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第 39 卷第 2 期
2015 年 2 月
水 产 学 报
JOUＲNAL OF FISHEＲIES OF CHINA
Vol． 39，No． 2
Feb．，2015
文章编号:1000 － 0615(2015)02 － 0182 － 11 DOI:10． 3724 /SP． J． 1231． 2015． 59419
收稿日期:2014-08-07 修回日期:2014-11-15
资助项目:国家“八六三”高技术研究发展计划(2012AA10A411);国家自然科学基金(41176151，41276177) ;福建省种业创新与产业
化工程(2014S1477-10)
通信作者:谢潮添，E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的
克隆及表达特征分析
陈玉婷， 徐 燕， 纪德华， 陈昌生， 谢潮添*
(集美大学水产学院，福建 厦门 361021)
摘要:小分子热激蛋白(sHSP)不仅在应激条件下高效表达，还在正常状态的细胞中广泛存
在，参与一些重要细胞生理活动的调节。为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子机
制，本研究以坛紫菜转录组测序获得的 unigene 序列为基础，采用 ＲACE 或直接 PCＲ 扩增，克
隆获得了坛紫菜 2 种 sHSP的全长基因:PhHsp22 和 PhDnaJ。序列分析结果表明，PhHsp22 序
列全长 857 bp，包含一个 519 bp 的开放阅读框，所编码的多肽包含 172 个氨基酸，分子量为
19． 1 ku，等电点为 5． 24(收录号:KM102540);PhDnaJ 序列全长 1 616 bp，包含一个 1 290 bp
的开放阅读框，所编码的多肽包含 429 个氨基酸，分子量为 46． 1 ku，等电点为 6． 43，属于
Hsp40 亚家族(收录号:KM102541)。基因表达水平的定量分析结果表明，两个基因在高温胁
迫不同时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出一致的表达模式，即在胁迫初期表达
水平显著上调，但随着胁迫的持续，这两个基因的表达水平开始逐渐下调。结果表明，这 2 个
基因在逆境胁迫下的表达可能存在一个反馈调节机制。
关键词:坛紫菜;小分子热激蛋白;ＲACE;荧光定量 PCＲ
中图分类号:Q 785;S 917． 3 文献标志码:A
热激蛋白(heat shock proteins，HSP)是一类
广泛分布于各类生物细胞内且高度保守的蛋白分
子，主要行使分子伴侣、应激防御和稳定细胞结构
等功能，不仅受环境胁迫的诱导，也参与细胞各项
正常生理活动［1］。根据分子量、序列同源性以及
生物学功能等的不同，大致可将 HSP 分为 5 个家
族:HSP100，HSP90，HSP70，HSP60 及小分子 HSP
(sHSP)［2］。
植物中的 sHSP 均由核基因编码，是一组分
子量为 12 ～ 43 ku，且含有保守结构域的蛋白质，
它在生物体内广泛分布，是保守性最差的一类热
激蛋白分子家族，与植物中其他家族的热激蛋白
相比，sHSP 在结构和功能上都具有多样性［3 － 4］。
sHSP不仅可在应激条件下高效表达，增强细胞对
逆境的耐受能力和恢复能力，充当分子伴侣还在
正常细胞中广泛存在，参与一些重要的细胞生理
活动，包括维持细胞结构的稳定、参与细胞信号传
导和 发 育 调 控 等［4］。目 前，已 从 拟 南 芥
(Arabidopsis thaliana)、水稻(Dryza sativa)、小麦
( Triticum aestivum )［5］、 莱 茵 衣 藻
(Chlamydomonas reinhardtii )［6］ 和 列 紫 菜
(Porphyra seriata)［7］等植物中克隆获得了多个
sHSP基因。但总体而言，sHSP 仍是目前研究相
对较少的一类热激蛋白质分子。
坛紫菜(Pyropia haitanensis)是分布于潮间
带中高潮区的一类大型红藻，每天伴随着潮汐的
涨落，需要经历反复的失水和复水过程，大潮时干
露在空气中的时间长达 4 h 以上。在干出失水
时，坛紫菜藻体需面对盐度、失水、强光照和紫外
辐射等多种非生物胁迫的影响，因此其必须具备
极强的逆境耐受性［8 － 9］。同时，随着全球气候变
暖问题的日趋严重，近年来频繁出现的秋季高温
