ｒ284 文献标识码:A
ITS Sequence Analysis of Antrodia cinnamomea and
Total Triterpenoid Detection of Liquid Fermentation Mycelium
LI Jing1，2，LIN Xiong-jie3，TONG Jin-hua1，LIU Peng-hu1，LIN Zhan-xi1*
(1． School of Horticulture of Fujian Agriculture and Forestry University，Fujian Fuzhou 350002，China;2． China National JUNCAO Engi-
neering Ｒesearch Center，Fujian Fuzhou 350002，China;3． Fruit Ｒesearch Institute，Fujian Academy of Agriculture Sciences，Fujian
Fuzhou 350013，China)
Abstract:In order to screen the rich triterpenoid Antrodia sp．，3 collected Antrodia cinnamomea strains (AC620 AC1404，AC001)were
analyzed with ITS sequence． The triterpenoid contents of Antrodia cinnamomea in liquid fermentation mycelium were tested by the method of
vanillin -glacial acetic acid． It showed that the ITS sequences were the same in the strains AC 1404 and AC 001，the length was 593 bp，
and was 581 bp of strain AC 620． The triterpenoid contents of tested strains were 34． 30，18． 47 and 16． 68 mg · g － 1(DW)in strain
AC001，AC1404 and AC620，respectively． There was significant difference (P ＜ 0． 01)between AC1404，AC620 and AC001．
Key words:Antrodia cinnamomea;ITS sequence;Mycelium;Triterpenoid
真菌是世界上第二大种类的生物，目前已发现
有 150 万种存在于地球上［1］。我国真菌资源丰富，
历史悠久。据统计，我国已知真菌类型有近 1． 5 万
种，食用真菌共有 936 种［2］，药用真菌 473 种［3］。牛
樟芝(Antrodia cinnamomea)是我国台湾特有的珍稀
药用菌品种，属担子菌门(Basidiomycota)、多孔菌目
(Polyporales)、白肉迷孔菌科(Fomitopsidaceae)、薄
孔菌属(Antrodia)［4 ～ 6］，最早发现生长在腐烂的空心
的牛樟树(Cinnamomum kanehirai)内壁，早期牛樟
树被认为是牛樟芝唯一的宿主［4］。樟芝味苦，长期
被台湾土著人用于治疗抗过敏、抗炎症、抗氧化、抗
肿瘤、提高免疫力等具有显著功效;但由于牛樟芝宿
主唯一性及生长缓慢等特点，导致它的价格不菲，常
被人们誉为“森林中的红宝石”［7］。
ITS 序列(Internal Transcribed Spacer)分析在菌
物系统发育研究中被广泛应用，用于扩增 ITS 不同
区域的一系列保守引物已经设计成功［8 ～ 9］。从一段
保守核酸序列中得到相应的遗传信息从而反映亲缘
关系，是真菌、植物属、种［10］。
我国台湾和大陆地区做了许多关于牛樟芝三萜
的研究。Chen 等从牛樟芝子实体中分离得到了三
种新的麦角甾烷型(ergostane)三萜类化合物 Anticin
A-C、Actcin E-F、Methyl antcinate G 和 Methyl antci-
nateH［11］。到目前为止，共从牛樟芝中分离纯化得
到 31 种三萜类化合物，骨架结构主要以麦角甾烷型
9462
2015 年 28 卷 6 期
Vol. 28 No. 6
西 南 农 业 学 报
Southwest China Journal of Agricultural Sciences
和羊毛脂烷型(lanostane)为主，用乙醇提取牛樟芝
中的三萜针对 LPS引起的 NO生产 NADPH、氧化酶
生产 BV2 小鼠胶质细胞和多形核中性粒细胞
(PMNs)评估，发现其对酒精肝损伤有保护作用［12］;
从樟芝菌丝体醇提取物中分离到 Antroqiunonol 也
对酒精损伤的肝细胞有保护作用［13］。
已证实牛樟芝子实体和菌丝体中都含有三萜类
化合物的存在，其组成及功效研究已经引起人们的
重视，本文对收集到的 3 种菌株进行 ITS 序列分析，
并测定其液体发酵菌丝体三萜含量，从而为进一步
筛选不同培养条件下富萜牛樟芝菌株的研究奠定了
良好基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 供试菌株 供试菌株 AC 001 由台湾神农真
