全 文 ：利用扩增片段长度多态性(AFLP)研究坛紫菜的遗传变异①
杨　锐②＊＊＊　刘必谦③＊　骆其君　王亚军＊　周湘池＊　戴继勋＊＊
(＊宁波大学海洋生物工程研究所　宁波 315211)
(＊＊青岛海洋大学生命学院　青岛 266003)
摘　要　应用 AFLP 技术对浙江普陀列岛 、渔山列岛和南麂列岛野生坛紫菜 、福建野生厚
型及薄型以及栽培坛紫菜的两个表型分化类型进行了研究 。结果表明:坛紫菜的遗传变
异较为丰富 ,共记录了 528个位点 ,其中 16个为单态位点 ,其余的为多态位点 ,多态位点
比例达到 96.97%。其遗传距离与地域分布正相关 ,说明不同的环境因素可能是造成坛
紫菜遗传变异的主要因素 。对遗传距离进行 UPGMA 和 Neighbor-joining 聚类分析表明
具有薄型叶片性状的浙江野生坛紫菜和福建野生薄型坛紫菜聚合 ,而福建野生厚型与栽
培具厚型叶片 ,当地俗称为木耳菜的样本聚合。该结果基本清楚地反映了坛紫菜表型特
征的分化。栽培薄型叶片俗称鸡毛菜样本在不同聚类方法中分别于外侧并入不同的分
支。在福建野生坛紫菜与养殖坛紫菜的 AFLP 图谱中仅发现了三条与叶片性状相关的谱
带:具有厚型叶片性状的坛紫菜共有的 ACC-CAA(100)和 ACT-CAG(232),具有薄型叶
性状的坛紫菜共有的 ACC-CAA(490)。
关键词　坛紫菜 , AFLP , 遗传变异
0　引言
坛紫菜(Porphyra haitanensis)属于红藻门
(Rhodophyta)红毛菜科(Bangiacea)紫菜属(Pro-
phyra),是我国浙闽两省海区特有的地方种及主要
的栽培对象 ,每年创造较高的经济效益[ 1-3] 。目
前 ,浙江省栽培的坛紫菜主要是由福建海区引进的
自然种培育的。在养殖过程中明显地分化为两种类
型:生长慢 、叶片薄的鸡毛菜和生长快 、叶片厚的木
耳菜 。浙江沿海每年十一月份会出现持续时间不一
的高温回暖天气 ,俗称“小阳春” 。这段时间是栽培
紫菜腐烂坏死的关键时期。长势快的类型在“小阳
春”到来之前 ,可收获三茬品质较好 ,价格较高的优
质紫菜 ,从而降低了养殖风险 ,深受养殖户的欢迎 。
我们发现福建野生的坛紫菜中也
有薄型和厚型的分化 。由于栽培
坛紫菜中长势快慢的两种类型都
是由野生型分化而来的 ,如果利
用特异的分子标记找到与这一优
良性状相关的 DNA 片段或者基
因 ,进而了解与其相关的遗传变异信息 ,就可以最终
从这两类养殖对象中筛选并培育出新的栽培品系 ,
并且在生产中推广应用 。
AFLP(Amplified Fragment Length Polymor-
phism)技术结合了 RFLP 的可靠性与 RAPD的方便
性等优点 ,可重复性好 ,呈现典型的孟德尔遗传;每
个 AFLP 反应可检测的位点多达 50至 100个 ,信息
量极大 ,因此非常适合进行遗传多样性 、种质鉴定 、
标记辅助育种 、基因定位和快速构建遗传图谱等研
究[ 4-6] 。本研究利用 AFLP 技术对浙江和福建两省
的野生坛紫菜以及栽培坛紫菜进行初步分析 ,得到
可靠的 AFLP 指纹图谱 ,比较栽培类型与野生型之
间的遗传差异 ,以期找到特异性标记 ,为缩短育苗周
期 、提高选育准确性奠定基础 ,为坛紫菜品系培育 、
性状改良和分子标记辅助育种提供参考数据。
1　材料与方法
1.1　材料
实验用坛紫菜采自 1999 年 4 月至 2000 年 4
月 ,见表 1 ,其中包括福建野生坛紫菜厚型和薄型的
—83—
杨　锐等:利用扩增片段长度多态性(AFLP)研究坛紫菜的遗传变异
①②③ 联系人。
(收稿日期:2001-09-19)
女 , 1972年生 ,博士 ,助理研究员;研究方向:海洋动植物遗传工程。国家自然科学基金(49976030)、浙江省自然科学基金(398233)资助项目。
样本 。将紫菜新鲜叶状体洗净后晾干 ,塑料袋密闭 ,
-70℃保存。液氮研磨 ,用于基因组 DNA的提取 。
表 1　坛紫菜采集时间及地点
采集地点 叶片性状 时间
1-2 普陀列岛 薄 2000 年 4 月
3-4 渔山列岛 薄 1999年 11 月
5-6 南麂列岛 薄 1999 年 4 月
7-9(野生薄型) 福建莆田 薄 2000 年 4 月
10(鸡毛菜) 浙江象山 薄 2000 年 4 月
11-14(野生厚型) 福建莆田 厚 2000 年 4 月
15-16(木耳菜) 浙江象山 厚 2000 年 4 月
1.2　基因组 DNA 的提取及浓度测定
取约 30mg 液氮研磨的坛紫菜 ,采用改良的 Ge-
nomic DNA M inipreps Kit 法(NSBC-Sangon , cat #
sk252)提取基因组 DNA 。DNA 经 0.7%琼脂糖凝
胶电泳-EB染色测定浓度。
1.3　AFLP
AFLP实验方法参照 Vos等的方法(1995)[ 4] 。
药品均为 MBI 公司产品。选择性引物序列为:
