全 文 ：第 3 期
1 9 9 4 年 9 月
南 开 大 学 学 报 ( 自然科学 )
A c t a S c i e n t ia r u m N
a t u r a l z u m U
n iv e r s t t a t i s N
a n k a i e n s z s
阴 3
S e P
.
1 9 9 4
地中海伞藻叶绿体生物节律基因的
分子克隆及限制酶图谱分析
朱天慧
(南开大学医学院 , 天津 , 3 0 0 0 7 1 )
摘 要
本文用分离纯化的地中海伞藻叶绿体 DN A , 以 p co s Z E M B L 为载体构建了 co s m id 分子克
隆库 。 并用果蝇的与生物节律控制相关的 D N A 顺序为探针 , 从地中海伞藻叶绿体 co s m id 分子
克隆库中筛选到 一组含有同源顺序的克隆 ,经印迹杂交和限制酶分析 ,这些克隆都含有与果蝇
生物节律探针强烈同源的 D N A 顺序 , 且各克隆的限制酶图谱都相互重叠 。这一结果表明 , 在地
中海伞藻叶绿体基因组中可能也存在与果蝇相同或基本相 同的与生物节律相关的基因 , 而且这
一基 因可能位于基因组中单一位置的单拷贝 D N A , 有关此 D N A 表达产物及调控机制的研究正
在进行中 。
关键词 : 地中海伞藻 ; 生物节律 ; 叶绿体 ; c os m 记 分子克隆库 ; 限制酶图谱
O 引 言
生物节律是生物界普遍存在的一种生理现象 ,在多种后生动物和微生物中已经有了广
泛的研究 l[] 。但是对于细胞内有关时间控制的分子机制几乎一无所知 。多数研究集中在生理
节奏及解剖水平的分析方面 。有关植物生物节律分子机制的研究未见报导 。
R e d d y P 等从果绳克隆到一个生物节律基因川 ,并对其进行了一些分子生物学的研究 。
本 文作者用这一基因做探针从地中海伞藻 ( A ce t ab ul a ; la m ed let r an ea ) 叶绿体基因组 C os
质粒分子克隆库中分离到几个含有与其同源顺序的 D N A 克隆 ,并对其进行 了精细限制酶
图谱分析 。
1 材料与方法
L l 叶绿体的制备与纯化
地 中海伞藻在 M 讯 e r , s 培养液 ( 3 ) 中培养 , 成熟前 , 即第二次二倍体小核形成之前 ,细胞
核位 于假 根部 , 剪 下细 胞 的伞 部 ( 一 万 个约重 2 0娘 ) , 将 伞置 于 I L 冰冷 的缓 冲液 A 中
( 0
.
6 m o l / L 山梨糖醇 ; 0 . l m o l T E S ( 2一 {〔t r is ( h y d r o x y m e t h y l ) m e t h l〕 a m i n o l卜 1一 e t h a n e s u l-
f o n i e a e i d )
,
p H 7
.
8 ; s m m o l / L E D T A 和 Zm m o l / I J D T E ( 2 , 3 一 d i h y d r o x y l 一 1 , 4一 d i t h i o b u t a n e ) ,
用多片双 面剃须刀 片改装的组织匀浆器匀浆 10 次 , 每次一秒 。 然后将匀浆液以双层滤纸和
本义于 19 9 1年 10月 1 8日收到
一层孔径为1 。拼m 的尼龙膜过滤 。 将滤液以 3 5 0 0 r / m in 离心 4m in , 沉淀叶绿体 。把沉淀的叶绿
体悬浮在 4 0 0 m l 缓冲液 B 中 ( 0 . 6m o l / L 山梨糖醇 ; 0 . o l m o l / L T E S , p H 7 . 8 ; s m m o l / L E D -
T A 和 Zm m ol / L D T E ) 。 每 25 9 细胞伞用缓冲液 B 1 0 Om l ,并置冰浴 hl 使叶绿体悬浮 ,悬浮液
经孔径为 5拜m 的聚碳酸酷核孔膜过滤 ,滤液以 4 0 0 0 r /m in 离心 s m in 。沉淀用缓冲液 B 洗涤一
次后悬浮在 Z o m l 缓冲液 B 中 , 以 1 0一 60 % ( V / V ) p e r e o l l 梯度离心 s 0 0 0 r /m i n , 3 o m i n , 完整
的叶绿体带位于 50 % p er co l 处 , 收集叶绿体 , 用缓冲液 B 稀释 4倍后 , 以 s 0 0 0 r / m in 离 心
l om in
, 沉淀叶绿体再用缓冲液 B 洗一次 , 电镜下检查叶绿体纯度 。
1
.