菌生物技术有限公司惠赠，菌株 AC 1404，AC 620 均
由福州绿谷生物药业技术研究所惠赠，以上菌株均
保存于国家菌草工程技术研究中心。
1． 1． 2 试剂 2 × Taq Master Mix、植物 DNA 提取
试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，齐墩果
酸购于福建省药品检验所，其它试剂均为分析纯。
1． 1． 3 培养基 PDA培养基:马铃薯 200 g煮熟 30
min后八层纱布过滤，葡萄糖 20 g，琼脂 20 g，pH 自
然，蒸馏水定容至 1 L。
牛樟芝液体培养基:葡萄糖 2． 5 %，蛋白胨 0． 5
%，麦芽糖 0． 3 %，酵母提取物 0． 3 %，KH2PO4 0． 1
%，MgSO4·7H2O 0． 1 %，维生素 B1 0． 1 %，pH 5．
5，蒸馏水定容［14］。
1． 2 方法
1． 2． 1 基因组 DNA的提取 将保存的牛樟芝菌种
接到 PDA培养基上活化 7 d 后，再转接到牛樟芝液
体培养基中，27 ℃恒温培养 28 d后过滤收集其菌丝
体备用。取新鲜的菌丝体 1． 0 ～ 2． 0 g 加入到冷却
的研钵中，并加入适量液氮迅速研磨成粉末，收集到
1． 5 mL 离心管中，按 CTAB 法提取其基因组
DNA［15］。
1． 2． 2 ITS序列扩增及测序 ITS 序列扩增引物为
ITS4 5’-AAGGTTTCCGTAGGTGAAC-3’，ITS5 5’-
TATGCTTAAACTCAGCGGG-3’［8］，由铂尚生物技术
(上海)有限公司合成，反应体系为 25 μl，Taq Master
Mix 12． 5 μl，10 μmol /L的上下游引物各 1 μl，模板
DNA 1 μl，无菌水 9． 5 μl。PCＲ扩增程序为 95 ℃预
变性 3 min，32 个循环(包括 94 ℃变性 30 s，55 ℃退
火 30 s，72 ℃延伸 1 min) ，最后 72 ℃延伸 7 min。
PCＲ产物经 1 %琼脂凝胶检验纯度和浓度，合格后
进行产物回收纯化后由铂尚生物技术(上海)有限
公司进行测序。
1． 2． 3 序列比对及遗传距离分析 以测序所得的
三种牛樟芝菌丝体 ITS 序列作为参考序列，在 NCBI
中经 BLAST搜索相关 ITS 序列，采用 Clustal X 2． 0
软件进行多序列比对，并手工校正，用 Mega 5． 1 软
件分析其遗传距离。
1． 2． 4 系统发育树构建 用 Mega 5． 1 软件的邻接
法(Neighbor joining，NJ 法)分别对得到的 ITS 序列
构建系统发育树，同时以 1000 次自举分析(Boot-
strap)检测各分支的置信度。
1． 2． 5 牛樟芝菌丝体三萜含量的提取及测定［16］
取粉碎均匀的牛樟芝菌丝体适量，以 80 %乙醇作为
提取溶剂，料液比 1∶ 40(w /v) ，提取温度为 70 ℃，
提取时间为 1 h，以上操作重复 1 次，提取液合并，过
滤，浓缩，离心后取上清液定容到 50 mL。
标准曲线的绘制:称取干燥恒重的齐墩果酸标
准品 10． 08 mg于 25 mL 容量瓶中，加入 80 %乙醇
溶解定容后摇匀，其终浓度为 0． 4032 mg·mL －1。
精确吸取齐墩果酸标准品溶液 0． 00、0． 10、0． 20、0．
30、0． 40、0． 50、0． 60、0． 70、0． 80 mL 至刻度试管中，
在 50 ～ 60 ℃水浴中挥发溶剂，加入 0． 3 mL 5 %香
草醛 －冰醋酸溶液和 1 mL 的高氯酸，60 ℃水浴反
应 20 min，冰水冷却后加入 10 mL 冰醋酸，摇匀后，
以空白为对照，于 300 ～ 800 nm 扫描确定最大吸光
值，以齐墩果酸浓度(mg·g －1)为横坐标，吸光值为
纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。
样品测定:取样品溶液 0． 5 mL按上述操作方法
对其吸光值进行测定，计算三萜含量，结果用 SPSS
20． 0 软件进行 Bonferroni分析。
1． 2． 6 稳定性试验 取供试品溶液，按方法 1． 2． 5
分别在 0 ～ 60 min内进行稳定性试验。
1． 2． 7 回收率试验 精密称取已知含量的供试样
品，加入标准品适量，按 1． 2． 5 处理，计算样品回收
率。
2 结果与分析
2． 1 牛樟芝 ITS序列分析
测序比对结果表明菌株 AC 1404 和 AC 001 的
ITS序列完全相同，在 NCBI 上的序列登录号分别为
AC001(KM925002)和 AC620(KP054990)。分别除
去测序得到的 3 种牛樟芝菌丝体 ITS 序列的 18S 和
26S序列后，结果 AC 1404 和 AC 001 菌株的 ITS 序
列长度均为 593 bp，AC 620 菌株的长度为 581 bp
(表 1)。用 MEGA 5． 1 软件对 3 种牛樟芝和 NCBI
0562 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 1 牛樟芝 ITS序列的长度及 G/C含量
Table 1 ITS sequence length and G /C content of Antrodia cinnamomea
