全 文 ：文章编号:1000-8020(2009)05-0622-03 ·实验研究·
海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究
刘仁沿　许道艳　董玉华　梁玉波1
国家海洋环境监测中心 ,大连　116023
摘要:目的　建立间接竞争酶联免疫吸附分析(ELISA)方法测定海水样品和海洋贝类中赤潮毒素记忆缺
失性贝毒主要成分软骨藻酸(DA)。方法　采用碳二亚胺法 , 将半抗原 DA分别与载体蛋白卵清蛋白(OVA)
和牛血清白蛋白(BSA)偶联 , 得到包被抗原和免疫抗原。以 DA-BSA 做为免疫抗原 , 免疫 BALB c小鼠 ,制备
多克隆抗体 ,建立间接竞争 ELISA 方法分析检测海水样品和海洋贝类中的软骨藻酸。结果　最低检出限为
10.0ng ml(对于贝相当于 4μg g);海水样品回收率为 83.2%～ 124.7%, 批内变异系数在4.7%～ 5.9%之间;贝
类样品回收率为 85.9%～ 99.9%,批内变异系数 2.4%～ 7.1%之间。结论　建立的 ELISA 方法检测海洋贝
类中 DA可以满足国际规定的安全限值。
关键词:软骨藻酸　多克隆抗体　酶联免疫吸附分析　海产品
中图分类号:R155.51　　　　　　文献标识码:B
A indirect competitive ELISA to detect domoic acid in seawater and shellfish
LIU Renyan , XU Daoyan , DONG Yuhua , LIANG Yubo
National Marine Environmental Monitoring Center , Dalian　116023 , China
Abstract:Objective　A competitive enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)was developed for measurent
domoic acid(DA)in seawater and shellfish.Methods　DA was coupled to bovine serum albumin(BSA)and ovalbumin
(OVA)by carbodiimide reaction.DA-BSA as immunogen was injected in BALB c mice.Titres of the antisera against DA
were determinated using DA-OVA as coating ligand by ELISA method.After female BALB c mice were immunized six
times , the polyclonal antibodies anti-DA was obtained.The competitive indirect ELISA for domoic acid in shellfish and
seawaterwas established.Results　Under optimal condition , the detection limit of DA was 10.0ng ml(equal 4μg g
shellfish meat).The recovery of domoic acid added in seawater was 83.2%-124.7% with a coefficient of variation of
4.7%-5.9%, the recovery of domoic acid added in shellfish was 85.9%-99.9% with a coefficient of variation of
2.4%-7.1%.
Key words:domoic acid , poly clonal antibody , enzyme-linked immunosorbent assay
基金项目:国家 863计划项目(No.2006AA09Z163);国家专项资助
项目(No.908-01-ZH3)
作者简介:刘仁沿 ,女 ,博士 ,研究员 , 研究方向:海洋环境化学和
生物化学研究 , E-mail:ryliu@nmemc.gov.cn
1 通讯作者:梁玉波 , E-mail:ybliang@nmemc.gov.cn