EcoR I: GACTGCGTACCAATTC-ACA 、-ACG 、
ACT 、 -ACC;M se I:GA TGAGTCCTGAGTAA-
CAA 、-CAG 、-CTA 和-CAC 。凝胶电泳系统:Sequi-
Gen GT nickeic acid elect rophoresis cell (Bio-Rad),
4.5%的聚丙烯酰胺变性凝胶电泳。银染显色 ,
ScanM arker 9600扫描仪扫描并记录结果 。
1.4　数据统计与分析
将每个条带视为一个位点 ,统计位点总数 、多态
位点数及其在各群体中的分布 。将 DNA 条带的有
无转化成 1 ,0数据 ,计算不同个体间的遗传相似性
系数 S[ S=2Nxy/(Nx +Ny),其中 Nxy 为两个个体
共有的条带 ,Nx 和 Ny 分别为两个个体各自拥有的
条带]和遗传距离D(D=1-S),并且利用 Phylip软件
进行聚类分析。
2　结果
2.1　扩增结果
坛紫菜AFLP 分析中 ,在 16对引物组合扩增产
物中记录到 528 个位点 ,其中有 16个位点是单态
的。其多态比例达到96.97%。图 1 ,-2例举了坛紫
菜AFLP 部分引物组合的扩增结果。
2.2　遗传距离
坛紫菜个体间的遗传距离在 0.2318 至 0.6023
之间 ,平均为 0.4091。来自同一地点的个体之间遗
传相似系数较高 ,遗传距离较小。分布于浙江沿岸
不同地点的个体遗传距离较小 ,而养殖的两种类型
与福建野生的坛紫菜更为相似。
—84—
高技术通讯　2002.01
2.3　聚类分析
根据坛紫菜之间的遗传距离进行 UPGMA 聚
类分析(图 3-A)。基本可以得到两个大群。福建野
生薄型坛紫菜与浙江省三个地点的坛紫菜聚合成一
大群 ,而且在这一个 AFLP 大群中地理位置相近的
样本优先聚合 ,如普陀列岛和渔山列岛相近 ,来自两
地的四个样本两两聚合后再聚成一支 ,南麂列岛靠
近福建海域 ,因而在与本地样本聚合后 ,两地样本聚
成另一支。在另一个 AFLP 大群中 ,两个养殖木耳
菜样本优先聚合 ,而福建野生厚型的 4个个体聚合
后也与木耳菜分支汇合。而一个养殖鸡毛菜个体则
在外群与木耳菜厚型样本聚合 。
对该遗传距离进行 Neighbo r-joining 聚类分析
(图 3-B)获得了相似的结果 。木耳菜与福建野生厚
型的四个样本聚合成一个 AFLP 大群。浙江省沿海
野生样本与福建野生薄型个体聚合成一个AFLP 大
群 ,养殖鸡毛菜此时则在外侧并入这一大群。
2.4　具有筛选价值的特征性标记
在众多位点中 ,我们发现了具有筛选价值的特
征性标记:养殖木耳菜与福建野生厚型共有的:
ACC-CAA—100和 ACT-CAG —232;养殖鸡毛菜和
福建野生薄型所共有的:ACC-CAA —490。
3　讨论
3.1　坛紫菜的遗传变异
在王勇等(2000年)对坛紫菜的 6个丝状体品
系进行的 RAPD分析中 ,10个引物获得 93个位点 ,
仅有 5个位点是公共的 ,其余的多态位点占总位点
的 94.6%[ 7] 。贾建航(2000年)在对坛紫菜的 5 个
丝状体品系和 7个条斑紫菜 、一个半叶紫菜以及一
个寡精紫菜进行的 RAPD分析中 ,也获得 97.1%的
多态性位点[ 8] 。本研究中 ,在坛紫菜 528 个位点中
获得 16个单态位点 ,其余 96.97%的位点为多态位
点 。与前者的研究结果相近 ,这说明:用AFLP 技术
检测坛紫菜的遗传变异数据是较为可靠的 。而且利
用遗传距离进行聚类分析 ,无论用 UPGMA 或是
Neighbor-joining 法得到的聚类图基本一致 ,这也表
明该数据较为客观 。
坛紫菜的遗传变异较为丰富 ,而且两个栽培品
系个体之间具有一定的遗传差异 。遗传距离和聚类
分析的结果表明:坛紫菜的遗传相似程度与地域分
布相关 ,来自同一地区的个体先聚合 。该结果与王
勇对 4个福建野生坛紫菜丝状体品系和 2个浙江北
部栽培坛紫菜丝状体品系得到的结果相吻合。这说
明 ,不同的环境因素可能是造成坛紫菜遗传变异的
主要因素。
从外形上看 ,浙江野生的坛紫菜与福建野生薄
型坛紫菜较难区分 ,而浙江省的样本与福建野生薄
型坛紫菜聚合成一个 AFLP 大群 ,并且福建野生厚
型与养殖木耳菜聚合成一个 AFLP大群。从某种角
度来讲 ,坛紫菜这种聚类分析也基本清楚地反映了
表型特征的分化。养殖鸡毛菜在不同聚类方法中在
外侧并入不同的大群 ,这种若即若离的聚类关系似
乎在暗示 ,养殖中的这种分型正处于从遗传分化到
表型分化的过渡。当然由于实验中所采用的样本数
目有限 ,所以我们还不能轻易下结论 ,而且野生种厚
型与薄型这两种类型是否代表着亚种级的分化有待
更大量样本的深入分析 。
3.2　有筛选价值的分子标记的意义
在福建野生坛紫菜与养殖坛紫菜的AFLP 图谱
中仅发现了三条与生长性状相关的谱带:具有木耳
菜性状的坛紫菜共有的 ACC-CAA —100 和 ACT-