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2 期 陈玉婷，等:坛紫菜两种小分子热激蛋白(sHSP)基因的克隆及表达特征分析
回暖严重影响了坛紫菜栽培的开展，水温过高导
致坛紫菜幼苗或成菜发生病烂，严重减产［10 － 12］。
坛紫菜在逆境胁迫条件下基因［13 － 14］和蛋白［12，15］
表达谱的分析结果均表明坛紫菜对失水和高温胁
迫的抗性与 sHSP 的上调表达密切相关，因此为
研究坛紫菜对失水和高温胁迫的应答机制，分离
和克隆胁迫应答相关基因，并分析其在逆境胁迫
下的表达水平变化是研究的重要环节。本研究是
在坛紫菜转录组学研究［16］的基础上，对坛紫菜两
条 sHSP基因(PhHsp22 和 PhDnaJ )进行全长克
隆，并通过实时荧光定量 PCＲ 技术(qPCＲ)测定
基因在高温和失水胁迫下的表达水平变化，分析
其在坛紫菜胁迫应答中的作用，以为坛紫菜逆境
胁迫响应机制的研究提供依据。
1 材料与方法
1． 1 坛紫菜样品及胁迫处理
实验材料为人工杂交选育获得的坛紫菜耐高
温型品系 Z-61［17］，取自福建省坛紫菜种质资源
库。将坛紫菜 Z-61 叶状体在适宜温度下培养，培
养 Z-61 叶状体的条件为:温度 21 ℃，光照强度
50 ～ 60 μmol /(m2·s)，光照周期 12L∶ 12D，(隔 2
天更换 1 次过滤新鲜海水)。待叶状体生长至
(15 ± 2)cm 时，选取叶面平滑、色深有光泽、无斑
点烂洞且处于旺盛生长期的健康藻体置于(29 ±
0． 5)℃的恒温光照培养箱中进行高温胁迫处理
(光照强度 50 ～ 60 μmol /(m2· s)，光照周期
12L∶ 12D)3 h 后作为实验组，提取总 ＲNA，并反
转录成 cDNA 后用于 PhsHsp22 和 PhDnaJ 基因
的全长克隆。
另取一组(15 ± 2)cm 的完整藻体置于(29 ±
0． 5)℃的恒温光照培养箱中分别进行高温胁迫
处理(其余培养条件同正常条件)0、3、6、12、24 和
48 h后，提取总 ＲNA，用于高温胁迫条件下基因
表达水平的 qPCＲ分析。
同时，再取一组藻体，用纱布轻压吸干藻体表
面水分后，置于干燥纱布上，放于 21 ℃，光照强度
5 060 μmol /(m2·s)的干燥箱内干燥失水。根据
预实验确定的干燥时间，分别取样失水率为 0%、
15%、30%、45%、60%、75%和 90%的样品和干
燥失水至失水率为 90%后再浸泡于新鲜海水中
培养 30 min 后(复水)的样品进行总 ＲNA 的提
取，用于失水胁迫条件下基因表达水平的 qPCＲ
分析。失水率计算公式为:失水率(%)=(鲜重
－失水后藻体重)/(鲜重 －干重)× 100
以上每个处理，设置 3 个平行。
1． 2 引物及其序列
全长基因 ＲACE 扩增、全长验证，阳性克隆
筛选以及基因表达水平 qPCＲ分析所采用的引物
序列(表 1)，由生工生物工程有限公司合成。
表 1 实验所用引物的名称和序列
Tab． 1 Names and sequences of primers in this experiment
用途
usage
基因
gene
引物名称
primer name
引物序列(5-3)
sequences
全长扩增
ＲACE
PhHsp22
Ｒ225’ CGCCTTGATAGCCTCCACAT
Ｒ223’ TTTCCCAGTCCTACCGCCTTCC
全长验证
head to toe
PhHsp22
PhDnaJ
H22F ACATGGGGCACTTACCCATCCACA
H22Ｒ TGCCACAAAGCATTCGAGAGTATCG
H40F TTGGTTTTGGTCTGGTGGCA
H40Ｒ GCGGAATGAAGACAGCAACA
定量分析
qPCＲ
PhHsp22
PhDnaJ
Q22F TTTCCCAGTCCTACCGCCTTCC
Q22Ｒ TCGCAATCGTCCGCTTCTCC
Q40F GATCCACCACATGCAGATTG
Q40Ｒ TGTGCACCTCCAGTACCTTG
内参
internal control
PhUBC
UBCF TCACAACGAGGATTTACCACC
UBCＲ GAGGAGCACCTTGGAAACG
阳性克隆筛选
validate of positive clone
ＲV-M GAGCGGATAACAATTTCACACAGG
M13-20 CGACGTTGTAAAACGACGGCCAGT
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1． 3 总 ＲNA的分离纯化
收集坛紫菜藻体 0． 1 g，经滤纸吸干和液氮研