2 叶绿体 D N A 的制备
纯化的叶绿体悬浮于 0 . o sm o l / L T r is p H 8 . 0 ; 0 . z Zm o l / L E D T A ; 5 0 0产g 蛋 白酶 K / m l
( 10 m l / 1 0 0克细胞伞 ) ,冰浴 s o m i n , 边混合边逐滴加入 2 0%肌氨酸十二醋钠溶液 ( s o d i u m N -
I a u r o y l
s a r e o s in e ) Zm l
,冰浴 3 o m i n 后加入 3 9 (每 z o m l 裂解液 ) C s C I , 在冰中不断旋转离心管
至 C s CI 完全溶解 , 1 04 r /m in 离心 10 m in , 去除淀粉和不溶性蛋 白等沉淀物 , 再补加 C s CI 至
1 9 /m l
。使溶液升温至 20 ℃ ,待 C s CI 完全溶解后 ,每 10 m l 裂解液加入澳乙锭溶液 ( 10 m g / m l)
l m l
,调整溶液 比重至 1 . 5 5 9 / m l , 4 火 1 0 ` r /m i n 离心 4 o h , D N A 带 回收后再重复一次 C s C I离
心 , 以正丁醇抽提去除 D N A 溶液 中的滨乙锭 , D N A 溶液对 0 . 01 m ol / L T isr 一 lC , p H 8 . 。 ;
l m ol / L E D T A 溶液透析 2天 (透析液至少更换 4次 ) 以去除 C s CI 。
1
.
3 载体 D N A 制备
粘粒 p e o s 2 EM B L D N A 制备基本按照 B i r n b o im 和 D o l y [` 〕的方法 ,再经过 2次 C s C I平
衡梯度离心以进一步纯化 D N A 。
1
.
4 涂布细胞的准备
粘粒重组克隆的宿主细胞株用 D H I , D H I在 L B 培养基 内 30 ℃培养过夜后离心收集菌
体 ,将菌体悬浮于 z / 2体积 ( L B ) l om m o l / L 的 M g SO 。溶液 中 。
1
.
5 伞藻叶绿体 D N A 粘粒分子克隆库的构建
经纯化的伞藻叶绿体 D N A 以限制酶 S au A I做部分酶解 , 使酶解产物主要部分分子长
度 5 0 k b 左右 。 70 ℃加热 s m in 使酶失活 , 乙醇沉淀 D N A , D N A 再 经小牛肠硷性磷酸酶处
理 [ 5〕。 载体粘粒 p e o s Z EM B L [ 6〕带有两个相邻的 C o s 位点 , 用限制酶 P v u l 在二个 C o s 位点
之间切开 ,使 C o s 质粒 D N A 成线状 , 并用小牛肠硷性磷酸酶处理 ,再 以限制性内切酶 B a m
H l在克隆位点切开 ,成二个 D N A 片段 , 将该 D N A 片段与 S au 3A I部分酶解并经硷性磷酸
酶处理的伞藻叶绿体 D N A 连接 ,经体内包装后川 ,以 D H I为宿主细胞涂布于含有卡那霉素
的培养皿上 , 37 ℃培养过夜后可得到约 10 5个独立克隆 。 随机挑取 1 0 0 0个菌落分别在含有卡
那霉素和四环素的两种培养皿上进行检验 ,确认对卡那霉素抗性而对 四环素敏感 的即为重
组克隆 。
1
.
6 探针
( p EM B L
一
6 6来 自 p i r r o t t a [ , ] 。 该探针系果蝇基因组 D N A 重组噬菌体克隆 入a 4 7 1 5 1的亚
克隆 。果蝇 0 . gk b RN A 转录产物与该探针产生明确的杂交信号 ,该转录产物与光 /暗周期明
显相关 , 且突变体未发现此转录产物 。该 0 . 9 k b R N A 对于细胞的节律控制功能是必需的 ,
但可能还不完全
1
.