—85—
杨　锐等:利用扩增片段长度多态性(AFLP)研究坛紫菜的遗传变异
CAG —232 ,具有鸡毛菜性状的坛紫菜共有的 ACC-
CAA —490。这些条带可以作为筛选与生长性状相
关的标记或者基因的对象 。此外我们加大了研究样
本的数量 ,进行进一步的筛选 。有关这些片段的分
离和克隆的工作正在进行中。这些片段及其序列的
获得可以使得利用简单实验在育种及育苗过程中检
测所需的品系成为可能 ,从而大大提高选育的准确
性 ,缩短育种的周期 ,节省育种过程中的费用 ,为紫
菜养殖过程中品系培育和性状改良提供参考 。
参考文献:
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[ 8] 贾建航 , 王萍 ,金德敏等.RAPD 标记在紫菜遗传多样性
检测和种质鉴定中的应用.植物学报 , 2000 , 42(4):
403
Genetic Variation of Porphyra haitanensis by Applying AFLP
Yang Rui＊＊＊ , Liu Biqian＊ , Luo Qijun＊ , Wang Yajun＊ , Zhou Xiangchi＊ , Dai Jixun＊＊
(＊Marine Biotechnology Insi titution , Ningbo University , Ningbo 315211)
(＊＊College of Life Science , Ocean University of Qingdao , Qingdao 266003)
Abstract
In this study , AFLP technique w as applied to detect the genetic variat ion in the tw o types of cultured sam-
ples and the w ild samples of P.haitanensis from Zhejiang and two types of w ild samples f rom Fujian Provinces.
High genetic variation occurred in this species.Among 528 loci recorded , 16 were unique , the ratio of polymor-
phic loci w as 96.97%.The samples f rom the same location show ed a close genetic distance and jointed into each
o ther early in clustering , which suggested that the envi ronment facto rs might be the main effect on genetic vari-
ation in P .haitanensis.Similar cluster trees were obtained with UPGMA and Neighbor-joining methods.The
w ild samples f rom Zhejiang and Fujian provinces characterized by thin-thallus fo rmed a basic AFLP branch.The
cultivated thick-thallus samples , which w ere locally called muer-type laver and the w ild Fujian samples w ith
thick-thallus made the other AFLP branch.The cluster of P .hai tanensis basically reflected the differentiat ion
of mo rphologic t rai t.The cultured thin-thallus type(which were locally called jimao-type laver)jointed into dif-
ferent AFLP groups at the outside.Among those AFLP maps , ACC-CAA(100)and ACT-CAG(232)were
commonly existed in thick-thallus type both w ild and cultured , ACC-CAA(490)was shared by the thin-thallus
type.
Key words:P.haitanensis , AFLP , Genetic variation
—86—
高技术通讯　2002.01