全 文 ：第 2 0卷 第 2期
1 9 98
一
0 3
海 洋 学 报
A C T A ( )C E A N O L O G IC A S IN IC A
V o l
.
20
,
M
a r e h
N o
.
2
19 98
高浓度小新月菱形藻保存方法的研究 `
孙 建 华 王 如 才 赵 强 ` ’
(青岛海洋大学水产学院 , 青岛 26 60 0 3)
摘 要 对小新月菱形藻 (N i t z s e h艺a : l o s t e r i u 从 f . m i n u t i s s i m a ) 的保存方法进行 了研
究 , 试验证 明 , 小新月菱形藻用不 同的方法保存 3个月 , 其最高存活率分别为 : (1 )
在 Z o C 一卜, 15 . 。% 的 S A M S组为 7 6 . 4 % , 1 . 5% 的抗生素组为 54 . 6% , 。 . 1% 的防腐剂
组为 4 5 . 3% , 对照组仅为 35 . 4% . (2 ) 在。 C 下 , 10 . 。% 的 S A M S组为98 . 4% , 1 . 5%
的抗生素组为 78 . 8% , 0 . 1% 的防腐剂组为 63 . 1写 , 低于对照组 (6 5 . 5写 ) . (3 ) 一 30 ` C
下 , 1 0 . 0 % 的 D M S O 组为 8 4 . 6% , 1 0 . 0 % 的甘油组为 8 3 . 1环 , 对照组为 4 6 . 0% . 为
微藻的浓缩保存提供 了新的方 法 .
关键词 小新月 菱形藻 保存方法
1 引言
单细胞藻类是人工育苗的饵料基础 , 目前在贝类 、 鱼虾育苗生产中 , 常因饵料不足或因
投入过多藻液引起水质污染 , 造成亲贝 、 幼虫营养不良 、 体质差 , 因而对环境的适应性差 , 使
育苗失败 . 小新月菱形藻 (N i t sz hc 爪 : z os et ir u m f . m in ut i is m a) 营养丰富 、 耐低温 、 生长繁
殖快 , 是我国春季育苗生产中 , 最常用的单胞藻 . 但是 , 由于春天水温 、 气温很低 , 生长 、 繁
殖慢 lj[ , 常常满足不了苗种生产的需求 . 如果在气温适宜季节大量生产小新月菱形藻 , 并将其
浓缩后 , 科学地保存 , 可解决育苗期间饵料不足问题并提高设备的利用率和节约能源 .
早在本世纪 60 年代 , 英国的 M or ir s 匡一 `〕等对海产单胞藻进行了冷冻保护研究 , 取得了在一
1 9 6 C 下 , 保存一年 , 存活率 一0 0 %的结果 . 7 0年代后 , M o r r i S [ ,一 5〕对小球藻 (hC l o er zl a ) 、 眼藻
( E u g el 。 , a) 等海 、 淡水单胞藻的冷冻保护进行了更详尽的研究 . 1 9 8 9年美国的 C ao s t O ys t e r
C o m ao yn 对浓缩的单胞藻低温下保存了 1年 , 存活率达 90 %以上 6j[ . 国 内 , 郑严于 1 9 8 7年川对
三角褐指藻 (尸 h ae od 二 yt lu m t ir co rn ut u 珑 )进行了冷冻保种试验 , 证明三角褐指藻在 一 20 ’ C 下 ,
保存 20 d 后 , 重新培养 Z d 即能恢复正常生长 、 繁殖 . 蒋霞敏 、 朱艺锋等 sj[ 1 9 9 2年对海水单胞
本文 1 9 9 6 1 1一 14 收到 , 修改稿干 1 9盯 一。4 一 1 7收到 .
, 山东省科委资助项 目 〔编号 : ( 9 6) 第 4 5号〕 .
* * 现在烟台市水产研究所工作 .