7 克隆筛选
p E M B L
一 “ 克隆 片段经 电泳分 离及 N A C S一 52 ( B R L ) 过 柱纯 化后 以 ’于 标记 , 依照
一层孔径为1 。拼m 的尼龙膜过滤 。 将滤液以 3 5 0 0 r / m in 离心 4m in , 沉淀叶绿体 。把沉淀的叶绿
体悬浮在 4 0 0 m l 缓冲液 B 中 ( 0 . 6m o l / L 山梨糖醇 ; 0 . o l m o l / L T E S , p H 7 . 8 ; s m m o l / L E D -
T A 和 Zm m ol / L D T E ) 。 每 25 9 细胞伞用缓冲液 B 1 0 Om l ,并置冰浴 hl 使叶绿体悬浮 ,悬浮液
经孔径为 5拜m 的聚碳酸酷核孔膜过滤 ,滤液以 4 0 0 0 r /m in 离心 s m in 。沉淀用缓冲液 B 洗涤一
次后悬浮在 Z o m l 缓冲液 B 中 , 以 1 0一 60 % ( V / V ) p e r e o l l 梯度离心 s 0 0 0 r /m i n , 3 o m i n , 完整
的叶绿体带位于 50 % p er co l 处 , 收集叶绿体 , 用缓冲液 B 稀释 4倍后 , 以 s 0 0 0 r / m in 离 心
l om in
, 沉淀叶绿体再用缓冲液 B 洗一次 , 电镜下检查叶绿体纯度 。
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2 叶绿体 D N A 的制备
纯化的叶绿体悬浮于 0 . o sm o l / L T r is p H 8 . 0 ; 0 . z Zm o l / L E D T A ; 5 0 0产g 蛋 白酶 K / m l
( 10 m l / 1 0 0克细胞伞 ) ,冰浴 s o m i n , 边混合边逐滴加入 2 0%肌氨酸十二醋钠溶液 ( s o d i u m N -
I a u r o y l
s a r e o s in e ) Zm l
,冰浴 3 o m i n 后加入 3 9 (每 z o m l 裂解液 ) C s C I , 在冰中不断旋转离心管
至 C s CI 完全溶解 , 1 04 r /m in 离心 10 m in , 去除淀粉和不溶性蛋 白等沉淀物 , 再补加 C s CI 至
1 9 /m l
。使溶液升温至 20 ℃ ,待 C s CI 完全溶解后 ,每 10 m l 裂解液加入澳乙锭溶液 ( 10 m g / m l)
l m l
,调整溶液 比重至 1 . 5 5 9 / m l , 4 火 1 0 ` r /m i n 离心 4 o h , D N A 带 回收后再重复一次 C s C I离
心 , 以正丁醇抽提去除 D N A 溶液 中的滨乙锭 , D N A 溶液对 0 . 01 m ol / L T isr 一 lC , p H 8 . 。 ;
l m ol / L E D T A 溶液透析 2天 (透析液至少更换 4次 ) 以去除 C s CI 。
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3 载体 D N A 制备
粘粒 p e o s 2 EM B L D N A 制备基本按照 B i r n b o im 和 D o l y [` 〕的方法 ,再经过 2次 C s C I平
衡梯度离心以进一步纯化 D N A 。
1
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4 涂布细胞的准备
粘粒重组克隆的宿主细胞株用 D H I , D H I在 L B 培养基 内 30 ℃培养过夜后离心收集菌
体 ,将菌体悬浮于 z / 2体积 ( L B ) l om m o l / L 的 M g SO 。溶液 中 。
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5 伞藻叶绿体 D N A 粘粒分子克隆库的构建
经纯化的伞藻叶绿体 D N A 以限制酶 S au A I做部分酶解 , 使酶解产物主要部分分子长
度 5 0 k b 左右 。 70 ℃加热 s m in 使酶失活 , 乙醇沉淀 D N A , D N A 再 经小牛肠硷性磷酸酶处
理 [ 5〕。 载体粘粒 p e o s Z EM B L [ 6〕带有两个相邻的 C o s 位点 , 用限制酶 P v u l 在二个 C o s 位点
之间切开 ,使 C o s 质粒 D N A 成线状 , 并用小牛肠硷性磷酸酶处理 ,再 以限制性内切酶 B a m
H l在克隆位点切开 ,成二个 D N A 片段 , 将该 D N A 片段与 S au 3A I部分酶解并经硷性磷酸
酶处理的伞藻叶绿体 D N A 连接 ,经体内包装后川 ,以 D H I为宿主细胞涂布于含有卡那霉素
的培养皿上 , 37 ℃培养过夜后可得到约 10 5个独立克隆 。 随机挑取 1 0 0 0个菌落分别在含有卡
那霉素和四环素的两种培养皿上进行检验 ,确认对卡那霉素抗性而对 四环素敏感 的即为重
组克隆 。
1
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6 探针
( p EM B L
一
6 6来 自 p i r r o t t a [ , ] 。 该探针系果蝇基因组 D N A 重组噬菌体克隆 入a 4 7 1 5 1的亚
克隆 。果蝇 0 . gk b RN A 转录产物与该探针产生明确的杂交信号 ,该转录产物与光 /暗周期明
显相关 , 且突变体未发现此转录产物 。该 0 . 9 k b R N A 对于细胞的节律控制功能是必需的 ,
但可能还不完全
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7 克隆筛选
p E M B L
一 “ 克隆 片段经 电泳分 离及 N A C S一 52 ( B R L ) 过 柱纯 化后 以 ’于 标记 , 依照
·
9 9
·
参 考 文 献
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B is o c in c e e
,
1 9 8 3 ; 3 3
:
4 2 4 一 4 2 5
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1 9 8 4 ; 3 8
:
7 0 1 7 1 0
3 S e h w e ig e r H G
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1 9 7 9 ; 9
:
1 1一 4 4
4 B ir n b
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,
I〕o ly J . N u c l e r c A c z d R e s , 1 9 7 9 ; 7 : 1 5 1 3 一 1 5 3 2
5 F r i s e h a u f A M
,
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r a e
h H
,
P o u s t k
a A e t a l
.
