全 文 ：第 2 1卷 第 ` 期
9 19 0 年 1 1月
海 洋 与 湖 沼
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嗯黍盗黍研究简报
羽藻叶绿体膜的纯化与多肤的初步研究 *
邹喻苹赵 原件小南* * 一 梁 峥 汤佩松
(中国科学院植物研究所 , 北京 )
(中国科学院海洋研究所 , 青岛 ) *
细胞膜系统 , 是细胞许多生命现象如收缩运动 、 信息传递 、 物质运输等的场所和调节
关键部位 。 七十年代首先在红细胞发现了膜骨架。 八十年代大多数红细胞膜蛋白已经提
纯 ,其功能亦已清楚即lo 在植物中 , P al o vi , , 等 ( 1 9 74 年 )在 N iet n a 细胞中观察到肌动
蛋白 ;阎龙飞等〔, ,1z先后从烟草维管束和黄瓜花粉中分离出肌动球蛋白、 肌动蛋白和肌 球
蛋白。 细胞器膜是生物膜系统的重要组成部分 , 但关于细胞器膜及其蛋白的研究 , 尚未见
诸报道。 本文以假根羽藻 (以下简称羽藻 )为材料 , 目的是获得一种良好的膜系统 , 以之
作为研究植物细胞器膜骨架的实验材料 ; 提取和纯化了羽藻叶绿体膜 , 并与纯化的菠菜
叶绿体膜蛋白的多肤成分作了比较。
一 、 材 料 和 方 法
新鲜羽藻 B r 夕。户5 15 c o r t i c u l a o s 于 1 9 8 a年 9 月初采 自青岛汇泉湾。 洗净后置冰箱
过夜或置净化海水中通气保存待用 。
称取 1 0 0 9 新鲜材料 , 剪碎后加人预冷过的 2 0 0m l 分离 介 质 中 ( T r i c i n 一 N a oH ,
2 5 m m o l / L : 山梨醇 , 3 3 o m m o l / L ; E D T A一 N a Z , Zm m o l / L ; gM C 12 , l m m o l / L ;
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1多 ; p H 为 7 . 9 ) , 充分搅拌后于 2 40 目尼龙绸过滤 。 滤液于 L x J 一 6 4一 01 型离心
机上以 1 0 0 r /m in 转速离心 1 m in , 除去淀粉和其他残渣。 上清液以 1 o o o r /m in 转速离
心 10 m in , 收集沉淀的粗叶绿体并悬浮在 4 0m l 上述介质中 , 待梯度离心纯化。
厂 梯度离心参照文献 [ 51 方法进行。 蔗糖密度梯度自上至下依次为 25 多 , 34 多 , 51 多蔗
糖溶液 , 蔗糖溶液含 T r i e i n 一 N a o H , 1 0m m o l / L , 哪 为 7 . 9 ; gM c 12 , 4m m o l / L 。 在
10Om l 离心管中分层铺放上述三种溶液各 Z o m l , 顶部加 l o m l 粗叶绿体 , 于 4 o o o r /m i n
离心 4m in , 用巴斯德吸管吸出上层梯度液并弃去 , 再分别吸出中层类囊体和下层完整叶
绿体 。分别用洗涤介质 ( T r ic n 一 N 刻。 H , l o m m o l/ L , 哪 ~ 7 . ;9 山梨醇 , 3 30 m . m o lz/ L )
缓慢稀释 , 于 4 o 0 r /m in 离心 l m in , 沉淀为完整叶绿体和类囊体。
叶绿体完整性测定采用文献 〔8j 方法。 以 Y sI 53 型 ( U . S . A ) 微量测氧仪监测放
氧速率。 光照 3 0 o o o l x 。 在 Zm l 侧定介质中 ,含 T r i s一 H CI , 1 0m m o l / L , p H ~ 7 . 5 ; 山
梨醇 , 3 3 o m m o l / L ; M g C 12 , s m m o l / L ; N a C I , l om m o l / L ; Na N 3 , 3产 m o l / L : K 3F e ( C N ) ` ,
-一 , . . . . . . ` . , . . . . .* 甲国科学院海洋研究所实验海洋生物开放研究实验室 ( E M B L ) 研究报告第 2 号。
获国家自然科学基金和 E M B L 基金支助。 `
收稿 日期 : 1 9 8 9 年 2 月 1 4 日 。
8 5 2侮 萍 与 湖 沼 2 1卷
lm mo / lL
。 叶绿素浓度为 0 7拼g /m l。 以放氧速率按文献 〔8 ] 计算叶绿体完整性乙 若
完整性低于8 0%, 进一步纯化时产率就会太低 。参照文献 [ 6 ]测定叶绿体细胞色素氧化酶
和过氧化氢酶活性 , 以检测叶绿体被污染程度 。 十二烷基磺酸钠聚丙烯胺凝胶电泳基本
按文献:7[ 〕试验 。 梯度胶浓度为 6一 1 5多 , 制备胶溶液为硼酸 , 夕H 一 & ;4 在梯度胶上加
一层高 cZ m 的堆积胶 , 浓度为 3多 ; 堆积胶溶液为 T r姑一 H CI , p H 一 6 . 8。 电泳缓冲液为
T ir s
一硼酸系统 。 电泳后 , 胶片用考马斯兰 R一 2 50 染色 , 以醋酸甲醇脱色 。 用 C S g lo 光
