全 文 ：欧洲水仙的繁殖技术研究
李素红1，苏胜茂2，蒋恩顺2，王江勇2*
(1．山东天地园艺科技有限公司，山东泰安 271000;2．山东省果树研究所，山东泰安 271000)
摘要 ［目的］研究欧洲水仙的繁殖技术，为欧洲水仙的种质资源栽培提供依据。［方法］在查阅相关资料的基础上，系统介绍欧洲水仙
的 4种主要的繁殖方式:侧球繁殖、鳞片繁殖、双鳞片繁殖以及组织培养繁殖，并对 4种繁殖方式进行简单比较。［结果］鳞片扦插方法
操作较简单，但繁殖材料易污染腐烂，且扦插用材料较组织培养多，繁殖系数低。用组织培养方法进行快速繁殖，环境相对容易控制，污
染率低，且所需材料少，繁殖系数高。［结论］组织培养方法极大地提高了水仙的繁殖速度。
关键词 欧洲水仙(Narcissus pseudonarcissus);繁殖;鳞片;组织培养
中图分类号 S188 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2014)17 －05372 －02
Study on the Propagation Technique of Narcissus pseudonarcissus
LI Su-hong，WANG Jiang-yong et al (Shandong Tiandiyuanyi Company，Taian，Shandong 271000;Shandong Institute of Pomology，Taian，
Shandong 271000)
Abstract ［Objective］To study propagation technique of Narcissus pseudonarcissus，and provide reference for germplasm resource cultivation．
［Method］On the basis of reviewing relevant literatures，four main propagation methods were introduced:side of the bulb propagation，scale
propagation，double scale propagation and propagation by tissue culture． And a simple comparison of four kinds of propagation technique was
compared． ［Ｒesult］The operation of scale cutting method is simple，but the propagation material is easy to decay，the propagation coefficient is
low． The tissue culture method is superior with advantages of low pollution rate，less materials，high propagation coefficient． ［Conclusion］Tis-
sue culture method significantly improved the propagation speed of Narcissus pseudonarcissus．
Key words rcissus pseudonarcissus;Propagation;Scale;Tissue culture
基金项目 山东省泰安市科技发展计划项目(20113049)。
作者简介 李素红(1986 － )，女，山东阳谷人，硕士，从事作物栽培方面
研究。* 通讯作者，助理研究员，从事作物栽培方面研究。
收稿日期 2014-05-14
欧洲水仙(Narcissus pseudonarcissus)又叫洋水仙，是从欧
洲引入我国水仙品种的统称［1］，为石蒜科水仙属植物，同属
有 30余种，园艺栽培品种现已超过 2 万个;主要分布在中
欧、地中海和西亚地区，喜温暖、湿润和阳光充足的环境。欧