第一作者简介 : 孙建华 , 男 , 35岁 , 讲师 , 硕士 , 现从事海洋微藻的培养与应用研究 ·
1期 孙建华等 :高浓度小新月菱形藻保存方法的研究
藻进行了初步的浓缩 、 保存研究 , 证明 5 ` C 一 7 ’ C 下保存三角褐指藻 3个月后 , 重新培养 s d 即
能恢复正常生长 、 繁殖 . 金娟等 9j[ 于 1 9 9 4年对浓缩的小新月菱形藻在一 28 C 一 一 30 ` C 下速冻 ,
置于一 16 `C 一一 18 ’ C 冷藏室保存 5个月 , 重新培养 1 5 d 即能恢复正常生长 、 繁殖 . 本文对小新
月菱形藻保存的温度范围及方法进行了较全面研究 , 取得了一定结果 .
2 材料和方法
2
.
1 培养条件
2
.
1
.
1 藻种 小新月菱形藻来 自青岛海洋大学微藻室 .
2
.
1
.
2 培养用水 取 自青岛市太平角的自然海水 , 经沉淀 、 过滤 、 消毒后使用 . 盐度为 31 . 0
一 3 2 . 5 , P H S . 0 0一 8 . 1 5 .
2
.
1
.
3 浓缩方法 用 T S C 4 5仆 N 型离心机分离 , 藻液的密度为 24 . 7 只 1少个 c/ m 3 .
.2 .1 4 培养方法 在 14 ` C 士 l ` C 条件下 , 光照强度为 3 o 0 lx , 光周期 1 6 / 8 ( L / D ) . f 2/ 培
养液 仁`〕 , 培养于 1 3 01 的有机玻璃柱中 , 生长到间期分离 .
.2 L 5 实验药品 防腐剂 : 山梨酸 ( A . R . ) , 用 乙醇溶解 (0 . 19 l/ c m 3 ) ; 山梨酸钾 ( A ·
.R )
, 用蒸馏水溶解 (0 . 68 9 / 1 c m 3 ) , 4 ` 」c 的冰箱保存 ; s A M S保护液 : 参考 A M g培养基 〔’ 。〕 , 进
行改进 , 加入维生素 C (人用 ) 及仲丁胺 ( A . R . ) 配制成 . 抗生素 : 用红霉素乳糖酸盐 (人
用 ) , 配成 50 %的水溶液 , 在 4 `C 的冰箱保存 .
3 保存方法
用 2 0 c m 3的具塞试管 , 盛 10 c m 3浓缩藻液 , 然后进行不同方法的保存实验 , 每组实验设 3
个平行样 .
3
.
1 常温保存
将浓缩藻液分别不加任何物质 , 加入不同浓度防腐剂 (山梨酸及山梨酸钾分别加入 ) 、 不
同浓度的抗生素 、 不同浓度的 S A M ,保护液后放入 20 C 士 1 ` C 的恒温箱中 , 保存 3个月 .
3
.
2 低温保存
将浓缩藻液分别不加任何物质 , 加入不同浓度的防腐剂 、 不同浓度的抗生 素及不 同浓 度
的 S A M S保护液后放入 。一 4 C 的冰箱中 , 保存 3个月 .
3
.
3 冰冻保存
将浓缩藻液分别不加任何物质 , 加入 1 0 . 。写的甘油 、 1 0 . 。% 的 D M S O 作冰冻保护剂后放
入超低温冰柜 , 进行速冻于 一 30 ℃下 , 保存 3个月 . 冰冻速率为一 3 . 2 `C / m in , 用铜 一康铜热电
偶探头插入样品中测量温度变化 .
3
.
4 存活率的测定
常温和低温保存的样品取出后 , 用高压灭菌的 f/ 2培养基洗 3次 , 以除去防腐剂 、 抗生素
等物质 . 冷冻保存样品取出 1 / 1。左右 , 在 35 ` C 的恒温水浴中快速溶解 , 然后用高压灭菌的 f/
2培养基冲洗 3遍 , 去除冰冻保护剂 . 将上述处理好的样品 , 按对数倍数稀释后 , 用平板法测
定其存活率「1 ’ 。 ’ 2 〕 .