　　藻毒素记忆缺失性贝毒(amnesic shellfish poisoning , ASP)
是有毒赤潮硅藻分泌产生的毒素。其主要活性成分为软骨藻
酸(domoic acid , DA)是一种氨基酸类毒素 , 有 7 种异构体。有
毒藻类可以直接释放 DA 到海水中 , 滤食性海洋贝类可在体
内积累 DA ,导致人和其他海洋哺乳类动物中毒 , 软骨藻酸和
作为神经递质的谷氨酸一样具有引起神经细胞兴奋的功能 ,
但其强度是谷氨酸的 100 倍 , 软骨藻酸可能引起中枢神经系
统海马区和丘脑区与记忆有关区域的损伤 , 从而导致记忆的
丧失甚至死亡。 1987 年首次在加拿大发生食用贝类中毒并
导致 3人死亡 , 研究表明引起中毒的活性成分是软骨藻酸 ,一
种早先曾在红藻中分离出的氨基酸类物质 , 这也是首次发现
由硅藻毒素引起的中毒事件[ 1] 。能够产生软骨藻酸的硅藻主
要是 Pseudo-nitzschia 属中的一些种。这些有毒藻最初在北美
发现 , 随后报道在欧洲 、新西兰等海域存在 ,迄今为止 , 几乎在
世界各大海域均发现产毒硅藻 ,而且在许多地区的贝类中检
出了软骨藻酸[ 2～ 4] 。
记忆缺失性贝毒的分析方法主要有色谱方法 、动物实验
法及免疫方法等。酶联免疫分析(indrect competitive enzyme-
linked immunosorbent assay , ELISA)因其灵敏 、快速和操作简单
的优点 , 近年在分析领域得到了快速大规模发展 ,国内只有 1
篇关于记忆缺失性贝毒的免疫分析研究[ 5] 。本文利用牛血清
白蛋白为载体 , 合成免疫抗原 , 制备多克隆抗体 ,建立了记忆
缺失性贝毒主要成分软骨藻酸的酶联免疫分析方法 , 为中国
有毒赤潮监测研究和保障海产品安全提供快速检测技术产品
奠定基础。
1　材料与方法
1.1　试剂和仪器
622　
第 38卷　第 5 期
2009年　9 月
卫　生　研　究
JOURNAL OF HYGIENE RESEARCH
　　　 Vol.38　No.5
Sep.　2009
BALB c小鼠购自大连医科大学动物实验中心;DA 标准
购自 Biomol 公司;水溶性碳化二亚胺 EDC [ 1-ethyl-3-(3-
dimethy laminopropyl)carboimide hydrochloride] 、N-羟基琥珀酰亚
胺(N-hydroxysuccinimide , NHS)、牛血清白蛋白(bovine serum
albumin , BSA)、卵清白蛋白(ovalbumin , OVA)、Freund , s 完全和
不完全佐剂 、聚乙烯醇(polyvinyl alcohol , PVA)均购自 Sigma公
司;辣根过氧化物酶(horse radish peroxidase , HRP)标记羊抗鼠
IgG购自华美公司;3 、3、 5、5-四甲基联苯胺(3 , 3 , 5 , 5-
Tetramethylbenzidine , TMB)购自 Fluka 公司;Thermolabsystems 酶
标仪和洗板机;JASCO 紫外 可见光分光光度计 V-550。
1.2　方法
1.2.1　半抗原-载体蛋白偶联物的合成　将 DA溶于少量二
甲基亚砜中 ,加入 EDC和 NHS , 25℃反应 1.5h 后 ,加入溶于硼
酸盐缓冲液(pH9.0)的卵清白蛋白(OVA), 25℃反应 3h。将反
应混合物移入透析卡中透析 3 天 , 4℃, 每 12h 换液 1 次。按
文献[ 6] 方法测定反应前后的自由氨基数 ,得到偶联物的摩尔
分子比。 透析物分装后 , -20℃保存。 DA-BSA 偶联方法
同上。
1.2.2　免疫小鼠制备抗血清　以 DA-BSA 为免疫原 , 免疫 6
～ 8 周龄的雌性 BALB c 小鼠。 首次免疫用 400μl DA-BSA
(0.55mg)与等体积完全弗氏佐剂 ,充分乳化后制成乳浊液 ,腹
腔注射小鼠 ,第 3 、5、7、9 、11 周取同量 DA-BSA 与等体积不完
全弗氏佐剂充分乳化 ,腹腔注射。取尾血测定小鼠血清效价。
取同量的 DA-BSA的 PBS 溶液腹腔注射加强免疫 , 3 天后杀死
小鼠取血 ,放置沉降 3h ,离心 , 取上层血清 , 加等体积甘油 , 分
装 , -20℃保存待用。
1.2.3　酶联免疫吸附分析方法(ELISA)测定血清滴度　建立
酶联免疫吸附分析方法测定血清效价(滴度)。用 DA-OVA偶