洲水仙与国内广泛栽培的中国水仙相比，花大，色多更美
观［2］。欧洲水仙自 20世纪 80年代被大规模引入中国后，已
为越来越多的人所喜爱，市场需求广泛。
目前，我国的水仙种球主要依赖于进口，虽然国内已有
关于水仙繁殖的研究，但繁殖的数量和质量都不甚理想。李
正芬［3］认为水仙繁殖速度慢是因为水仙鳞茎为层状鳞茎，由
多年形成的鳞片(即变态叶)和鳞茎(即鳞茎盘)所组成，鳞
片呈环状着生在鳞茎盘上，包裹着中心的叶鞘和叶片;在显
微镜下可以看到，在 2个鳞片间的鳞茎盘上，有很多小突起，
呈环状排列，即腋芽原基，这是水仙能够快速繁殖的内在条
件;但是在自然状态下，并不是所有的腋芽原基都可以发育
成腋芽，而只有少量在同化叶中脉基部的芽原基，才容易形
成腋芽。一个腋芽形成以后，到休眠之前能形成 4 枚鳞片，
这些鳞片第 1年抽出 2枚叶鞘和 2枚同化叶，在第 2 年又形
成第3年抽出地面的2 ～3枚叶鞘和3 ～4枚同化叶。每片同
化叶在其活动的后期又形成了一个腋芽。通常情况下，一个
鳞茎每年只能形成 2 ～ 3 个腋芽，所以在 3 年中能分离供繁
殖用的小仔球仅 3 ～ 4 个，多的也只有 5 ～ 6 个，这大大的影
响了水仙的繁殖速度。同时因为多年的无性繁殖，病毒累
积，鳞茎和花变小，使得水仙退化严重，质量不高。笔者介绍
几种比较常见的水仙繁殖方法，现报道如下。
1 侧球繁殖
侧球繁殖是最常用的方法。侧球着生于鳞茎球外的 2
侧，仅基部与母球相连，很容易脱离母体，秋季将侧球与母球
分离，单独种植，次年就可以生出新球。但这种方法繁殖系
数低，多的每鳞茎球每年可获得 5 个子球，有些品种只能得
到 2个子球［4］。
2 鳞片繁殖
取饱满、健康的水仙母球茎，先剥去鳞茎表面腐烂或干
枯的鳞片，切除顶端的枯黄叶部，并用清水将表面脏物清洗
干净。用稀释 50 倍的‘84’消毒液，浸泡 20 min，取出后晾
干，之后将鳞茎按 8 分法纵切成小块，注意切分时不要损伤
基部并使同种分法尽量带相同大小的鳞茎盘。鳞茎块消毒
用药剂配方如下:多菌灵与甲基托布津质量比 1∶ 1混合后加
入细砂，比例为 1∶ 1 000，用珍珠岩作为扦插基质［4］。
3 双鳞片繁殖
用带有 2个鳞片的鳞茎盘作为繁殖材料，称之为双鳞片
繁殖。其方法是，先把鳞茎放在 4 ～10 ℃环境中预处理 4 ～ 8
周，然后在常温下把鳞茎盘分成小块，使每块带有 2个鳞片，
并将鳞片上端切除留下 2 cm 作为繁殖材料，然后把含水
50%的砂石放入塑料袋中，再把繁殖材料放入砂石中，封闭
袋口，置于 20 ～ 28 ℃温度中暗培养，经 2 ～ 3 月即可长出小
鳞茎，成球率可达 80% ～ 90%。此法可四季进行，但以 4 ～ 9
月为最好。生成的小鳞茎移栽成活率可达 80% ～ 100%［5］。
李颖［6］在此基础上进行改进，采用整块的双鳞茎片(上部未
切除)及鳞茎心作为繁殖材料，污染得到改善，污染比例大大
降低。
4 组织培养繁殖
20世纪 70年代初，Stone等人首次报道水仙离体组织培
责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2014，42(17) :5372 － 5373，5384
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2014.17.089
养成功［7］。现在用水仙的子房、种子、双鳞片、花茎、叶片等
作为组织培养的外植体的研究均已有报道。和传统的繁殖
方式相比，水仙的组织培养及植株再生技术为水仙的大量生
产和无病毒种球资源库的建立提供了一条有效的技术
途径［8］。
4． 1 营养器官繁殖 水仙的营养器官繁殖是以种球的鳞茎
盘、鳞片和叶片等为外植体的离体培养，通过诱导产生丛生
芽，经再分化形成植株的一种技术。
王小敏［9］以欧洲水仙品种“Dutch Master”为试材，总结
出一套完整的水仙繁殖技术:选取饱满的水仙种球，去掉鳞
茎最外层干皱的鳞片和基部残余的老根，流水冲洗 30 min后
置于浓度 75%的酒精中 1 min，用无菌水冲洗 3 遍后去除上