海洋学报 20 卷
4 结果
4. 1 常温 ( 2 0 ℃ ) 下保存小新月菱形藻3个月的效果
常温下 , 保存效果最好的是加入 S A M S保护液 , 存活率达 76 . 4 % , 藻液无异味 , 藻液分布
均匀 . 其次为加抗生素组存活率 54 . 6% , 藻液有轻微异味 、 结块 . 加防腐剂组存活率仅为
45
.
3%
, 且藻液有异味 , 结块较多 . 直接放于恒温箱组 (对照组 ) , 存活率最低仅为 35 . 4% 且
藻液有臭味 , 结块严重 (表 1) .
表 l 常温 ( 2 0℃ ) 下保存小新月菱形藻3个月的存活率 ( 1 99 5一 0 3一 0 5 )
保存方法 浓度 平均存活率 (% ) 说明
对照组 3 5 . 4士 3 . 3 藻液有臭味
结块严重
加防腐剂 0 . 0 5写
0
.
10 %
0
.
1 5%
4 5 3士 2 4
4 0 4士 3 . 5
3 9
.
3士 2 . 5
藻液有臭味
有结块
4 7
.
]士 2 . 2
5 2
.
6士 3 . 5
5 4
.
6士 4 . 4
藻液有异味
有轻微结块
%
亡Jnd加抗生素
加 S A M S
保护液
5
.
0 %
1 0
.
0%
] 5
.
0 %
6 5
.
1生 4 6
7 5
.
2士 4 , 6
7 6
.
4 士 5 . 1
藻液无异味
分布均匀
.4 2 0
`
C 下保存小新月菱形藻 3个月的效果
在 。 `C 下保存小新月菱藻 3个月 , 其存活率较 20 ℃下保存有明显提高 . 其中对照组存活率
为 6 5 . 6% , 藻液有轻微异味和少量结块 , 加防腐剂组存活率最低为 63 . 1 % , 加抗生素组及加
S A M
S保护液组存活率明显提高 , 达 78 . 8%和 9 8 . 4% , 且藻液无异味 , 分布均匀 (表 2) .
.4 3 一 3 0
’
C 下保存小新月菱形藻 3个月的效果
对照组存活率为 46 % , 具较高的存活率 , 加甘油及 D M S O 冷冻保护剂后 , 存活率大大提
高 , 达 93 % 以上 (表 3) .
5 讨论
高浓度小新月菱形藻 , 在 20 ’ C 下保存 3个月后 , 藻液具有臭味 、 结块严重 、 存活率明显降
低 . 据蒋霞敏 8j[ 认为 , 是保存过程中 , 藻类密度大 、 新陈代谢旺盛 、 细菌大量繁殖 、 而引起藻
液理化条件的变化 , 导致藻类死亡 . 姚南瑜认为 l[ 3〕 , 硅藻和褐藻的藻类中 , 有高活性的磷酸
烯醇式丙酮酸经激酶 (P E P 一 C K a s e ) 存在 , 在无光条件下能固定 C 0 2 , 同时形成 A T P . 由于
我们保存的藻是在黑暗及密封条件下 , 所以藻的光反应及暗反应都受到限制 . 笔者认为 , 藻
的代谢不是主要的因素 , 造成保存藻类存活率低的原因 , 可能是细菌的大量繁殖所致 . 我们
在保存藻中 , 加入红霉素 , 其存活率明显提高 , 也证明了上述的推测 (表 1) . 加入 S A M S保护
l期 孙建华等 : 高浓度小新月菱形藻保存方法的研究
表 2 0℃下保存小新月菱形藻 3个月的效果 ( 1 9 9 5一 03 一 0 5)
保存方法 浓度 平均存活率 (% ) 说明
对照组 6 5. 6士 2 . 藻液有轻微异味
加防腐剂组 0. 0 5%
0
.
]O写
0
.
15环
6 2
.