联物作为包被抗原 ,用碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释适当浓度添
加到 96 孔酶标板中 , 每孔 100μl , 4℃过夜;弃去残液 , 96 孔酶
标板在洗板机上洗涤(洗液为 PBS-Tween20)3 次 、拍干 , 用 1%
的PVA-PBS 溶液 300μl封闭 , 37℃ 3h , 封闭好的 96 孔酶标板
可保存在 4℃数周待用;测定时 , 弃去封闭液 , 洗板 3 次 , 拍
干 ,加入适当稀释的多克隆抗血清 , 每孔 100μl , 37℃温箱中孵
育 lh;洗板 、拍干 , 加入适当稀释的酶标羊抗鼠第二抗体 , 每孔
100μl ,37℃孵育 40min;洗板 、拍干 , 每孔加 TMB 底物溶液
100μl , 37℃显色 12min , 以 2mol l H2SO4 每孔 50μl 中止反应 ,
450nm 波长测量吸光值(A)。
1.2.4　DA标准溶液的配制　分别配制不同浓度的 DA 标准
溶液:用蒸馏水溶解 DA ,配成 200μg ml的储备液 ,用 PBS 稀释
成各浓度的使用液:7.8、15.6 、31.25 、62.5、125、250、500 和
1 000ng ml。
1.2.5　间接竞争酶联免疫吸附方法(idc-ELISA)分析 DA 含量
　96 孔酶标板的包被及封闭同血清效价测定。测定时每孔
加入 50μl适当稀释的多克隆抗血清 ,再加入 50μl DA标准溶
液或待测样品溶液 , 混匀 , 37℃孵育 1h;洗板 、拍干 , 加入适当
稀释的酶标羊抗鼠第二抗体 , 每孔 100μl , 37℃孵育 40min;洗
板 、拍干 , 每孔加 TMB 底物溶液 100μl , 37℃显色 12min , 以
2mol L H2 SO4 每孔 50μl中止反应 , 450nm 波长测量 A 值。
1.2.6　高效液相色谱-紫外方法分析 DA　称取一定量加入
DA标准的贝类匀浆 ,按 1∶4(加入甲醇水溶液(50∶50)抽提 , 65
～ 70℃加热 20min ,冷却 , 超声 10min , 离心 , 取上清液 , 0.45μm
过滤 ,HPLC 分析。海水样直接 0.45μm 过滤 ,上机分析。
HPLC 条件为 , Prodidgy 5μm ODS3 100A 250×4.6mm 色谱
柱 ,温度 35℃, 流动相为乙腈 12%、水(含 0.1%三氟乙酸)
88%, 流速 0.65ml min , 紫外 240nm 检测。
2　结果
2.1　DA与载体蛋白偶联的分子比
根据反应前后自由氨基测定的结果 ,计算得出 DA与 BSA
和 OVA结合的分子比是 21∶1 和 15∶1。
2.2　免疫小鼠血清效价
以 DA-BSA 为免疫抗原 , 免疫 6 次的 BALB c小鼠的血清
对 DA-OVA的效价大于 10 万。
表 1　不同稀释倍数 DA-BSA免疫多克隆抗血清的吸光值(A)(1)
Table 1　The absorbance value of polyclonal
serum(DA-BSA)serially diluted
稀释比例 1∶2 000 1∶4 000 1∶8 000 1∶1 6000 1∶32 000
A 2.887 2.551 1.279 1.208 1.105
　　注:(1)不同浓度的血清均用 1%的PVA稀释。
　　根据表 1 的结果 ,选择 1∶5 000 ～ 1∶3 万的稀释比例完成
做 DA 的添加回收率等实验。
2.3　间接竞争 ELISA 法分析 DA
包被抗原 DA-OVA的最佳稀释度是 1∶1000;抗DA 多克隆
抗血清最佳稀释倍数为 1:5 000;底物显色的时间为 12min。
以抗原 DA 标准溶液浓度为横坐标 , 以其吸光度值为纵
坐标 , 绘制标准响应曲线(图 1)。
图 1　DA的响应曲线
Figure 1　Working curve of DA
　以抗原 DA 标准溶液浓度的对数值为横坐标 , 以抑制率
(A0-A) A0 为纵坐标 , 绘制标准抑制曲线(图 2)。DA 浓度的
对数值与抑制率的相关系数为 0.9969。
图 2　DA的抑制曲线
Figure 2　Inhibition curve of DA
　
2.4　海水和扇贝萃取液的添加回收率
海水和生物基质可能会对抗体抗原结合反应有影响 , 所
第 5期 刘仁沿 ,等.海水和贝类中软骨藻酸的酶联免疫吸附分析方法研究 623　
以用PBS 将海水和扇贝匀浆稀释不同的比例 , 试验不同比例
