全 文 ：第 3卷 第 2期 过 程 工 程 学 报 Vol.3 No.2
2003 年 4 月 The Chinese Journal of Process Engineering Apr. 2003

收稿日期：2002-12-20，修回日期：2003-01-21
作者简介：王军(1976–), 女, 四川省宣汉县人, 硕士研究生, 生物化工专业; 丛威, 通讯联系人.
营养条件对产烃葡萄藻生长的影响
王 军，杨素玲，丛 威，蔡昭铃
(中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100080)
摘 要：在摇瓶培养中考察了无机碳源、氮源、磷源和 NaF等营养成份对产烃葡萄藻(Botryococcus
braunii)生长的影响. 结果表明：与仅利用空气中的 CO2作为碳源相比，以 NaHCO3或 CO2加富空
气补碳，比生长速率从 0.0535 d-1分别增大至 0.0589和 0.0949 d-1，代时从 5.6 d分别缩短至 5.1和
3.2 d，最大放氧速率分别提高了 2.3和 5倍；在一定范围内增大 KNO3起始浓度能提高葡萄藻的生
长速率，延长对数生长期；磷源对葡萄藻生长的影响十分显著，在 0~160 mg/L范围内，增大 K2HPO4
浓度，葡萄藻生长明显加快；适量 NaF能促进葡萄藻的光合作用和呼吸作用，从而加快葡萄藻的
生长，其最适浓度为 0.84 mg/L.
关键词：葡萄藻(Botryococcus braunii)；生长；无机碳源；氮源；磷源；NaF
中图分类号：Q938.8 文献标识码：A 文章编号：1009-606X(2003)02-0141-05
1 前 言
全球面临的能源短缺和环境污染问题促使开发和利用可再生、无污染的生物能源成为一个重
要的研究方向. 利用微藻生产生物能源具有以下独特的优势[1,2]：微藻能有效地利用太阳能，通过
光合作用固定 CO2，将无机物转化为氢、高不饱和烷烃、油脂等能源物质；微藻生物能源可再生，
燃烧后不排放有毒有害物质，对大气 CO2无净增加；易于进行大规模培养，能量要求低，投资小.
因此利用微藻生产生物能源具有潜在的应用前景.
呈串状集落生的葡萄藻(Botryococcus braunii，又译丛粒藻)是一种世界性分布的淡水单细胞绿
藻，其含烃量可高达细胞干重的 85%[3,4]，远远高于其它微生物的产烃量，而且葡萄藻所产烃的组
成和结构与石油极其相似[5]，因此利用葡萄藻生产石油替代品日益受到重视.
目前关于葡萄藻产烃的研究多集中在生理生化方面，还没有大规模培养的报道，主要困难是
葡萄藻生长缓慢，倍增时间长[6,7]，因此研究葡萄藻生长的营养条件对缩短葡萄藻代时、提高生长
速率、实现高密度培养十分关键. 本文考察了无机碳源、氮源、磷源和 NaF对葡萄藻生长的影响.
2 材料与方法
2.1 藻种与培养基
葡萄藻(Botryococcus braunii 357)由中国科学院水生生物研究所提供.
培养基采用改进的 Chu13×2培养基[8]，用 KOH调节 pH到 7.5.
2.2 设备及仪器
HZQ-QG 旋转式摇床，哈尔滨东联电子技术开发有限公司生产. OXY-LAB 氧电极，英国
Hansatech公司生产. 721-B型分光光度计，上海光学仪器厂生产.
2.4 培养条件及测定方法
不同无机碳源的摇瓶培养：将 Chu13×2培养基分装到 3个 250 ml三角瓶中，每瓶 100 ml，各
142 过 程 工 程 学 报 3卷
接入 10 ml藻种液，使培养初期 OD680在 0.1左右. 一瓶用可透过无菌空气的封口膜包扎；一瓶通
入含 1%(j)CO2的加富空气，通气量为 20 ml/min；另一瓶培养基中加入 200 mg/L NaHCO3，用封
口膜包扎. 3瓶均置于HZQ-QG旋转式摇床进行培养. 培养条件为：温度 25oC，光强 2.5 mW/cm2(持
续光照)，转速 120 r/min. 培养过程中定期取样测定细胞生长和光合活性.
氮源、磷源、NaF 对葡萄藻生长的影响：采用单因子分析法，在测定某一因子对葡萄藻生长
的影响时，其它因子保持恒定. 用 Chu13×2培养基配制含不同浓度的 KNO3, K2HPO4, NaF的培养
基，分装于 250 ml锥形瓶中，每瓶 100 ml，接种后用封口膜包扎，置于摇床培养. 其余条件同上.
细胞生长检测：定时取样，用分光光度计测藻液在 680 nm波长处的光吸收值 OD680，用 OD680
表示细胞的生长情况.
生物量：以细胞干重表示. 将藻液离心后于 80oC干燥 1 d，称其干重.
比生长速率：根据藻细胞生长数据，采用最小二乘法，线性回归求斜率.
光合作用活性测定：光合放氧与呼吸速率用 OXY-LAB氧电极(Hansatech公司)测定. 取 2 ml
对数生长期的藻液置于反应室，利用恒温水浴保持反应室温度在 25oC，设定一系列光强，测定藻
细胞在不同光强下的放氧速率，通过氧电极自带软件计算并绘制出光饱和曲线.
3 结果与讨论
3.1 无机碳源对葡萄藻生长的影响
在摇床上进行了空气浴、通入富 CO2空气及培养基中加入 NaHCO3补碳的对比实验. 3种条件
下葡萄藻的生长曲线和光饱和曲线分别如图 1和 2所示.
由图 1可看出，摇床培养条件下，仅以空气中的 CO2作为碳源，葡萄藻生长缓慢，延滞期约
为 4 d，然后进入对数生长期，在第 23 d进入减速期，在第 30 d 进入稳定期. 当加入 200 mg/L
NaHCO3补碳时，生长速率有所加快，延滞期约为 3 d左右，在第 27 d进入稳定期. 当往培养液中
通入含 1% CO2的空气补碳时，延滞期缩短至 2 d，然后很快进入对数生长期，在第 15 d进入稳定
期，培养周期显著缩短. 由图 2 可看出，仅以空气中的 CO2作为碳源，葡萄藻的最大放氧速率为
30 µmol/(mg×h)；以 NaHCO3补碳，最大放氧速率提高至 100 µmol/(mg×h)；通入 CO2加富空气，最
大放氧速率为 180 µmol/(mg×h)，是仅以空气中的 CO2为碳源时的 6倍. 葡萄藻作为光自养微生物，
图 1 无机碳源对葡萄藻生长的影响 图 2 无机碳源对葡萄藻光合作用的影响
Fig.1 The effects of inorganic carbon sources on Fig.2 The effects of inorganic carbon sources on
the growth of Botryococcus braunii photosynthesis activity of Botryococcus braunii
0 8 16 24 32 40
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
CO
2
-enriched air
NaHCO
3
Control
O
D
6
8
0
Time (d)
0 100 200 300 400 500 600
0
40
80
120
160
200
Control NaHCO
3