部 1 /3鳞片，用 0． 1% HgCl2 溶液浸泡 8 min，再用无菌水冲
洗 4遍，取内层鳞片的下部作为初代培养的外植体，愈伤组
织诱导培养基为 MS +2． 0 mg /L 6-BA +0． 3 mg /L 2，4-D +30
g /L 蔗糖，小鳞茎的诱导分化培养基为 MS + 2． 0 mg /L
6-BA +0． 2 mg /L NAA + 30 g /L 蔗糖，小鳞茎继代增殖培养
基为 MS + 1． 5 mg /L 6-BA + 0． 3 mg /L NAA + 30 g /L 蔗糖，
生根培养基为 1 /2MS + 0． 3 mg /L 6-BA + 0． 5 mg /L NAA +
20 g /L蔗糖，炼苗移栽基质配比为 V(蛭石)∶ V(泥炭土)∶ V
(园土) =1∶ 1∶ 2。一定浓度的多效唑(PP333)可以抑制植物
内源生长素和赤霉素合成，加速乙烯和脱落酸合成，从而控
制茎叶生长，有效的促进植物生根［10］。吕晓会在荷兰水仙
组培继代培养的培养基中加入一定浓度的 PP333后，外植体
出芽率增加，平均出芽数提高，芽长缩短，有效的抑制了继代
培养时叶片的生长［11］。姜丽丽［12］以苏州三山岛上野生水仙
鳞茎为材料，将其 4 ℃低温预处理 4 ～ 10 周，污染率比未经
预处理的降低很多，其增殖率达 322． 22%。胡毅敏［13］等以
舟山特有的优良新品种普陀水仙(Narcissus tazetta var．
chinensis Ｒome)为材料，经过 3年试验研究，取得在适宜的组
培条件下，1只种球 1年可以繁殖 250多只鳞茎的效果。
4． 2 生殖器官繁殖 水仙的生殖器官繁殖主要是指以花
梗、花药、子房和胚珠等为外植体，通过诱导愈伤组织，再分
化形成不定芽，进而形成完整植株的一种技术。张晓晴［14］
发现 6-BA与 Ad的合理组合对水仙花梗愈伤组织诱导、鳞茎
芽的分化有很好的促进及增殖效应，并确定了其最佳培养基
配方。Sellés M［15］、吕柳新［16］和 Chen L［17］也分别用水仙的
用种子、胚珠和花药开展了水仙离体培养的研究，通过诱导
愈伤组织建立了完整的水仙生殖器官的再生体系。
4． 3 体细胞繁殖 体细胞繁殖是指以水仙鳞片、叶片、花
梗、子房和种子的成熟或未成熟胚等为外植体进行培养，通
过诱导愈伤组织、发生胚状体进而形成再生植株的一种技
术。体细胞培养是水仙进行基因遗传转化的理想途径［18］，
为功能基因组学、细胞信号传导及植物发育研究展示了一个
广阔的平台。Lu G［19］首次报道了用农杆菌介导法研究水仙
遗传转化的技术，并成功获得转化植株，但转化率只有
1． 24%。Malik［20］以Narcissus large-cupped‘Carlton’的子房为
试验材料对水仙的体细胞胚培养方式、培养基的种类、激素
种类及配比进行了深入研究，成功建立了水仙体细胞胚培养
植株再生的体系。魏开发［21］也通过一系列的试验确定了水
仙的胚培养的培养基，并且在胚性愈伤诱导和分化体系优化
基础上实现农杆菌介导 GUS基因转化。
5 小结与展望
鳞片扦插方法操作较简单，但繁殖材料易污染腐烂，且
扦插用材料较组织培养多，繁殖系数低，已不能满足当前的
市场需求。为了适应社会需求，近年来围绕组织培养进行快
速繁殖的研究越来越来。用组织培养方法，环境相对容易控
制，污染率低，且所需材料少，繁殖系数高，一个大鳞茎通过
一年的切块繁殖，可获得以万计的小鳞茎［22］，这极大地提高
了水仙的繁殖速度。但仍然还有一些难题阻碍荷兰水仙通
过组织培养技术进行工厂化生产，比如继代培养过程中组培
材料出芽、小鳞茎形成、生根和叶片生长过快、影响基部小鳞
茎，悬浮细胞振荡培养研究较少，试材内源激素含量与所需
最适外源激素浓度水平之间关系研究较少，科研成果转化率
低［18］等，这些问题都亟待解决。
参考文献
［1］蔡曾煜．欧洲水仙(上)［J］．国花卉盆景，2006(1):6 －7．
［2］苏昱．话说洋水仙［J］．中国花卉盆景，1998(8):8 －9．
［3］李正芬． VB和无机盐类营养液对水仙鳞茎切块繁殖成球率影响的研
究［J］．贵州师范大学学报:自然科学版，1987(1):47 －50．