磨后，采用 E． Z． N． A 植物 ＲNA 提取试剂盒
(OMEGA，德国)提取各样品的总 ＲNA。经凝胶
电泳检查所提取总 ＲNA 的完整性，并在 Cary50
紫外分光光度计上分别测定 OD260和 OD280值，根
据测定结果计算 ＲNA 的浓度，判断核酸和蛋白质
的污染情况。
1． 4 PhHsp22 基因的全长克隆及验证
根据坛紫菜转录组(NCBI BioProject ID:
GADD00000000)unigene 的注释结果［16］，筛选出
一条注释结果为莱茵衣藻 Hsp22E 的 unigene
(CL559． Contig1)序列作为 PhHsp22 全长克隆的
核心序列。根据核心序列，分别设计 PhHsp22 的
5和 3-ＲACE 扩增的特异性扩增引物(表 1)，按
照 SMAＲTer ＲACE cDNA Amplification Kit 试剂
盒(Clontech，美国)的说明分别进行两个基因的
5和 3-ＲACE 扩增。将 ＲACE 扩增的目的片段
切胶回收、转化至 E． Coli DH5α 感受态细胞中，
经蓝白斑筛选和阳性克隆验证后送往大连宝生物
有限公司进行测序。并根据测序获得的基因 5和
3 片段序列重叠区，采用 DNAMAN 5． 2． 2
(Lynnon BioSoft)软件进行拼接，获得 PhHsp22
的全长序列。根据拼接获得的全长序列，设计全
长验证引物(表 1)，通过反转录获得的 cDNA 为
模板，进行普通 PCＲ 扩增，同样将扩增产物进行
切胶回收、转化和测序，并将测序结果与拼接结果
进行比对，以验证全长克隆的正确性。
1． 5 PhDnaJ基因的全长克隆及验证
根据坛紫菜转录组 unigene 的注释结果，筛
选出一条注释结果为条斑紫菜(P． yezoensis)DnaJ
(HSP40)的 unigene(Unigene3238)，经序列比对
分析发现该 unigene 序列包含一个完整的编码
区，由此以该序列为基础，设计全长验证引物，通
过反转录获得的 cDNA 为模板，进行普通 PCＲ扩
增，将扩增产物进行切胶回收、转化和测序，并将
测序结果与 Unigene3238 序列进行比对，以确定
PhDnaJ的全长序列。
1． 6 PhsHsp基因的生物信息学分析
对所获得的全长基因序列利用 NCBI的 Blast
程序进行序列同源性检测，并采用 OＲF Finder
(http:∥www ． ncbi． nlm． nih． gov /gorf /gorf． html)
软件分析各基因的开放阅读框(OＲF)和所编码
氨基酸序列;使用在线软件 PＲOSITE(http:∥
prosite． expasy． org /)，InterProScan(http:∥www ．
ebi． ac． uk /Tools /pfa / iprscan /)和 PrediSi(http:∥
www ． predisi． de)查找基因序列的保守位点和信
号肽序列;采用 Clustal X ［18］进行氨基酸多重序
列比对，并采用 MEGA 5． 10［19］软件分别构建了
PhHsp22 和 PhDnaJ蛋白的系统进化树。
1． 7 PhsHsp基因表达水平的 qPCＲ分析
分别根据各基因序列设计 qPCＲ 正反向引
物，并以 PhUBC 基因作为内参(表 1)，进行
PhHsp22 和 PhDnaJ 基因在高温和失水胁迫条件
下表达水平的 qPCＲ分析。
提取的各样品总 ＲNA 按 PrimeScript ＲT
reagent kit(TaKaＲa，大连)的说明书进行操作。
25 μL 的反应体系包含:12． 5 μL 2 × SYBＲ
Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaＲa)，0． 2 μmol /L 引物
和 2 μL 反转录产物。扩增程序为 95 ℃变性 1
min;95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，40 个循环。循环结束
后从 55 ℃缓慢升温至 95 ℃，绘制溶解曲线。荧
光定量 PCＲ 扩增在 ABI7300 型定量 PCＲ 仪
(Applied Biosystems，美国)上进行。
以 10 ×梯度稀释的 cDNA 为模板进行定量
PCＲ扩增，制作 PhHsp22、PhDnaJ和内参基因的标
准曲线。每次反应都设置阴性对照和无模板对照，
每个反应设 3 个平行复孔。应用 Excel 和 SPSS
13． 0软件对试验数据进行统计分析，并采用单因
素方差分析(One-Way ANOVA)和最小显著差异
法(LSD)比较不同数据组间的差异，P ＜ 0． 05 表示