J M
口 I B i o l , 1 9 8 3 ; 17 0 : 8 2 7一 8 4 2
6 柴建华 . 遗传学报 , 19 9叭 17 : 3 8一 4 5
7 S c a l
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1 9 8 1 ; 8 2
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8 H a n a h a n D
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. 几介 z h E n砂m o l , 1 9 8 3 ; 1 0 0 : 3 3 3一 3 4 2
9 柴建华 . 遗传学报 , 19 9 0 ; 1 7 ; 13 6一 1 4 2
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,
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1 9 7 0 ; 4 4
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3 6 1 一 3 7 5
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·
P r o c N a t l A c a d 5 0 1 U S A
,
1 9 8 5 ; 8 2
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1 7 0 6一 1 7 1 0
M O L E C U L A R C L O N IN G O F B I O I
才
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R H Y T H M G E N E A N D A N A L Y S E O F
R E S T R I C T I O N M A P P I N G F O R C H L O R O P L A S T
O F A C E T A B U L A R I A M E D I T E R R A N E A
Z h u T i a n h u i
(材七d i c a l c o l l e g e of N a n k a i u n i v e sr i yt , T ia inj n 3 0 0 0 7 1 )
A b s t r a e t
B io l o g ie a l R h y t h m 15 a p h y s i o l o g i e a l p h e n o m e n o n a n d w id e l y e x i
s t i n l i v i n g n a t u r e
,
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e x i s t i n t h e A e e t a b u l a r ia M e d i t e r r a n e a a l s o
.
T o u n d e r s t a n d t h e m e e h a n i s m o f t h e g e n e r e g
-
u l a t i o n f o r t h e p h e n o m e n o
,
t h e e h l o r o Pl a s t g e n o m e e o
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m i d li b
r a r y o f A
.
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e d i t e r r a n e a w a s
e o n s t r u e t e d b y u s i n g e o s m id P e o s ZE M B L a s v e e t o r
.
A s e t o f e o s m id e l o n e s w e r e o b t a i n e d
f r o m e o s m i d l ib r a r y u
s i n g D N A p r o b f r o m D r o s o p h i l a e o n e e
r n b i o l o g ie a l
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.
T h e s e
e o s m id e l o n e s e o n t a i n a D N A s e q u e n e e h o m o l o g o u
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w i t h D r o s o p h i l a D N A p r o b a n d o v e r
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s i s o f b l o t h y b r id i z a t i o n a n d
r e s t r i e t i o n m
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t h a t t h e g e n e i n r h e A c t a bu l a ir a m e d i t e r ar
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s a m e m a i n l y w i t h
D r o s o p h i l
a , a n d t h e g e n e 15 a
s i n g l e e o p y s e q u e n e e l o e a t e d o n a s i n g l e l o e u s
.
T h e r e m a i n i n g
r e s e a r e h o n t h e e x p r e s s io n a n d
r e g u l a t i o n o f t h e g e n e a r e e a r y o n
.
K e y w o r d s
:
A c e t a b u l a r i a m e d i t e r r a n ` a ; B io lo g ie a l r h y t h m ; C h l o r o p la s t ; e o s m id l ib r a r y ; R e -
s t r l c t l o n m
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