全 文 ：冲ó,
第 29 卷 第 4 期
1 990 年 12月
复 旦 学 报 (自然科学版 )
J o u r n a l o f F u da n U n ive 邓 iyt (aN 七aur l s
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地中海伞藻 ( cA e abt u 忑a r记 m e d计e r r an e a )叶绿体 D N A 串联重复顺序的
克隆和限制性内切酶图谱分析
柴 建 华
(遗传学研究所 )
提 要
以 CO S 质粒 ( co s m id ) p CO S ZE M B L 为载体 , 构建了地中海伞藻叶绿体
墓因组分子克隆库 , 并且筛选到含有串联重复顺序的克隆 . 经 限制性内切醉醉
解图谱分析 , 证明了串联重复顺序的存在 , 重复次数为 4 次以上 .
关键词 : 伞藻 , 叶绿体 ; CO S 质粒分子 , 串联重复顺序 , 限制性内切酶 图谱 .
今诊
0 引 言
扩ó.
赞祠
高等植物叶绿体基因组是一种闭合的环 形 D N A 分子 , 其 大 小 一 般 在 12 0~ 2 10
kb
〔 `一 7 〕 . 除某些豆科植物如豌豆 ( p `邪、 s时`哪饥 ) 〔们和蚕豆 ( V 众坛 f 。乙。 )等为单拷贝D N A
顺序外 〔 ’ 〕其余均含有两个拷贝的反向重复顺序 .
地中海伞藻 ( cA o t动以。 施 , 。面 t。二。 ae )叶绿体具有一个特别巨大的基因组 . W。 。小
e o e k 等〔 1 0〕曾用电镜测得其 D N A 长度为 2 0 0~ 4 0 0卜m ( 6 0 0~ 1 Z o ok b ) . T y nz m。 等 〔 i ` 1
根据叶绿体 D N A 的限制性内切酶酶解图谱 , 推测有串联重复的 D N A 顺序存在 .
为了进一步搞清地中海伞藻叶绿体基因组构造的特点 , 并确证串联重复顺序的存在 ,
我们以 p C O S Z E M B L 为载体 , 构建了地 中海伞藻叶绿体 D N A 的分子克隆库 . 用我们建
立的快速精细限制酶图谱分析方法〔 , , 1 ,对分离到的几个含有串联重复顺序的克隆进行分
析 , 证实了串联重复顺序的存在 .
1 材料和方法
1
.
1 叶绿体的制备和纯化
地中海伞藻在 M讥 ler ,s 培养液 al[ 〕中培养 . 在成熟前 , 即第二次二倍体小核形成之
收稿 日期 : 19 0 年 5 月 4 日 .
衡
坛
DOI : 10. 15943 /j . cnki . f dxb -jns . 1990. 04. 005

皿O 友 旦 学 报 ( 自然 科 学 版 ) 第四 卷
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图 1 载体 C O S 质粒分子的限制酶图谱
卡邻舞素的培养基上 ,在 37 oC 培养过夜后 , 可得到约 10 . 个独立克隆 . 随机挑取 1 0 0 个
菌落 , 分别在含有卡那霉素和四环素的两种培养基上进行检验 , 对卡那霉素显示抗性而
对四环素敏感的即为重组克隆 .
1
.
6 D N A 片段的纯化
作为探针的 D N A 片段 , 经琼脂糖电泳分离后 ,在 D N A 带的前沿切 口 , 回收泳出的
D N A 缓冲液 , 经 N A C S ( B R L )小柱纯化后进行同位素标记 .
1
. 了 C O S 质粒克隆的筛选
随机挑取 3 0 个 C O S 质粒克隆 ,分别点种在 L耳卡那霉素琼脂培养 皿 上 . 子 37 ℃
培养过夜后 ,把菌落转移至硝酸纤维素撼膜上 . 参照 H a an b a n 的方法〔17 , 以经纯化和同
位素标记的 10 k b D N A 片段为探针 , 作菌落杂交筛选 .
1
.
8 C O S 质粒克隆 D N A 的限制性内切酶酶切图谱分析
参阅文献〔1 2〕的方法 .