的海水及贝的萃取液对多克隆抗血清反应的影响。结果表明
稀释倍数大于 100 , 对结合反应无影响。
取一定量的 DA标准液 , 添加到扇贝匀浆和海水中 , 扇贝
匀浆按 1∶4 用 PBS 萃取 ,然后用 PBS 稀释 100 倍 ,使其终浓度
分别为 40、200 和 400ng ml , 用建立的间接竞争 ELISA方法测
定DA的含量 ,与添加的 DA 量比较 , 计算回收率。扇贝匀浆
萃取液中 DA回收率 85.9%～ 99.9%, 变异系数 3.4%～ 7.1%
之间;DA添加在海水中的回收率 83.2%～ 124.7%,变异系数
4.7%～ 5.9%之间(表 2)。
表 2　ELISA 方法测定海水和扇贝匀浆中添加 DA的回收率
Table 2　Recovery of DA added in scallop and seawater
样品 添加浓度(ng ml) 测定次数
平均回收率
(%)
变异系数
(%)
扇贝 40 5 90.2 3.396
200 3 85.9 7.127
400 3 99.9 2.397
海水 40 5 83.2 4.880
200 3 124.7 5.943
400 3 94.0 4.690
　　
2.5　HPLC方法与 ELISA方法的比较
分别用 ELISA 方法和 HPLC 方法分析 6 个添加 DA 的样
品 ,用 SPSS 11.0软件经成对 t 检验 , 95%CI , P<0.001 , 2种分
析方法差异不显著。
3　讨论
目前 ,国内应用酶联免疫方法并应用于 DA的测定只有 1
篇报道。可能因为 DA是小分子 , 本身不具有免疫原性 , 必需
偶联到合适的大载体上 , 而合成高质量的人工抗原有一定的
困难 , 以及标准品的匮乏都限制了免疫技术方法的研究。本
实验成功的合成了 DA-BSA和 DA-OVA两种抗原 , 分别用做免
疫抗原与检测抗原 , 免疫 BALB c小鼠后获得效价很高的多克
隆抗体 , 并建立了间接竞争 ELISA方法 , 简易快速分析海水及
生物样品中 DA的含量。
ELISA法与传统的动物生物法及色谱方法相比较 , 更快
速经济 , 可以满足大批量样品的快速筛查需要。本研究建立
的 ELISA方法中 DA 的浓度与吸光值具有较强的相关性 , 相
关系数 R>0.9;分析 DA 最低检测限可达 10ng ml(对于贝相
当于 4μg g 贝肉), 可以满足国际规定的 20μg g 的安全限值;
检测不同介质(海水 、扇贝萃取液)中 DA 的回收率在 83.2%
～ 124.7%之间 ,测定 DA 的有效范围为 10～ 1 000ng ml。
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trinitrobenzenesulfnic acid [ J] .Analy Biochem , 1966 , 14:328-336.
收稿日期:2009-02-10
文章编号:1000-8020(2009)05-0624-04 ·调查报告·
15 142名农村 7岁及以下儿童营养不良现状及影响因素分析
曾嵘　牟劲松1　罗家有1, 2　杜其云3　吴虹3　张莉4　龚正涛5
中南大学湘雅医院 ,长沙　410078
关键词:农村儿童　营养不良
中图分类号:R153.2　　　　　　文献标识码:A
作者简介:曾嵘 ,女 ,本科 ,副教授 ,研究方向:儿童营养 、食品与药
品
1 中南大学公共卫生学院儿少卫生与妇幼保健系
2 通讯作者:罗家有 , E-mail:jiayouluo@126.com
3 湖南省妇幼保健院
4 河南省卫生厅
5 湖北省卫生厅
　　自改革开放以来 ,中国儿童营养和健康水平有了较大改
善。然而 , 在部分农村地区 , 儿童营养不良现象仍很严重。据
文献报道 , 营养不良对儿童未来生存和劳动生产力产生影
响[ 1] 。为了解中国中西部地区农村儿童近期的营养状况 ,
2007 年 9月至 2008 年8 月 ,在中西部地区 7个省 , 对农村部分
地区 7 岁及以下儿童营养不良状况进行调查 , 探讨其营养不
良现状及其主要的影响因素。
1　对象与方法
1.1　调查对象与选择
根据“我国农村部分地区留守儿童营养与健康调查”总体
方案设计 , 采用多阶段分层整群随机抽样方法进行抽样。首
先 , 参照中国人民大学人口与发展中心提供的我国留守儿童
地区分布资料[ 2] , 在留守儿童相对集中的四川 、重庆 、贵州 、江
624　 　　卫　　生　　研　　究 第38卷