［4］刘薇萍，罗凤霞，周巍巍，等．欧洲水仙鳞片扦插繁殖技术［J］．林业科
技开发，2010，24(1):107 －109．
［5］刘正礼．水仙的三种繁殖及栽培方法［J］．农业科技通讯，2004(3):24．
［6］李颖，蔡平，姜丽丽，等．苏州野生水仙繁殖技术研究［J］．江苏农业科
学，2010(6):276-278．
［7］STONE O M． The elimination of viruses from Narcissus tazetta CV． Grand
Soleil d’Or，and rapid muhiplication of virus － free clones［J］． Ann Appl
Biol，1973，73(1):45 －52．
［8］ANBAＲI S，TOHIDFAＲ M，HOSSEINI Ｒ，et al． Somatic Embryogenesis In-
duction in Narcissus papyraceus‘Shirazi’［J］． Biotechnology，2007，6
(4):527 －533．
［9］王小敏，李维林，朱洪武，等．欧洲水仙鳞片组织培养与快速繁殖［J］．
林业科技开发，2011，25(4):82 －85．
［10］NOVAＲO V，PUSTOVＲH C，COLMAN-LEＲNEＲ A，et al． Nitric oxide in-
duces gelatinase A(matrix metalloproteinase 2)during rat embryo im-
plantation［J］． Fertility and Sterility，2002，78(6):1278 －1287．
［11］吕晓会，马晓红，史益敏．荷兰水仙组织培养再生体系关键技术研究
［J］．上海交通大学学报:农业科学版，2010，28(4):339 －343，354．
［12］姜丽丽，蔡平，顾林平，等．苏州野生水仙小鳞茎诱导的初步研究［J］．
北方园艺，2010(18):164 －166．
［13］胡毅敏，阚国宁．普陀水仙优良新品种组培繁殖技术研究［J］．林业科
学研究，1991，4(2):226 －230．
［14］张晓睛，高健，彭镇华．中国水仙花器官愈伤组织诱导、分化及组织学
观察［J］．林业科学研究，2013，26(3):320 －325．
［15］SELLS M，BEＲGONON S，VILADOMAT F，et al． Effect of sucrose on
growth and galanthamine production in shoot － clump cultures of Narcis-
sus confusus in liquid － shake medium［J］． Plant Cell Tissue and Organ
Culture，1997，49(2):129 －136．
［16］吕柳新，朱秀英，欧静．多花水仙胚珠离体培养［J］．福建农学院学报，
1988，17(3):216 －218．
［17］CHEN L，ZHU X，WU J． Efficient callus induction and plant regeneration
from anther of Chinese narcissus (Narcissus tazetta L． var． chinensis Ｒo-
em) ［J］． Plant Cell Ｒeports，2005，24(7):401 －407．
［18］姜贺飞，张辉，李继爱，等．水仙离体培养及植株再生的研究进展［J］．
中国农学通报，2010，26(18):237 －241．
［19］LU G，ZOU Q C，GUO D P，et al． Agrobacterium tumefaciens － mediated
transformation of Narcissus tazetta var． chinensis［J］． Plant Cell Ｒeports，
2007，26(9):1585 －1593．
(下转第 5384页)