材料
Material
ITS1 5． 8s ＲNA ITS2
长度(bp) G + C(%) 长度(bp) G + C (%) 长度(bp) G + C(%)
AC 001(KM925002) 218 41． 28 158 44． 94 217 42． 86
AC 1404 218 41． 28 158 44． 94 217 42． 86
AC 620(KP054990) 206 42． 72 158 44． 94 217 48． 85
下载的 25 条 ITS序列的变异情况进行分析，结果表
明，序列重新排列后的共有 646 个位点，其中 379 个
保守位点，266 个变异位点(213 个简约信息位点，51
个单突变位点) ，变异位点比例为 41． 18 %，而信息
位点比例达 32． 97 %，说明 ITS序列总体变化较大，
且具有大量遗传信息位点，适宜用作遗传分析。
2． 2 牛樟芝 ITS序列遗传距离分析
用 Mega 5． 1 软件对牛樟芝的 ITS和 NCBI下载
的 25 条序列的遗传距离进行分析，结果表明它们间
的遗传距离为 0． 000 ～ 0． 126，平均遗传距离为 0．
061;其中 Taiwanofungus camphoratus(GenBank No．:
KF737531 )与 Amylopria sp． (GenBank No．:
KC951179) ［132］、Amylopria sp． (GenBank No．:
KC951180 )、 Postia Placenta (GenBank No．:
KJ995950)和 Uncultured Basidiomycota (GenBank
No．:FＲ686626)间的遗传距离最大，为 0． 126;供试
的 AC001 菌株与 Taiwanofungus camphoratus(Gen-
Bank No．:JQ945231)、Taiwanofungus camphoratus
(GenBank No．:KJQ704843)和 Taiwanofungus cam-
phoratus(GenBank No．:DQ455776)的遗传距离最小
为 0，与 Amylopria sp． (GenBank No．:KC951179)间
的遗传距离最大为0 ． 104;供试的AC620菌株与
数字表示各分支自展数据支持率，“●”表示本研究供试材料，“* ”表示外类群
Numbers are boot strap values．‘●’represents the samples in this study;‘* ’represents the out-group
图 1 邻位相邻法(NJ)法构建的 ITS序列系统发育树
Fig． 1 ITS sequences phylogenetic tree using the neighbor joining method
15626 期 李 晶等:牛樟芝 ITS序列分析及液体发酵菌丝体总三萜含量测定
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35
齐墩果酸质量(mg)
Weight of oleanolic acid
吸
光
值
Ab
so
rb
an
ce
图 2 齐墩果酸标准曲线
Fig． 2 Standard curve of oleanolic acid
Taiwanofungus camphoratus (GenBank No．:
KF717531)间的遗传距离最小为 0． 007，与 Uncul-
tured Basidiomycota(GenBank No．:FＲ686626)间的
遗传距离最大为 0． 118。
2． 3 樟芝 ITS序列系统发育分析
基于 ITS 序列以 Poria sebvermispora(GenBank
No．:AY089736)作为外类群，通过邻接法(Neighbor-
Joining，NJ)构建进化树(图 1) ，其中 AC620 与
AC001 在同一大类上。
2． 4 牛樟芝菌丝体三萜含量的测定
2． 4． 1 标准曲线的制备 在 300 ～ 800 nm 扫描得
最大吸光值为 548 nm，以齐墩果酸质量为横坐标，
吸光值为纵坐标绘制曲线，得回归方程为 Y =
40
35
30
25
20
15
10
5
0
AC620 AC1404 AC001
样品
Samples
牛
樟
芝
菌
丝
体
三
萜
含
量
（ m
g·
g-
1 ）
Tr
ite
rp
en
oi
d
co
nt
en
to
fA
.ci
nn
am
om
ea
% m
yc
el
iu
m
图 3 不同樟芝菌株液体发酵菌丝体中三萜含量
Fig． 3 Triterpenoid content of Antrodia cinnamomea mycelium
表 2 方差齐性检验
Table 2 Homogeneity of variances test
Levene统计量 df1 df2 显著性
1． 011 2 6 0． 419
3． 8826X － 0． 0105，Ｒ2 = 0． 9995(图 2)。
2． 4． 2 样品三萜含量的测定 供试菌株用同一液
体培养基在相同条件下培养 10 ～ 14 d 后，收集其菌
丝体并按 1． 2． 5 的方法测定总三萜含量，结果表明，