CO
2
-enriched air
N
et
p
ho
to
sy
nt
he
si
s
ac
tiv
ity

[m
m
ol
/(
m
g
·
h)
]
Light intensity [mmol/(m
2·s)]

2期 王军等：营养条件对产烃葡萄藻生长的影响 143
需要足量的无机碳源来满足光合作用需要，因此外加 CO2和 NaHCO3均能大大提高葡萄藻的放氧
速率. 两种补碳条件下动力学参数的比较见表 1. 由表可看出，添加 NaHCO3和通入 1% CO2，比
生长速率分别增大至 0.0589和 0.0949 d-1，代时分别缩短至 5.1和 3.2 d，两种补碳形式均能提高葡
萄藻的光合作用效率，加快生长，缩短培养周期，提高生物量. 其中 CO2 补碳对葡萄藻的影响最
为显著，这是由于水溶状态的 CO2比 HCO3- 更有利于藻细胞的利用[9]，促进光合作用，从而提高
生长速率.
表1 葡萄藻在不同无机碳源条件下生长的动力学参数
Table 1 Comparative analysis of growth kinetic parameters of different inorganic carbon sources
Carbon source
Specific growth rate
(d-1)
Generation time
(d)
Maximum biomass
(g/L)
Maximum oxygen evolution rate
[µmol/(mg×h)]
Control 0.0535 5.6 1.6 30
NaHCO3 0.0589 5.1 2.2 100
CO2-enriched air 0.0949 3.2 1.7 180
3.2 氮源对葡萄藻生长的影响
在空气浴摇床上培养葡萄藻，以空气中的 CO2为碳源，80 mg/L的 K2HPO4为磷源，以 KNO3
作为唯一氮源，考察不同浓度的 KNO3对葡萄藻生长的影响，结果如图 3所示. 由图可看出，葡萄
藻能利用硝酸盐状态的氮源. 培养液中 KNO3浓度为 0时，葡萄藻几乎无生长；随着 KNO3浓度提
高，氮的同化作用增强，生长速率逐渐增大. 当 KNO3浓度大于 200 mg/L时，继续增加 KNO3的
浓度，生长速率增大已不太明显，但可延长葡萄藻的对数生长期，导致最后生物量的增加，因此
在对数生长期的后期添加适量氮源对获得较高的生物量是有利的.
3.3 磷源对葡萄藻生长的影响
磷是藻类生长的一个重要限制因子. 不同的藻类对磷的浓度有不同的要求. 本实验以 400
mg/L KNO3为氮源，以空气中的 CO2为碳源，在空气浴摇床上培养葡萄藻，考察不同浓度的K2HPO4
对葡萄藻生长的影响，结果见图 4. 从图可看出，增加 K2HPO4的浓度，葡萄藻的生长明显加快，
说明 K2HPO4是影响葡萄藻生长的显著因子. 从图中还可看出，当初始培养基中不加 K2HPO4时，
葡萄藻也能缓慢生长，这是因为藻种将细胞内储存的磷释放供生长需要，葡萄藻这一现象符合藻
类利用磷源的特点，即大多数藻能主动吸收磷，当环境磷充足时，细胞将吸收的多于生理需要的
图 3 不同起始 KNO3浓度对葡萄藻生长的影响 图 4 不同起始 K2HPO4浓度对葡萄藻生长的影响
Fig.3 Effects of different initial KNO3 concentrations Fig.4 Effects of different initial K2HPO4 concentrations
on the growth of Botryococcus braunii on the growth of Botryococcus braunii
0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Initial KNO
3
conc. (mg/L)
0
200
400
800
O
D
68
0
Time (d)