密度计于 5 9 , n m 扫描。 红血球膜和鸡素囊肌动蛋白均为 自制 。
二 、 结 果 和 讨 论
1
. 叶绿体完整性
制备的粗叶绿体分为低渗胀破的和完整的两组 。 由图 l 可以看封完整叶绿体 , 由于
铁氰化钾进人有障碍 , 所以放氧速率很低 ; 叶绿体膜破后 , 消除了障碍 , 放氧速率急剧
升高。 破膜叶绿体的放氧速率为 3 57n m ol / ( m g · m i n) ; 完整的叶绿体 , 放 氧 速 率 分
5 1 n m o l / ( m g
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。 叶绿体完整性为 56多。
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图 1 羽藻叶绿体完整性的测定
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。 . 胀破叶绿体的放氧 ; b . 完整的叶绿体的放氧 。
.2 叶绿体的纯化
粗叶绿体制剂经蔗糖密度梯度离心后 ,得层次分明的三层绿色溶液 (图版 I : A ) : 上层
为叶绿体被膜与类囊体混合物 , 中层为类囊体 , 下层为完整叶绿体。 离心和收集得到的纯
化的叶绿体和类囊体 ,其结果与文献〔51 用菠菜制备的叶绿体十分一致 。
.3 细胞色素氧化酶与过氧化氢酶活性
细胞色素氧化酶为线粒体标记酶 ,过氧化氢酶为过氧物酶体标记酶 。 分别测定了粗
叶绿体和纯化叶绿体制剂中两种酶的活性 。 纯化叶绿体的细胞色素氧化酶活性 , 比粗叶
绿体的降低约 8 倍 ;纯化叶绿体的过氧化氢酶活性甚微 (表 l ) 。 表明上述用蔗糖密度梯
度离心纯化的叶绿体 , 基本上无线粒体与过氧物酶体的污染 。 其纯度合乎研究叶绿体膜
蛋白的要求 。
` 期 邹喻苹等: 羽藻叶绿体膜的纯化与多从的初步研究5 83
表1 叶绿体中的细胞色素氧化醉及过暇化氮酶的活性
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叶绿体 细胞色素氧化酶 [ n mol/( mg· m in ) ]过氧
化氢酶
[解 mol/( mg· m in ) ]
粗叶绿体
纯叶绿休
6 17
。
28
7 6
。
7 7
9 4
.
86
才
2
.
28
. 4膜蛋白多胜成分的电泳分析
着重分析讨论膜骨架蛋白的主要成分即红细胞膜收缩蛋白( 。 带 , 24 OK D ; 声带 , 2 2〔
KD ) 及肌动蛋白 娜血 ) 在叶绿体膜中是否存在。
图版 I : B 中 , 1 是标准蛋 白 ; 2 是纯化的鸡素囊肌动蛋白 ,分子量为 45 K D ;7 是人红
细胞膜蛋白 , 最上面两条可能是收缩蛋白 。 带和夕带。 在完整菠菜叶绿体中 , 有明 显的
4 5 K D 蛋白带 〔图版 I : B ( , ) , 图 2。 〕 , 高分子量区有 a 带 ; 而在菠菜类囊体膜中 , 朽 K D
带模糊〔图版 I : B ( 6 )] , 高分子区的 。 , 夕带处均无明显染色带「图版 I : B ( 6 ) , 图 2 lb 。 在
完整羽藻叶绿体中 , 可见 朽 K D 带 [图版 I : B ( 3 ) , 图 2。 ] , 高分子量区的 a 带清晰可见 , 口
带微弱 ;而在羽藻李赓体中 ,4 5入 D 带及高分子鼻 价理带均参发瓤厚版 墓: B( 4 ), 覃多司 之图 Ze , “ f早人辉细卿掉蛋白和鸡素赓肌截蛋白扭描图 ,终为井终即扫娜参考 , 4 , K”
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图 2 羽藻和菠菜叶绿体膜蛋白电泳图谱的光密度扫描 、 卜
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· 。 a . 菠菜完整叶绿体 , 匕 菠菜的类囊体 ; ` ; 羽藻完整叶绿体 , d · 羽藻的类囊体 ; ,
e
. 人红细胞膜 ; f . 鸡素囊肌动蛋白 。
58 4海 洋 与 湖 沼 2 1卷
带及 a, 夕带很可能是定位在叶绿体的被膜上 。 这些分子量的蛋白是否就是膜骨架蛋白 ,
有待于免疫实验进一步证实 。
参 考 文 献
阎龙 飞 、王秀珍 、 滕晓月等 , 1 , 6 , 。 高等植物中的收缩蛋白。 甲国科学 1:4 6 01 一 60 8。
阎龙飞 、王秀珍、 滕晓月等 , 1 , 8 , 。 花粉中的肌动蛋白和肌球蛋白及其在花粉管伸长甲的作用。 科学通报
30 : 9 4 5一 9 4 8 0
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. 羽藻和菠菜叶绿体膜蛋白电泳图谱 : a . 94 K D ,
标准蛋白 , 2 . 鸡素囊肌动 蛋白 , 3 ·羽藻叶绿体 蛋白 ,
菠菜叶绿体蛋 白 , 6 . 菠菜类囊体蛋 白 , 7 . 人红细胞膜蛋 白。
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