存在差异显著，P ＜0． 01表示存在极显著差异。
2 结果与分析
2． 1 PhsHsp的全长克隆
以坛紫菜 CL559． Contig1 序列为核心，通过
ＲACE扩增和测序，获得一条长度约为 500 bp的 5-
末端序列(图 1-a)和一条约为400 bp的3-末端序列
(图 1-b)，根据两条末端序列的重叠区，拼接获得了
一条长度为 857 bp的全长序列，经过全长序列验证
(图 1-c)和 Blast 比对，确认该基因为坛紫菜的
HSP22 基因，命名为 PhHsp22。该基因已提交至
GenBank数据库中(收录号:KM102540)。通过 OＲF
Finder软件分析发现，该基因序列 136 ～654个碱基
为完整的开放阅读框(open reading frame，OＲF)，可
编码包含172个氨基酸，分子量为19． 1 ku，等电点为
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5． 24的蛋白质。Predictprotein程序预测 PhHsp22所
编码蛋白的二级结构中构成片层和环状的氨基酸残
基分别占总氨基酸残基的比例为 31． 40%和68． 60%
(图 2)。
图 1 PhsHsp22 扩增产物电泳图
(a)PhHsp22 的 5-ＲACE扩增产物，(b)PhHsp22 的 3-ＲACE 扩增产物，(c)PhHsp22 的全长扩增产物，(d)PhDnaJ 的全长扩增产
物。1 和 2、3 和 4 以及 5 和 6 分别为实验重复
Fig． 1 Agarose electrophoresis of ＲACE or Head to toe products of PhsHsp22
(a)5-ＲACE amplification products of PhHsp22，(b)3-ＲACE amplification products of PhHsp22，(c)Head to toe amplification products
of PhHsp22，(d)Head to toe amplification products of PhDnaJ． 1 and 2，3 and 4，5 and 6 were biological replicates，respectively
图 2 PhHsp22 蛋白氨基酸序列的多重序列比对
灰色阴影部分为 PhHsp22 蛋白的保守区，下划线部分则为 PhHsp22 蛋白的 α-晶体结构域，PhHsp22 蛋白二级结构中的黑色带和小
圆点分别表示片层和环状结构
Fig． 2 Multi-alignment of amino acid sequence of PhHsp22
The gray sections show the conserved regions of PhHsp22，and the α-crystallin domain is underlined． The ribbons and dots in the secondary
structure of PhHsp22 denote strands and coils，respectively
以转录组Unigene3238序列为基础，在基因序列
两端设计特异性引物扩增得到了一条长度约为
1 600 bp的基因片段(图 1-d)，经克隆、转化和测序后
比较发现其与转录组拼接获得的 Unigene3238 序列
完全一致，并经 Blast 比对，确认该基因为坛紫菜的
DnaJ 基因，命名为 PhDnaJ。该基因已提交到
GenBank数据库中(收录号:KM102541)。该基因序
列全长 1 616 bp，通过 OＲF Finder软件分析发现，该
基因序列 263 ～ 1 552个碱基为完整的 OＲF，可编码
包含429个氨基酸，分子量为46． 1 ku，等电点为6． 43
的蛋白质。Predictprotein 程序预测 PhDnaJ 所编码
蛋白的二级结构中构成螺旋、片层和环状的氨基酸
残基分别占总氨基酸残基的比例为 11． 19%、
26． 11%和 62． 70%(图 3)。
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图 3 PhDnaJ蛋白氨基酸序列的多重序列比对
灰色阴影部分为 PhDnaJ蛋白的 3 个保守的结构域，按顺序分别为为 N 端的 DnaJ结构域，中间的富含半胱氨酸结构域(CＲ)和 C 末
端结构域(CTD)，下划线部分为 CＲ结构域的 4 个 CxxCxGxG 基序。PhDnaJ蛋白二级结构中的箭头，黑色带和小圆点分别表示螺