0 10 20 30 40 50 60
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Initial K2HPO4 conc. (mg/L)
0
80
120
160
O
D
68
0
Time (d)
144 过 程 工 程 学 报 3卷
磷储存在细胞内；环境缺磷时，又可利用这些储存磷进行代谢[10].
3.4 NaF对葡萄藻生长影响
许常虹等[11]对易发生葡萄藻水华的湖泊进行水体分析，发现易发生葡萄藻水华的湖泊的 N, P,
金属离子和有机物含量与一般湖泊无必然不同，但 NaF 的含量大大高于一般淡水湖. 实验室培养
葡萄藻，加入 0.1 mg/L NaF对藻细胞生长有促进作用，超过 0.25 mg/L则有抑制. 而王修垣等[12]
报道 NaF的适宜浓度为 0.1~1.0 mg/L. 本实验进一步确证了 NaF的最适浓度，并对 NaF的作用机
理作了初步的探索. 图 5表明，以 400 mg/L KNO3为氮源，以空气中的 CO2为碳源，80 mg/L的
K2HPO4为磷源的条件下，较低浓度的 NaF对葡萄藻生长有明显的促进作用，当 NaF浓度在 0.84
mg/L时作用最为显著，较高浓度则产生抑制作用. 用 NaCl代替 NaF，未发现有类似促进生长作用，
说明 NaF对葡萄藻的作用不是由于盐度增加改变细胞渗透压引起的.
对对数生长期藻细胞叶绿素含量和光合放氧进行分析，发现 NaF能使叶绿素含量提高近 1倍，
光合放氧曲线见图 6. 图 6表明，NaF的加入使最大光合放氧速率提高近 1倍，呼吸耗氧速率增大
了 1.5倍，NaF能同时促进葡萄藻的光合作用和呼吸作用，增快同化和异化过程，从而加速生长.
4 结 论
(1) 以 CO2和 NaHCO3补碳均能提高葡萄藻的光合作用效率，从而提高生长速率，缩短代时，
增大培养密度，其中以 CO2补碳影响最为显著.
(2) 葡萄藻能利用硝酸盐作为氮源，在一定范围内，随着氮源浓度的提高，生长速率增大，对
数生长期延长，从而藻密度增大.
(3) 磷源是葡萄藻生长的重要限制因子，适当提高磷源的浓度能大大加快葡萄藻的生长.
(4) 适量 NaF对葡萄藻生长有促进作用，能提高细胞叶绿素含量，增强光合作用和呼吸作用.
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0 10 20 30 40 50
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
NaF conc. (mg/L)
0
0.084
0.252
0.84
8.4
O
D
68
0
Time (d)
图 5 NaF对葡萄藻生长的影响 图 6 NaF对葡萄藻光合作用和呼吸作用的影响
Fig.5 Effect of NaF on the growth of Fig.6 Effect of NaF on photosynthesis and respiration
Botryococcus braunii activities of Botryococcus braunii
0 100 200 300 400 500
-60
-40
-20
0
20
40
60
Respiration activity
Net photosynthesis activity
NaF conc. (mg/L)
0 0.84
0 0.84
O
2
ev
ol
ut
io
n
ra
te
[m
m
ol
/(
m
g
·
h)
]
Lidht intensity [mmol/(m
2·s)]

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Effect of Nutrient Conditions on the Growth of Botryococcus braunii
WANG Jun, YANG Su-ling, CONG Wei, CAI Zhao-ling
(State Key Lab. Biochem. Eng., Inst. Proc. Eng., Chinese Academy of Sciences, Beijing 100080, China)
Abstract: The effect of nutrient conditions, including incarbon sources, nitrate and phosphate, on the growth of
hydrocarbon-rich microalga Botryococcus braunii was investigated in shake flask culture. The complement of
NaHCO3 and CO2 made growth rate of Botryococcus braunii increase from 0.0535 d
-1 to 0.0589 d-1, 0.0949 d-1
respectively, generation time reduced from 5.6 d to 5.1 d, 3.2 d respectively, maximum oxygen evolution rate
improved 2.3 and 5 times respectively by comparison with control cultures. The growth rate of Botryococcus braunii
went up and the exponential phase lengthened with the increase of the initial concentration of KNO3 within some
scope. K2HPO4 in the range of 0~160 mg/L could improve the growth rate of Botryococcus braunii significantly. In
addition, the role of NaF was examined. NaF promoted the photosynthesis and respiration activity. Its suitable
concentration was 0.84 mg/L.
Key words: Botryococcus braunii; growth; incarbon sources; nitrate; phosphate; NaF