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了
2 结果与讨论
在叶绿体 D N A 酶解后的琼脂糖电泳结果中 , 发现 10 k b 处有一条增强带 ,估计这是
重复顺序 . 我们把该 D N A片段分离纯化后作为探针 , 从 C O S 质粒分子克隆库中选到 8个
克隆 .对这些克隆作了精细的限制酶图谱分析后 (图 2 ) , 发现确实有串联重复顺序存在 , 每
个重复顺序约为 10 k b . 由于 C O S 质粒克隆容量有限 ,所以对串联重复顺序内重复单位
的重复次数还无法测知 , 从图 a2 中只能看到 4 次 , 其确切次数尚待进一步研究 . 我们 还
发现了该串联重复顺序一端的边界位于 36 k b 处 (图 Zb ) , 从图 2 可看出每个重复单位结
构都是相同的 , 并且已经证明这种串联重复顺序并非为 Y D N .A
地中海伞藻的叶绿体基因组是已知植物叶绿体中最大的基因组 , 其大小可能不小于 如
1
第 4 期 ’ 柴建华 :地中海伞燕叶绿体 D N A 串联重复顺序的克隆和限制性内切酶图谱分析 31 9
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图 2 C 0 8 质粒克隆的精细限制酶图谱
- ~ 硕〕0 5 质粒载体 D N 人 ,
-
c t D N A 串联重复顺序 ,二二二串联重复单位的外侧顺序
T 为 H aej 1 1 , N 为 N r u l , E 为 E e o R I , P 为 P , t l , B 为 B g l l
80 0 k b
,而其他植物的只有 1 0 一 2 0 k b . 多数植物叶绿体 D N A 中均有两个拷贝反向!
复顺序 , 我们除证实了伞藻叶绿体有串联重复顺序存在外 , 还发现了有多拷贝重复顺序存
在 (另文发表 ) , 这或许就是地中海伞藻叶绿体基因组特别大的原 因之一 这种串联重复
D N A 顺序的生物学功能尚待进一步研究 .
甘
参 考 文 献
〔 1 j P a lm e r J D , e t a l . eR a r r a n卯 m e n t s i n t玩 C hl o r o P l a 的 G e n o m e s o f M u u g 卫她a n a n d P ae .
P r o c 肠 t l A e a d 习e￡ U S A , 19 81 , 78 ( 17 ) : 5 53 3~ 55 37 ·
[ 2二 凡 r a i A , e t a l . R i e e C h l o r o p l a s t D N A : A P hy s i ea l M a p a n d t he L o e a t i o n o f t玩 G e n e s f o r
the S ub u n i t o f R i b u l o s e l卢一 b i s p h o s p ha t e C a br o x y l台。 e a n d t h e 32 k D p h o t o s y s t em I I R份 e -
t i o n C e n t e r P r o t e i , 1
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〔 3 ] B o w am n C M , e t a l . A p hy o i e a l M a p o f W he a t Ch l o r o p la s t D N A Sh o w i n g t h e L o e a t i o ; 、 o f
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〔 在〕 B r ea r s T , 眺 al . C hl o r o p l a 的 G e n o m e o r ga 址az t i o n i n S u笋 r E地e t a n d M a i z e . p a` , t M o抽
B￡0 1, 1 9 8 6 , 6 ( 2 ) : 17 1~ 17 7
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[ 6 二 S p i e lm a n n A , e t a l . T he S o y b ae n C hl o r o p l a st G e n o m e : C o u s t r u e t i o n o f a C i r o lu a r 凡 st r i e ·
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即 b u lu t o f t he R i b lu o s e l声七 i s p h o o p ha t e C a br ox y l a * a n d t he 3 2 k D p r o t e i n o f t he p ho t o -
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D N A U s i n g L o w G e l l i n g T em p
e r a t u er A ga r o se E l e e t r o p h o er s i s
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G e ” e , 1 98 0 , 8 ( 2 ) : 1 79~ 1 91
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[ 7 〕 P a il n e r J D · E v o l u t i o n o f C h l o r o p l a st a dn M i t o o h o n妞 a l D N A i n p l a n t s a n d A l ga ( , . I n :
加该。 In t y加 R J . ( ed ) M o n o g r a p比 i n E v o l ut i o n a r y iB o l o盯 : M o l e 。过 ar E v o l iut o n a灯 G皿 e t i佣 ·
N扮. Y o r k : p l加一皿 p ub li s h i n g C o r P o r a t i o n 一 198 4 · 13 1~ 2 4 0 ·
[ s 〕 K目创L ” r R , eT , . ir K K · I u v e r以 eR Pae 切 远 C坦 o r o p l毗 D N A F r o . H i g助 r p l a n认
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