旋，片层和环状结构
Fig． 3 Multi-alignment of amino acid sequence of PhDnaJ
The gray sections show the three conserved domains of PhDnaJ，which was DnaJ domain of N terminal，CＲ domain and CTD domain，
respectively，and the four repeats of CxxCxGxG motif of CＲ domain are underlined． The arrowheads，ribbons and dots in the secondary
structure of PhDnaJ denote helices，strands and coils，respectively
2． 2 PhsHsp22 的多序列比对及二级结构分析
PhHsp22 蛋白氨基酸序列的多重序列比对结
果表明不同物种的 sHSP氨基酸序列 N 端保守性
交差，而 C 端则高度保守，包含一个 A-晶体结构
域(A-crystallin domain，ACD)，ACD 可分成 2 个
区，这 2 个区可以形成 2 个反向平行的 β 折叠构
成 β-三明治结构(图 2)。
PhDnaJ蛋白氨基酸序列的多重序列比对结
果表明其包含 3 个保守区，按顺序分别为 N 端的
DnaJ结构域，中间的含有 4 个 CxxCxGxG 基序的
富含半胱氨酸结构域(CＲ)和 C 末端结构域(C
terminal domain，CTD)(图 3)。
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2． 3 PhsHsp的系统进化分析
为进一步分析 PhHsp22和 PhDnaJ蛋白的系统
进化关系，根据 GenBank 数据库中公布的已知藻
类和陆生植物的相关蛋白的氨基酸序列，通过
MEGA 5． 0程序采用 Neighbor-Joining(NJ)法分别
构建了 PhHsp22和 PhDnaJ蛋白的系统进化树(图
4，图 5)。分析结果显示，PhHsp22的系统进化树分
为两支，其中 PhHsp22和同属于红藻门的 Galdieria
sulphuraria的 sHSP单独聚为一支，而属于蓝藻、褐
藻和高等植物的 sHsp 聚合成另外一支(图 4)。
PhDnaJ蛋白的系统进化树分为明显的两支，其中
第一类和第二类 DnaJ蛋白聚为一支，第三类 DnaJ
蛋白单独为一支，PhDnaJ 蛋白的系统进化关系介
于第一类和第二类之间，偏向于第一类(图 5)。
图 4 采用 NJ法基于氨基酸序列构建的 PhHsp22 的系统进化树
Fig． 4 Phylogenetic tree constructed with PhHsp22 amino acid sequences by the NJ method
图 5 采用 NJ法基于氨基酸序列构建的 PhDnaJ的系统进化树
Fig． 5 Phylogenetic tree constructed with PhDnaJ amino acid sequences by the NJ method
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2． 4 PhsHsp22 表达水平的 qPCＲ分析
一个基因功能的实现与其在特定条件下表达
水平的变化密切相关，为探明 PhHsp22 和
PhDnaJ对高温和失水胁迫的功能响应，本研究采
用 qPCＲ技术检测了这两个基因在 29 ℃高温胁
迫不同时间水平和不同失水程度胁迫下的基因相
对表达水平变化，结果表明高温和失水胁迫对
PhHsp22 和 PhDnaJ的相对表达水平均有显著影
响(图 6，图 7)。
图 6 高温胁迫不同时间水平条件下 PhHsp22(a)和 PhDnaJ(b)的相对表达水平
不具有相同字母上标的数据间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)
Fig． 6 The relative expression levels of PhHsp22(a)and PhDnaJ(b)in different time of high temperature stress
Bar of each column with different small letters mean significant difference(P ＜ 0． 05)
图 7 不同失水程度胁迫条件下 PhHsp22(a)和 PhDnaJ(b)的相对表达水平