AC620、AC1404、AC001 的三萜含量分别为 16． 68、
18． 47 和 34． 30 mg·g －1(DW) ，方差分析结果表明
菌株 AC001 与 AC620、AC1404 之间的三萜含量具
有极显著性差异(P ＜ 0． 01) (图 3、表 2 ～ 5)。
表 3 樟芝菌丝体三萜含量单因素方差分析
Table 3 Analyis of variance of triterpenoid in Antrodia cinnamomea mycelium
平方和 df 均方 F 显著性
组间(组合) 564． 153 2 282． 076 350． 228 0． 000
线性项 对比 465． 503 1 465． 503 577． 971 0． 000
偏差 98． 650 1 98． 650 122． 484 0． 000
组内 4． 832 6 0． 805
总数 568． 985 8
表 4 牛樟芝菌丝体三萜含量多重比较分析
Table 4 Multiple comparison analysis of triterpenoid content in Antrodia cinnamomea mycelium
菌株 不同菌株 均值 均值差 标准误 显著性
99 %
下限 上限
AC620 AC1404 16． 68167 － 1． 785000 0． 732761 0． 152 － 5． 22746 1． 65746
AC001 － 17． 616333* 0． 732761 0． 000 － 21． 05879 － 14． 17388
AC1404 AC620 18． 46667 1． 785000 0． 732761 0． 152 － 1． 65746 5． 22746
AC001 － 15． 831333* 0． 732761 0． 000 － 19． 27379 － 12． 38888
AC001 AC620 34． 29800 178． 616333* 0． 732761 0． 000 14． 17388 21． 05879
AC1404 15． 831333* 0． 732761 0． 000 12． 38888 19． 27379
注:* 均值差的显著性水平为 0． 01。
Note:* The significance level of mean difference was 0． 01．
2562 西 南 农 业 学 报 28 卷
表 5 回收率实验结果
Table 5 Ｒesult of recovery
样品
(mg)
加入齐墩果酸含量
(mg)
齐墩果酸含量
(mg)
平均值
(mg) 回收率
19 20 37． 76 37． 23 37． 47 37． 49 96． 13 %
0.61
0.60
0.59
0.58
0.57
0.56
0.55
0.54
吸
光
值
0 10 20 30 40 50 60 70
时间（min）
图 4 稳定性分析
Fig． 4 Stability analysis
2． 4． 3 稳定性 图 3 表明，吸光值在 0 ～ 5 min 内
不稳定，ＲSD 为 1． 07 %;在 10 ～ 60 min 内开始下
降，ＲSD为 1． 58 %;在 5 ～ 10 min 内，结果稳定，因
此，应在 5 ～ 10 min内测定其吸光值。
2． 4． 4 回收率结果 由表 5 可知，平均回收率为
96． 13 %，ＲSD为 0． 71 %。
3 讨 论
现代分子生物学技术的发展使 DNA 测序技术
得到了蓬勃发展，为解决物种分类学、形成与进化及
系统发育等领域的研究提供了有力的技术途
径［17 ～ 18］。在真菌中，rDNA 的内转录间隔区 ITS 由
ITS1、ITS2 和 5． 8S共 3 部分组成，由于 ITS1 和 ITS2
非编码区受外界环境因素的影响较小，承受的选择
压力较小，因而进化速度较快，核苷酸序列变异较
大，且主要是以相互独立的点突变为主，可为属以下
水平的研究提供较丰富的信息位点和变异位点等有
效信息。ITS区的这种核苷酸序列的高度变异但序
列长度高度保守的特性，可较好的用于识别那些近
缘类群的间隔区的序列，可有效解决较低的分类阶
元上(如属间、种间)的系统发育问题。本研究对供
试的 3 株牛樟芝菌株的 ITS序列分析结果表明它们
间的同源性均在 93 %以上，与 NCBI 上登陆的多种
牛樟芝菌株(如 HM119138 等)的同源性高达 99 %
以上，表明它们间的亲缘关系很近。
牛樟芝子实体、菌丝体中三萜含量丰富，Lin
等［19］从人工栽培牛樟芝子实体分离出了 4 种苯环
类物质和 9 种三萜类物质，而在野生的牛樟芝子实
体中也发现了与之类似的物质，因此这 13 种物质可
以作为牛樟芝栽培产物的标准。但是不同的菌种之
间其液体培养菌丝体总三萜含量均有差异，本研究
采用香草醛 －冰醋酸法分别测定了 3 株供试牛樟芝
菌株菌丝体中总三萜含量，该方法操作简单快速、稳
定性好而且结果准确，可作为筛选富萜牛樟芝菌株
的检测标准。同时，通过进一步采用 HPLC、MS 等
技术手段分离三萜类化合物，可有效促进食药用菌
产品质量标准和对照品研究的快速发展。
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(责任编辑 李山云)
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