373542 卷 17 期 李素红等 欧洲水仙的繁殖技术研究
醇 (dihydrokaempferol，DHK)、二氢槲皮素(dihydroquercetin，
DHQ)和二氢杨梅素(dihydromyricetin，DHM))，分别生成无
色天竺葵素、无色矢车菊素和无色飞燕草素(翠雀素) ，最后
在各种修饰酶的作用下形成稳定的花色苷类物质。研究发
现，来自不同物种的 DFＲ结合底物的特异性有所不同，对不
同底物催化活性也不相同，因而植物中 DFＲ 的结构及催化
活性对形成不同花色具有决定性的作用。矮牵牛花色丰富，
是非常重要的园艺花卉植物，因其植株再生容易，遗传背景
清楚，因此也是研究植物花色的模式植物之一。试验利用不
同花色(红色及蓝色)矮牵牛品种中克隆获得的 PhDFＲ 基
因，构建不同筛选标记的植物表达载体，为了进一步研究这 2
个 DFＲ基因的功能及对植物花色性状的影响提供了良好的
前期基础，同时也为植物花色改良相关基因工程提供候选基
因及备选植物表达载体。
目前植物基因工程商业化应用最广泛、效果最好的就是
除草剂抗性基因和抗虫基因。除草剂抗性基因中研究应用
较多的是 Bar基因，其表达产物可以提供对草丁膦(PPT)类
除草剂的抗性，因此抗除草剂基因既可作为目的基因，又可
作为筛选标记基因。试验分别重组构建了 PhDFＲ 基因的
pCAMBIA2300系列和 pCAMBIA 3301 系列的 2 类植物表达
载，分别可以用于筛选剂卡那霉素和除草剂 Basta(PPT)的植
物遗传转化。经过酶切鉴定以及转基因植株 GUS 染色，基
本可以确定植物表达载体构建正确。
在构建载体的过程中，不仅要了解清楚载体上已有的酶
切位点，还要注意目的基因片段内部是否有和载体上相同的
酶切位点，这对于酶切连接至关重要。在试验中，在 PhDFＲ
基因上游起始密码子处设计了带有酶切位点 KpnI 的引物，
在下游终止密码子处设计了带有 XbalI的引物，便于将目的
基因引入实验室保存的 pCAMBIA2300-FT-GFP 载体，形成
35S启动子控制的 PhDFＲ-GFP 的融合基因表达盒。pCAM-
BIA2300系列载体是含有 Km 筛选标记的常用植物表达载
体，然而考虑到最终抗除草剂转基因农作物的生产应用优
势，又将 pCAMBIA2300-PhDFＲ-GFP中 PhDFＲ-GFP所在的表
达框用 EcoＲI-PstI 双酶切，插入到表达载体 pCAMBIA3301-
OCS中相应的位点，获得了含有目的基因 PhDFＲ 融合 GFP
的 pCAMBIA3301 系列表达载体。最终构建的 pCAM-
BIA3301-PhDFＲ-GFP含有报告基因 GUS、GFP以及除草剂抗
性基因 Bar的植物表达载体。其中 GUS筛选基因编码的 β-
葡萄糖苷酸酶，能够将作用底物 5-溴-4-氯-3-吲哚葡萄糖苷
酸(X-Gluc)转化形成不溶解的深色的靛蓝色物质，使得表达
GUS基因的部位呈现蓝色。此外，GUS基因可以作物融合蛋
白，可以定量分析，有方便快捷的特点。因此，GUS基因成为
目前广泛应用于植物转基因实验中的重要报告标记。有人
认为田间卡那霉素检测结合室内 GUS检测同时进行转基因
后代的纯合选育是一个切实可行的方法［11］。由于植物细胞
具有细胞壁，为使底物更好进入细胞，可采用抽真空促进渗
透的办法，如果不抽真空，在植物叶片上蓝色沉淀就会少一
些，有时候甚至检测不出来［12］。融合基因 GFP 具有优异的
报告基因的特点［13］:无需底物或辅助因子，容易检测，反应
灵敏;植物本身不含 GFP，不受假阳性干扰;荧光性质稳定，
便于观察;对转基因生物细胞无毒害，可借助荧光显微镜实
现活细胞非损伤性筛选;基因编码序列短，构建载体方便，构
建融合蛋白优势明显;广谱性，可用于不同属种的动植物及
微生物。因此结合 GFP可以对转基因植物进行进一步检测，
可以避免 GUS染色出现假阴性，同时也进一步提高了试验
的准确性，丰富了检测的方法，使实验结果验证更加充分
可靠。
试验同时构建了卡那霉素及 Bar筛选标记基因的 PhD-
FＲ植物表达载体，可用于适合不同筛选剂的植物遗传转化，