不具有相同字母上标的数据间存在显著性差异(P ＜ 0． 05)
Fig． 7 The relative expression levels of PhHsp22(a)and PhDnaJ(b)at different levels of
desiccation and in rehydration for 30 min
Bar of each column with different small letters mean significant difference(P ＜ 0． 05)
在 29 ℃高温胁迫不同时间水平下，PhHsp22
和 PhDnaJ的表达水平变化趋势基本一致，均呈
现先上调后下调的趋势，但变化的幅度存在明显
差异(图 6)。PhHsp22 在高温胁迫 3 h时，即可检
测到表达水平极显著上调至较高水平(P ＜
0． 01)，达到高温胁迫前表达水平的 890 倍，并在
高温胁迫 3 ～ 12 h 之间，表达水平没有显著性差
异(P ＞ 0． 05)，但当高温胁迫持续到 24 和 48 h
时，PhHsp22 的表达水平又呈现为极显著下调
(P ＜ 0． 01)，但仍然显著高于高温胁迫前的表达
水平(P ＜ 0． 01)(图 6-a)。PhDnaJ 在高温胁迫
3 h时，可检测到表达水平上调，但差异不显著
(P ＞ 0． 05)，至高温胁迫 6 h 时，表达水平显著上
调至最高水平(P ＜ 0． 05)，为高温胁迫前表达水
平的 6． 23 倍，随后开始逐渐下调，至高温胁迫 24
和 48 h时，表达水平与高温胁迫前没有显著差异
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(P ＞ 0． 05)(图 6-b)。
在不同失水胁迫条件下，PhHsp22 和 PhDnaJ
的表达水平变化与不同胁迫时间条件下的变化趋
势基本一致，随失水胁迫程度的逐渐升高，呈现先
上调后下调的趋势，只在变化幅度上稍有差异
(图 7)。当失水率为 15%时，即可检测到 2 个基
因的表达水平开始上调，但与胁迫前相比，其表达
水平差异显著(图 7-a)，而相同失水条件下
PhDnaJ的表达水平则差异不显著(P ＞ 0． 05) (图
7-b) ;但当失水率 ＞ 30%时，2 个基因的表达水平
均显著上调(P ＜ 0． 05)，并在失水率为 45%时达
到最高水平(P ＜ 0． 05)，此时，PhHsp22 的表达水
平为失水胁迫前表达水平的 74． 90 倍，而 PhDnaJ
的表达水平则为失水胁迫前表达水平的 13． 94
倍;随后两个基因的表达水平开始显著下调，但至
失水率为 90%时，两个基因的表达水平仍然显著
高于失水胁迫前的表达水平(P ＜ 0． 05)，且在失
水率达到 90%后，将藻体重新浸泡于新鲜海水中
培养 30 min，两个基因的表达水平与失水率为
90%时的表达水平差异不显著(P ＞ 0． 05)，说明
复水 30 min 无法使这两个基因的表达水平恢复
正常。
3 讨论
非生物胁迫如高温、低温、干旱、盐分、水分和
重金属污染等是影响植物生长发育，导致作物减
产和质量下降的首要因素［20］。在长期的进化过
程中，植物形成了一系列独特且复杂的生理机制，
涉及信号传导、基因的表达调控和代谢途径的反
馈与调节等，能够对不同类型的环境胁迫作出应
答，以避免或减少胁迫对自身的伤害。其中 HSP
是植物响应逆境胁迫的一个普遍且极为重要的媒
介分子，已有的大量研究结果均表明植物对逆境
胁迫的抗性与 HSP 表达量普遍呈正相关［1］。而
sHSP是 HSP家族中分子量较小(12 ～ 43 ku)、种
类最多、保守性最差、功能也最为丰富多样的一类
HSP分子，在植物逆境胁迫响应中同样发挥着重
要的调控作用。目前已在坛紫菜中克隆获得了 5
条编码 HSP70［21］和 2 条编码 HSP90［22］的全长基
因，但至今没有坛紫菜 sHSP 基因克隆的报导。
为研究坛紫菜应答高温和失水等逆境胁迫的分子
机制，本研究以转录组测序获得的 unigene 序列
为基础［16］，通过 ＲACE 或直接 PCＲ 扩增获得了
坛紫菜 2 条 sHSP 基因的全长 cDNAs 序列，经序
列保守性和系统进化树分析确认 2 条坛紫菜
sHSP 基因分别为 PhHsp22 和 PhDnaJ，并通过
qPCＲ技术测定了这 2 条基因在高温和失水不同
程度胁迫下的表达水平变化。
3． 1 sHSP氨基酸序列的保守性分析
已有的 sHSP 氨基酸序列比较结果表明，不
同植物的同种 sHSP在氨基酸组成上 N 端保守性
较差，序列存在较大差异，而 C 端则具有很强的