5士 2 . 4
6 3
.
1士 3. 0
6 2
.
1土 2 . 3
藻液有轻微异味
少量结块
加抗生素组 6 8. 5士 2 . 2
7 8
.
5士 2 . 5
7 8
.
8土 2. 2
藻液无异味
少量结块
%
亡dCé尸乃
%灿%00乐你乐加 S A M S保护液组 8 8. 0土 1. 7
9 8
. 峨土 1. 2
9 8
.
2士 1. 3
藻液无异味
分布均匀
表 3 一 3。℃下保存小新月菱形藻 3个月的效果
保存方法 浓度 平均存活率 (% ) 说明
对照组
加甘油
4 6
.
0土 1. 部分藻细胞色素
变黄 , 气泡多
5
.
0 %
10
.
0%
15
.
0 %
7 5
.
5士 2 . 2
8 3
.
1土 2 . 4
6 8
.
5土 2 . 2
藻细胞色素正常
加 T) M S ( ) 5 . 0 %
10
.
0 %
15
.
0 %
7 6
.
0士 艺. 7
8 4
.
6士 2 . 3
7 3
.
5土 3 . 2
藻细胞色素正常
液试验组存活率最高 , 说明 s A M 。保护液具有 良好的保存高浓度小新月菱形藻的效果 · S A M 、
保护液是我们新研制的保存藻液的配方 , 含有抗霉 、 抑菌 、 抗氧化剂 , 故提高 了藻的存活率 .
用防腐 ljA 保存食品 、 饮料等是非常成功的 仁, `〕 , 但保存微藻尚属启蒙阶段 , 对微藻的生理 、 生
化作用机制尚不清楚 , 从保存效果看并不理想 , 需进一步研究 . 在 o C 的低温下 , 保存小新月
菱形藻的效果 , 各种方法均好于 Z o c 下保存小新月菱形藻的效果 (表 2) . 朱仁华认为厂」5 〕 , 温
度对单胞藻的影响是细胞内的酶反应 , 降温会减缓酶反应速率 , 此变化常是可逆的 , 通常温
度低于 o C , 而细胞及培养液尚未结冰 , 就能保存生命 . 在 。 (二左右 , 单胞藻细胞内不能形成
结冰 , 微生物及藻本身代谢减缓 , 加入抗生素及 s A M 。保护液后 , 更能减少微生物及藻本身代
谢作用 , 提高存活率 , 延长保存时间 . 为今后单胞藻浓缩保存提供了经济 、 有效的途径 ·
藻类的冰冻保存 , 从 50 年代就开始 , M or ir s 巨2一 遭习对单胞藻的冰冻保存进行了大量研究 , 认
为冰冻保存单胞藻最重要的是保护剂和 降温速率 . 保护剂以 D M s o 和甘油最好 , 它们能降低
对浓溶质的敏感性或阻碍胞内冰晶的形成或两者兼得 . 并认为单胞藻在不同生长阶段 , 其抗
冻性是不一样的 , 以 间期抗冻性最强 . 试验中 , 我们根据前人经验 , 选用静止期单胞藻及 D M -
(S ) 和甘油作抗冻保护剂 , 结果表明 , 加 D M S O 和甘油作保护剂组存活率明显高于对 照组 , 这
1 1 2 海洋学报2 0 卷
与文献 [2 一 4」结论一致 .但试验发现 , 对照组中的小新月菱形藻也具有较高的存活率 (表
3 )
, 这与文献 [ 2 , 4〕结果相似 . 据 M or ir s 闭报道 , 嗜冷品系的绿藻 比嗜温性品系的绿藻更能
抵抗冰冻和融解 , 并认为脂肪酸含量多的品系 比含量少的品系耐冻性更强 . 小新月菱形藻是
低温品系微藻 5j[ , 不饱和脂肪酸含量高 i[ 6〕 , 可能是小新月菱形藻对冰冻有强的抵抗力的原因 .
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, n e (。 n t r o l g r o u p
·
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