为进一步研究该基因在植物花色调控效应的功能及开展植
物花色改良基因工程研究奠定了基础;同时所构建的 pCAM-
BIA3301系列表达载体为植物基因工程科研工作提供了优
良的备选植物表达载体，其不仅可以通过 GUS 染色对转基
因植物进行快速鉴定，而且还融合了 GFP报告基因，使目的
基因的精确组织表达定位成为可能，载体上丰富的酶切位点
也适合于其他基因超表达载体的构建。
参考文献
［1］石少川，高亦珂，张秀海，等．植物花青素生物合成相关基因的研究及
应用［J］．植物研究，2011(5):633 －640．
［2］刘娟，冯群芳，张杰．二氢黄酮醇 4 －还原酶基因(DFＲ)与花色的修饰
［J］． 植物生理学通讯，2005(6):715 －719．
［3］HOLTON T A，COＲNISH E C． Genetics and biochemistry of anthocyanin
biosynthesis［J］． Plant Cell，1995，7(7):1071 －1083．
［4］NISHIHAＲA M，NAKATSUKA T． Genetic engineering of fiavonoid pig-
ments to modify fiower color in fioricultural plants［J］． Biotechnology Let-
ter，2011，33:433 －441．
［5］赵启明，李范，李萍．花青素生物合成关键酶的研究进展［J］．生物技术
通报，2012(12):25 －32．
［6］石少川，高亦珂，张秀海，等．植物花青素生物合成相关基因的研究及
应用［J］． 植物研究，2011(5):633 －640．
［7］李春雷，崔国新，许志茹，等．植物二氢黄酮醇4 －还原酶基因的研究进
展［J］．生物技术通讯，2009(3):442 －445．
［8］潘丽晶，张妙彬，范干群，等．石斛兰 dfr基因的克隆、序列分析及原核
表达［J］． 园艺学报，2010(1):129 －134．
［9］CHEN H，NELSON Ｒ S，SHEＲWOOD J L． Enhanced recovery of trans-
formants of Agrobacterium tumefaciens after freeze － thaw transformation
and drug selection［J］． Biotechniques，1994，16(4):664 －668，670．
［10］马雪梅，胥晓，李晓波，等．农杆菌介导快速、高效获得转基因烟草纯
合株系［J］．中国烟草学报，2012，18(4):13 －18．
［11］上官小霞，李燕娥，梁运生，等． GUS基因和 NPTII基因表达的相关性
及其在转基因棉花检测研究中的应用［J］． 棉花学报，2007(3):163 －
167．
［12］李新锋，赵淑清． 转基因植物中报道基因 GUS的活性检测及其应用
［J］． 生命的化学，2004(1):71 －74．
［13］吴沛桥，巴晓革，胡海，等．绿色荧光蛋白 GFP的研究进展及应用［J］．
生物医学工程研究，2009(1):
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪
83 －86．
(上接第 5373页)
［20］MALIK M． Comparison of different liquid /solid culture systems in the
production of somatic embryos from Narcissus L． ovary explants［J］． Plant
Cell ，Tissue and Organ Culture，2008，94(3):337 －345．
［21］魏开发．水仙胚性愈伤的获得及农杆菌介导 GUS 基因的遗传转化
［J］．南京林业大学学报:自然科学版，2009，33(4):33 －37．
［22］陈振光．中国水仙组织培养快速繁殖研究初报［J］．福建农学院学报，
1982，3(1):9 －13．
4835 安徽农业科学 2014年