保守型，一般都包含一个由 90 个左右氨基酸组成
的 ACD 保守结构域［23］，本研究中 PhHsp22 的氨
基酸序列特征与此相符。
DnaJ属于 sHSP中的 HSP40 亚家族(也称为
J蛋白家族)的成员，具有与其他 sHSP 差异较大
的氨基酸序列和结构［24］。在模式植物水稻和拟
南芥中的研究结果均表明 DnaJ 蛋白是一个很大
的蛋白家族，分别包含有 101 和 103 个编码该类
蛋白的基因［25］。根据氨基酸序列保守性结构域
的差异可将 DnaJ 分为三类［26］:第一类含有 4 种
结构域:N 端大约由 70 个氨基酸组成，核心结构
为组氨酸、脯氨酸和天冬氨酸(His /Pro /Asp)三肽
的 J结构域、富含甘氨酸和苯丙氨酸区域(G /F结
构域)、含有 4 个 Cys-X-X-Cys-XGly-X-Gly 基序
的富含半胱氨酸(CＲ)结构域和 C 末端结构域
(CTD);第二类只含 3 种结构域，即:J结构域、G /
F结构域和 CTD 结构域;第三类只有 J 结构域具
有同源性，此外可能还含有其他各种结构域。这
些 DnaJ蛋白的结构域中，位于 N 端的 J结构域是
HSP40 亚家族的基本特征。本研究中 PhDnaJ 的
氨基酸序列包含 3 个保守的结构域:N 端的 DnaJ
结构域，中间的 CＲ 构域(CＲ)和 C 端的 CTD 结
构域，与第一类 DnaJ相比，缺少 G /F 结构域。系
统进化树分析结果也表明 PhDnaJ 介于第一类和
第二类之间，偏向于第一类。已有高等植物中的
研究结果表明 DnaJ中 G /F结构域长度变化比较
大，甚至可能缺失［27］。而本研究的多序列比对结
果中，条斑紫菜 PyDnaJ也同样缺失 G /F 结构域，
这可能与紫菜在系统进化上的特殊起源有关。
3． 2 HSP应答高温和失水胁迫的表达水平分析
分布于潮间带中高潮区的紫菜对干出失水具
有很强的适应性，在失水率超过 90%，重新复水
后仍然能很快恢复各项生命机能［8 － 9］，如 Zou
等［28］的研究结果表明在干出失水期间，当紫菜藻
981
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水 产 学 报 39 卷
体的失水率达 60%时，藻体仍然能以最大速率进
行光合作用，并且在失水率达 90%时，净光合速
率仍然为正值。因此紫菜一直被当作失水胁迫抗
性研究的代表性物种开展了广泛的研究［9，29 － 30］。
而近年来，随着全球气候变暖，高温成为了影响坛
紫菜栽培的关键因素［31 － 32］，为避免高温烂菜的发
生，国内多个课题组选育出了具有明显耐高温性
状的坛紫菜新品系［17，33］，并已在生产上大面积推
广应用，本研究所采用的坛紫菜 Z-61 品系正是其
中之一。由此研究坛紫菜对高温和失水胁迫的抗
性机制，对于坛紫菜逆境胁迫抗性分子机制的阐
明具有十分重要的意义。
在坛紫菜应答高温［12］和失水胁迫［15］的蛋白
质组学研究中均发现 HSP 的表达与坛紫菜高温
和失水胁迫抗性的获得密切相关，而 PhHsp70［21］
和 PhHsp90［22］在不同高温和失水程度下的表达
变化研究也进一步证实了这一点。本研究中，
PhHsp22 和 PhDnaJ 基因在 29 ℃高温胁迫不同
时间水平和不同失水胁迫程度下的表达均呈现出
基本一致的表达模式，即在胁迫初期表达水平显
著上调，尤其是 PhHsp22 在高温和失水胁迫下，
表达水平极显著地增加了 890 倍和 74． 90 倍，但
随着胁迫的持续，这 2 个基因的表达水平开始逐
渐下调。说明这两个基因在逆境胁迫下的表达可
能存在一个反馈调节机制:逆境胁迫初期，由于受
到不适条件的影响，各功能蛋白活性受到抑制，蛋
白解聚增加，这种生理状态刺激了 PhHsp22 和
PhDnaJ表达水平的上调，参与信号蛋白分子的激
活和解聚蛋白的再折叠，从而稳定了各功能蛋白
和膜结构，维持了细胞稳态，解聚蛋白含量下降，
PhHsp22 和 PhDnaJ的表达水平也随之下调。这
种表达模式与 PhHsp70［21］和 PhHsp90［22］基因在
高温胁迫不同时间水平下的表达模式完全一致，
但与他们在不同失水程度下的表达模式则不同，
PhHsp70 和 PhHsp90 的表达水平均只在高度失水
(失水率 ＞ 60%)条件下才开始上调。由此说明
不同 Hsp 在失水胁迫下的作用模式并不完全
一致。
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Cloning and expression analysis of two small heat shock protein(sHsp)
genes from Pyropia haitanensis
CHEN Yuting，XU Yan，JI Dehua，CHEN Changsheng，XIE Chaotian*
(College of Fisheries，Jimei University，Xiamen 361021，China)
Abstract:Small heat shock proteins(sHsp)，representing an important molecular chaperone in eukaryotic
cells，play important roles not only in a variety of stress responses，but also in development and signal
transduction of normal cell． In this study，based on unigene sequences which were obtained from whole
transcriptome sequencing of Pyropia haitanensis，two full-length sHSP genes were obtained by rapid
amplification of cDNA ends(ＲACE)or direct PCＲ，which named PhHsp22 and PhDnaJ． The full-length
cDNA of the PhHsp22 gene comprised 857 nucleotides and contained an open reading frame of 519 bp
(GenBank accession:KM102540) ，encoding a protein of 172 amino acid residues with the predicted
molecular weight of 19． 1 ku and theoretical isoelectric point of 5． 24;the full-length cDNA of the PhDnaJ
gene comprised 1 616 nucleotides and contained an open reading frame of 1 290 bp(GenBank accession:
KM102541) ，encoding a protein of 429 amino acid residues with the predicted molecular weight of 46． 1 ku
and theoretical isoelectric point of 6． 43． On the basis of conserved motifs and phylogenetic tree analysis，
PhDnaJ belongs to the subfamily of Hsp40． The expressions of the two genes，as measured by real-time
quantitative PCＲ，were significantly induced by high-temperature stress and desiccation stress，and had
identical expression patterns:during high-temperature and desiccation stress，the expression levels of the two
genes all significantly increased firstly and then decreased． These results suggested that the expressions of
PhHsp22 and PhDnaJ genes are feedback regulated by high-temperature and desiccation stresses．
Key words:Pyropia haitanensis;small heat shock proteins;ＲACE;real-time quantitative PCＲ
Corresponding author:XIE Chaotian． E-mail:ctxie@ jmu． edu． cn
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